中药蟾酥提取物及其制备方法

摘要

本发明涉及中药蟾酥提取物，该提取物采用下述方法提取获得：在60～90℃的温度下将中药蟾酥药材用体积百分比为60～95％的乙醇水溶液回流提取，将提取液浓缩后经硅胶柱分离，用体积比1～8∶1的石油醚与丙酮为洗脱剂进行等度洗脱，收集部分洗脱液，经过滤、浓缩、减压干燥得到含酯蟾毒配基、华蟾酥毒基及蟾毒灵三种蟾毒配基混合物且三种蟾毒配基的重量百分比(按干燥品计算)之和≥95％的中药蟾酥提取物。本发明还提供上述中药蟾酥提取物的制备方法。采用该方法得到的中药蟾酥提取物中三种蟾毒配基的重量百分比之和在95％以上，提取转移率更高，使用溶剂量更少，残留溶剂少，污染程度更低，操作简便，易于工业化生产。

权利要求

1.中药蟾酥提取物的制备方法，包括以下步骤：

（1）预先将中药蟾酥药材粉碎、研磨成蟾酥粉，所述蟾酥粉过15～25目筛后使用；在

60～90℃的温度下，将蟾酥粉用体积百分比为75%～95%的乙醇水溶液作为提取溶剂回流提取，每次提取时蟾酥粉与提取溶剂的比例为1g：5～15mL，提取时间为30～90分钟，提取次数为2～4次；

（2）将步骤（1）所得提取液浓缩后经硅胶柱分离，用体积比1～8:1的石油醚和丙酮为洗脱剂进行等度洗脱，收集洗脱液，过滤，减压条件下蒸干，即得含酯蟾毒配基、华蟾酥毒基及蟾毒灵三种蟾毒配基的混合物；

（3）将所得混合物在30～50℃的条件下减压干燥12～96小时，即得含三种蟾毒配基混合物的中药蟾酥提取物，中药蟾酥提取物中残留的石油醚、丙酮的含量均低于0.2%。

2.根据权利要求1所述的中药蟾酥提取物的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，提取时间为40～80分钟，提取次数为2～3次。

3.根据权利要求1所述的中药蟾酥提取物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，向浓缩后的提取液中加入拌样用硅胶，蒸干得拌样硅胶，所得拌样硅胶采用干法上样，所述拌样用硅胶的重量为中药蟾酥药材重量的0.5～2.0倍，且所述拌样用硅胶的粒度为100～200目。

4.根据权利要求3所述的中药蟾酥提取物的制备方法，其特征在于，所述拌样用硅胶的重量为中药蟾酥药材重量的0.6～1.8倍，且所述拌样用硅胶的粒度为100～160目。

5.根据权利要求3所述的中药蟾酥提取物的制备方法，其特征在于，所得拌样硅胶采用干法上样前，预先将分离硅胶用2～3倍分离硅胶体积的洗脱剂浸泡1小时后湿法装柱，所述分离硅胶的粒度为100～300目。

6.根据权利要求1到5任一所述的中药蟾酥提取物的制备方法，其特征在于，所述洗脱剂中石油醚和丙酮的体积比为2～4:1。

7.根据权利要求1到5任一所述的中药蟾酥提取物的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，将所述混合物在35～45℃条件下减压干燥48～60小时，即得含三种蟾毒配基混合物的中药蟾酥提取物。

说明书

中药蟾酥提取物及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于中药提取技术领域，具体涉及一种中药蟾酥提取物及其制备方法。

背景技术

[0002] 药用蟾蜍为两栖纲蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufo bufogaraarizans Cantor)或黑框蟾蜍(Bufo meLanostictus Schneider)。蟾酥为中华大蟾蜍或黑框蟾蜍的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液，经加工干燥制成。中药蟾酥的应用有几千年的历史，《本草汇言》中对蟾酥的描述为：蟾酥，通行十二经络、藏府、膜原、溪谷、关节诸处。蟾酥，疗疳积，消臌胀，解疔毒之药也。能化解一切瘀郁壅滞诸疾，如积毒、积块、积胀、内疔痈肿之证，有攻毒拔毒之功也。《本草求真》中描述为：蟾酥，味辛气温有毒，能拔一切风火热毒之邪，使之外出。盖邪气着人肌肉，郁而不解，则或见为疔肿发背、阴疮、阴蚀、疽疠恶疮，故必用此辛温以治，盖辛主散，温主行，使邪尽从汗出，不留内入，而热自可以除矣。性有毒，止可外治取效；即或用丸剂，亦止二、三、四厘而已，多则能使毒人。其用作丸投服，亦宜杂他药内，勿单服也。目前，中药蟾酥仍广泛应用于多个中成药中，作为主要的功效成分，如：六神丸、牛黄消炎丸等。

[0003] 蟾酥中的活性物质主要为酯蟾毒配基、华蟾酥毒基及蟾毒灵等多种脂溶性强心甾类化合物，在化学上属于甾族化合物，而其C17上再接一个α-吡喃酮基，凡具有此种骨架的物质，总名蟾蜍二烯内酯。《中国药典》2010年版一部中蟾酥的质量标准中也以华蟾酥毒基及酯蟾毒配基的含量作为中药蟾酥的含量测定指标。现代对于中药蟾酥的药理作用的研究，热点主要集中在于其抗肿瘤、镇痛和强心作用的分子药理学机制方面。目前的主要研究结果表明，华蟾酥毒基、酯蟾毒配基及蟾毒灵三种脂溶性成分的混合物不但具有明显的抗肿瘤作用，而且还能将肿瘤细胞转化为正常细胞、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞新生血管形成等作用。

[0004] 中国专利申请“一种蟾酥提取物及其制备方法”(申请号为200710041880.7，公开号为CN101322723A，公告日为2008年12月17日)使用无水乙醇提取，提取物经硅胶柱分离，以一定比例的石油醚、丙酮等度洗脱的方法得到酯蟾毒配基、华蟾酥毒基及蟾毒灵三种脂溶性成分的混合物，其总量高于90％，但该方法采用提取溶剂为无水乙醇，其提取效率较低，分离所用的石油醚、丙酮的用量较大，对环境污染和破坏的程度也较大；等度洗脱的方法、洗脱剂的用量等都未作进一步考察，且转移率也未进行公开；更为重要的是，该方法对中药蟾酥提取物的干燥温度以及时间未作规定，因在分离、纯化过程中使用了有机溶剂，可能导致蟾酥提取物中残留有大量的石油醚、丙酮等毒性有机溶剂，导致含量偏低且毒性大大增加。因此，从安全性和有效的角度考虑，三种蟾毒配基的总含量有待进一步提高，且对丙酮、石油醚等有机溶剂残留量没有进行检查、测定。

发明内容

[0005] 针对现有技术中存在的缺陷，本发明的一个目的是提供含酯蟾毒配基、华蟾酥毒基及蟾毒灵三种蟾毒配基混合物且三种蟾毒配基的重量百分比(按干燥品计算)之和为95％以上的中药蟾酥提取物。

[0006] 本发明的另一个目的是提供上述中药蟾酥提取物的制备方法，采用该方法得到的中药蟾酥提取物中酯蟾毒配基、华蟾酥毒基及蟾毒灵三种蟾毒配基混合物的重量百分比(按干燥品计算)为95％以上，提取效率更高，纯化纯度也显著增加，提取物更加安全可靠，并且采用该方法，使用溶剂量更少，对环境的污染程度更低，操作简便，易于工业化生产。

[0007] 为达到以上目的，本发明采用的技术方案是：中药蟾酥提取物，其特征在于，该提取物采用下述方法提取获得：在60～90℃的温度下将中药蟾酥药材用体积百分比为60％～95％的乙醇水溶液回流提取，将提取液浓缩后经硅胶柱分离，用体积比1～8∶1的石油醚与丙酮为洗脱剂进行等度洗脱，收集洗脱液，经过滤、浓缩、减压干燥得到含有酯蟾毒配基、华蟾酥毒基及蟾毒灵三种蟾毒配基混合物且三种蟾毒配的重量百分比之和≥95％的中药蟾酥提取物，所述的重量百分比按干燥品计算。

[0008] 进一步，酯蟾毒配基、华蟾酥毒基及蟾毒灵三种蟾毒配基混合物占中药蟾酥提取物的重量百分比为96～100％。

[0009] 本发明提供的上述中药蟾酥提取物的制备方法，包括以下步骤：

[0010] (1)在60～90℃的温度下，将中药蟾酥药材用体积百分比为60％～95％的乙醇水溶液作为提取溶剂回流提取，每次提取时中药蟾酥药材与提取溶剂的比例为1g∶5～25mL，提取时间为30～90分钟，提取次数为2～4次；

[0011] (2)将步骤(1)所得提取液浓缩后经硅胶柱分离，用体积比1～8∶1的石油醚和丙酮为洗脱剂进行等度洗脱，收集洗脱液，过滤，减压条件下蒸干，即得含酯蟾毒配基、华蟾酥毒基及蟾毒灵三种蟾毒配基的混合物；

[0012] (3)将所得混合物在30～50℃的条件下减压干燥36～72小时，即得含三种蟾毒配基混合物的中药蟾酥提取物。

[0013] 进一步，为提高提取率及节约提取溶剂，步骤(1)中，预先将所述中药蟾酥药材粉碎、研磨成蟾酥粉，并过10～60目筛后使用；所述提取溶剂为体积百分比为75％～90％的乙醇水溶液，每次提取时中药蟾酥药材与乙醇水溶液的比例为1g∶8～15ml，提取时间为40～80分钟，提取次数为2～3次。

[0014] 优选地，所述蟾酥粉过15～25目筛后使用。

[0015] 进一步，为增大上样量，步骤(2)中，向浓缩后的提取液中加入拌样用硅胶，蒸干得拌样硅胶，所得拌样硅胶采用干法上样。其中，加入的所述拌样用硅胶的量以能完全吸附蟾酥提取物浓缩液为宜。优选地，所述拌样用硅胶的重量为中药蟾酥药材重量的0.5～2.0倍，且所述拌样用硅胶的粒度为100～200目。

[0016] 再进一步，所述拌样用硅胶的重量为中药蟾酥药材重量的0.6～1.8倍，且所述拌样用硅胶的粒度为100～160目。

[0017] 进一步，所得拌样硅胶采用干法上样前，预先将分离硅胶用2～3倍分离硅胶体积的洗脱剂浸泡1小时后湿法装柱，所述分离硅胶的粒度为100～300目。

[0018] 进一步，所述洗脱剂中石油醚和丙酮的体积比为2～4∶1。

[0019] 进一步，为降低中药蟾酥提取物中有机溶剂石油醚、丙酮的残留量，步骤(3)中，将所述混合物在35～45℃条件下减压干燥48～60小时，即得含三种蟾毒配基混合物的中药蟾酥提取物。

[0020] 本发明与现有技术相比，其优点在于：

[0021] 第一、本发明采用体积百分比为60～95％的乙醇水溶液作为提取溶剂，较《中国药典》2010年版的提取方法提取效率更高，上述三种蟾毒配基混合物的提取率为92％以上，三种成分总的转移率大于65％；且采用乙醇水溶液比无水乙醇更加环保、安全。

[0022] 第二，相对于现有技术中采用60目筛的蟾酥粉以无水乙醇提取的方式，本发明采用15～25目筛的蟾酥粉以60～95％的乙醇水溶液回流提取的方式，三种蟾毒配基混合物的转移率优于现有技术的转移率；更重要的是，采用本发明的方法放大生产时，工人的劳动强度以及工作环境的粉尘污染程度将大大降低。

[0023] 第三，本发明采用拌样硅胶干法上样、等度洗脱，简化了纯化方法，进一步提高了三种蟾毒配基的总含量，保证其总含量高于95％水平(通常在95～100％范围)，纯化效率高，纯化纯度也显著增加，减小了药物的毒副作用。

[0024] 第四，按照本发明的方法制得的中药蟾酥提取物中，残留溶剂、重金属、砷盐等项目符合《中国药典》2010年版一部附录相关要求，干燥失重小于5.0％。这充分体现了本发明的中药蟾酥提取物的安全性、有效性。

[0025] 第五，本发明提供的中药蟾酥提取物的制备方法及所用设备简单，使用溶剂量更少，对环境的污染程度更低，耗时较短，易于工业化生产。

附图说明

[0026] 图1为本发明实施例3中药蟾酥经乙醇水溶液提取后得到的HPLC色谱图，图中色谱峰1表示蟾毒灵(BL)，色谱峰2表示华蟾酥毒基(CBG)，色谱峰3表示酯蟾毒配基(RBG)；

[0027] 图2为本发明实施例3中药蟾酥经提取、纯化后得到的HPLC色谱图，图中色谱峰1表示蟾毒灵(BL)，色谱峰2表示华蟾酥毒基(CBG)，色谱峰3表示酯蟾毒配基(RBG)；

[0028] 图3为本发明实施例3中的中药蟾酥药材使用体积百分比为90％乙醇水溶液提取3次三种成分转移率柱状图；

[0029] 图4为本发明实施例3中等度洗脱三种蟾毒配基的洗脱曲线，图中曲线A表示酯蟾毒配基(RBG)，曲线B表示华蟾酥毒基(CBG)，曲线C表示蟾毒灵(BL)。

具体实施方式

[0030] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步描述。

[0031] 本发明实施例中所述用的蟾酥药材购自北京闫村蟾蜍养殖基地、安徽广印堂中药饮片厂或山东平安达中药饮片厂。

[0032] 硅胶为青岛海洋化工厂生产的柱层析用硅胶，拌样用硅胶粒度为100～160目，分离硅胶粒度为100～300目；分离柱I直径为2厘米、柱高为20厘米，分离柱II直径为5厘米、柱高为60厘米。

[0033] 实施例1

[0034] 取蟾酥药材1克，研细过30目筛，加15mL体积百分比为75％的乙醇水溶液，在80℃条件下回流提取60分钟，上述条件下提取2次，合并滤液，将提取液趁热过滤，旋蒸浓缩后加入1.2克拌样用硅胶拌样，得拌样硅胶。采用分离柱I，取12克分离硅胶，以石油醚和丙酮(体积比为3∶1)为洗脱剂，先用40mL的洗脱剂浸泡该分离硅胶1小时后湿法装柱，加入所制得的拌样硅胶，再用洗脱剂等度洗脱60分钟。通过薄层色谱法进行监测，收集含有这三种蟾毒配基的洗脱液，蒸干，在35℃条件下减压干燥12小时，即得本发明中药蟾酥提取物。其中，三种蟾毒配基混合物占整个提取物的重量百分比(按干燥品计算)为
97.42％(HPLC方法测定)。

[0035] 实施例2

[0036] 取蟾酥药材10g，研细过60目筛，加入100mL体积百分比为85％的乙醇水溶液，在80℃条件下回流提取45分钟，上述条件下提取3次，合并滤液，将提取液趁热过滤，旋蒸浓缩后加入13.0克拌样用硅胶拌样，得拌样硅胶。采用分离柱I，取150克分离硅胶，以石油醚和丙酮(体积比为4∶1)为洗脱剂，先用300mL的洗脱剂浸泡该分离硅胶1小时后湿法装柱，加入所制得的拌样硅胶，再用洗脱剂等度洗脱。通过HPLC监测，收集含有这三种蟾毒配基的洗脱液，蒸干，在45℃条件下减压干燥60小时，即得本发明中药蟾酥提取物。其中，三种蟾毒配基混合物占整个提取物的重量百分比(按干燥品计算)为98.92％(HPLC方法测定)。

[0037] 实施例3

[0038] 取蟾酥药材5g，研细过20目筛，加入60mL体积百分比为90％的乙醇水溶液在90℃条件下回流提取30分钟，提取3次，合并滤液，趁热过滤提取液，旋蒸浓缩后加入5.0克拌样用硅胶拌样，得拌样硅胶。采用分离柱I，取50克分离硅胶，以石油醚和丙酮(体积比为3∶1)为洗脱剂，先用130mL的洗脱剂浸泡该分离硅胶1小时后湿法装柱，加入所制得的拌样硅胶，再用洗脱剂等度洗脱。通过HPLC监测，收集含有这三种蟾毒配基的洗脱液，蒸干，在40℃条件下减压干燥60小时，即得本发明中药蟾酥提取物。其中，三种蟾毒配基混合物占整个提取物的重量百分比(按干燥品计算)为97.73％(HPLC方法测定)。

[0039] 实施例4

[0040] 取蟾酥药材150g，研细过30目筛，加入1600mL体积百分比为90％的乙醇水溶液在80℃条件下回流提取45分钟，提取3次，合并滤液，趁热过滤，旋蒸浓缩后加入125g硅胶拌样，得拌样硅胶。采用分离柱II，取300克分离硅胶，以石油醚和丙酮(体积比为4∶1)为洗脱剂，先用800mL的洗脱剂浸泡该分离硅胶1小时后湿法装柱，加入所制得的拌样硅胶，再用洗脱剂等度洗脱。通过HPLC监测，收集含有这三种蟾毒配基的洗脱液，蒸干，在40℃条件下减压干燥96小时，即得本发明中药蟾酥提取物。其中，三种蟾毒配基混合物占整个提取物的重量百分比(按干燥品计算)为96.22％(HPLC方法测定)。

[0041] 实施例5

[0042] 取蟾酥药材15g，研细过40目筛，加入75mL体积百分比为65％的乙醇水溶液在80℃条件下回流提取30分钟，提取3次，合并滤液，趁热过滤，旋蒸浓缩后加入7.5g拌样用硅胶拌样，得拌样硅胶。采用分离柱I，取150克分离硅胶，以石油醚和丙酮(体积比为
1∶1)为洗脱剂，先用400mL的洗脱剂浸泡该分离硅胶1小时后湿法装柱，加入所制得的拌样硅胶，再用洗脱剂等度洗脱。通过HPLC监测，收集含有这三种蟾毒配基的洗脱液，蒸干，在30℃条件下减压干燥36小时，即得本发明中药蟾酥提取物。其中，三种蟾毒配基混合物占整个提取物的重量百分比(按干燥品计算)为96.1％(HPLC方法测定)。

[0043] 实施例6

[0044] 取蟾酥药材100g，研细过15目筛，加入2500mL体积百分比为70％的乙醇水溶液在70℃条件下回流提取90分钟，提取3次，合并滤液，趁热过滤，旋蒸浓缩后加入200.0g拌样用硅胶拌样，得拌样硅胶。采用分离柱I，取250克分离硅胶，以石油醚和丙酮(体积比为8∶1)为洗脱剂，先用600mL的洗脱剂浸泡该分离硅胶1小时后湿法装柱，加入所制得的拌样硅胶，再用洗脱剂等度洗脱。通过HPLC监测，收集含有这三种蟾毒配基的洗脱液，蒸干，在50℃条件下减压干燥72小时，即得本发明中药蟾酥提取物。其中，三种蟾毒配基混合物占整个提取物的重量百分比(按干燥品计算)为98.7％(HPLC方法测定)。

[0045] 从实施例1～6的测定结果可以看出，采用本发明的方法，三种蟾毒配基混合物占整个提取物的重量百分比(按干燥品计算)均在95％以上。

[0046] 从图3上可以看出，采用本发明的方法，对中药蟾酥药材以体积百分比为90％的乙醇水溶液提取3次后(见实施例3)，三种蟾毒配基的总提取率达95.4％；经硅胶柱分离后，三种蟾毒配基的总转移率大于65％，提取效率非常显著。

[0047] 从图4上看，三种蟾毒配基类成分在洗脱剂的洗脱下，酯蟾毒配基、蟾毒灵以及华蟾酥毒基被洗脱下来，收集3～8倍柱体积洗脱液可得到纯度较高的三种成分的洗脱液。

[0048] 以下将本发明的方法与现有方法(中国专利申请“一种蟾酥提取物及其制备方法”(申请号为200710041880.7，公开号为CN101322723A，公告日为2008年12月17日))进行对比，结果如下：

[0049] 1)本发明提供的中药蟾酥提取方法，三种蟾毒配基的提取率较现有方法更高。现有方法采用无水乙醇为提取溶剂，其提取率不足85％，而本发明的提取率为95％以上。

[0050] 2)本发明提供的中药蟾酥提取方法，三种蟾毒配基的转移率较现有方法更高。现有方法中，三种蟾毒配基的总转移率均在50％以下，本发明的总转移率达到65％以上，且产品的纯度也进一步提高。

[0051] 3)采用现有方法所得到的中药蟾酥提取物中，残留溶剂石油醚、丙酮的含量高达到2～5％，两种残留溶剂的含量均超过《中国药典》2010年版规定0.5％的限度要求的5～10倍，这大大降低了产品的安全性；本发明经过减压干燥使提取物中残留的石油醚、丙酮的含量均低于《中国药典》2010年版的限度0.5％的要求(测定结果均低于0.2％)，保证了产品的安全、有效。经过方法学考察，所使用的残留溶剂测定方法可以满足蟾酥提取物的残留溶剂测定要求。

[0052] 4)采用现有方法对150g蟾酥药材进行分离，洗脱剂(石油醚、丙酮)的用量共计为16～20L；本发明分离提取相同重量的蟾酥药材，其洗脱剂(石油醚、丙酮)的用量为8～10L，大大减少了有机溶剂的用量，同时也大为降低了对环境的污染。

[0053] 综上所述，与上述现有方法相比，本发明提供的方法具有提取效率更高、产品纯度更高、有机溶剂用量更少、残留有机溶剂更少等优点。

[0054] 上述实施例只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。