β-葡萄糖苷酶Mut1b及其表达基因与应用

摘要

本发明涉及β-葡萄糖苷酶Mut1b及其表达基因与应用，属于生物工程技术领域。本发明提供一种表达β-葡萄糖苷酶Mut1b的基因mut1b，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还提供一种β-葡萄糖苷酶Mut1b，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该β-葡萄糖苷酶高水解活性突变体Mut1b可以用于工业上构建高产纤维素酶菌株以及高活性纤维素酶系统，有效提高纤维素酶解的效率，进而有助于高效转化农业废弃物资源，具有重要的经济价值和社会效益。

权利要求

1.一种表达β-葡萄糖苷酶Mut1b的基因mut1b，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种β-葡萄糖苷酶Mut1b，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3、一种重组载体，是将SEQ ID NO.1所示核苷酸序列连接入载体中获得。

4、一种重组细胞，该细胞包含有权利要求3所述的重组载体或表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的β-葡萄糖苷酶Mut1b。

5、权利要求1所述基因mut1b、权利要求2所述β-葡萄糖苷酶Mut1b、权利要求3所述重组载体或权利要求4所述重组细胞在酶解纤维素中的应用。

说明书

β-葡萄糖苷酶Mut1b及其表达基因与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及β-葡萄糖苷酶Mut1b及其表达基因与应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

[0002] 纤维素作为高等植物细胞壁的主要成分，占植物干重的35％～50％，是由β-1，4-葡萄糖苷键连接葡萄糖残基组成的线形聚合物，不溶于水，但可以被纤维素酶降解。它是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物。对人类而言，它同时又是地球上最丰富的可再生资源。据统计，木质纤维素每年的总产量约占所有生物资源的50％，约合100～500亿吨。利用纤维素酶降解木质纤维素产生葡萄糖，进而发酵生产包括乙醇在内的生物基产品对社会经济发展具有重要的现实意义。由于纤维素酶降解天然纤维素底物的效率低，成本高，因此由纤维素转化为生物燃料的过程依然具有很大挑战性。

[0003] 在纤维素降解过程中，纤维素酶的水解效率是纤维素转化为葡萄糖的一个瓶颈。纤维素的酶解涉及到三类糖苷水解酶，分别是纤维二糖水解酶(即cellobiohydrolase，简称CBH)；内切葡聚糖酶(即endoglucanase，简称EG)和β-葡萄糖苷酶(即β-glucosidase)。内切葡聚糖酶负责随机切割纤维素的β-1，4糖苷键，产生大小不同的纤维素短链；纤维二糖水解酶负责攻击纤维素链的还原端或者非还原端释放纤维二糖，β-葡萄糖苷酶主要是将纤维二糖和纤维寡糖水解成葡萄糖，解除纤维二糖和纤维寡糖对内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的反馈抑制。β-葡萄糖苷酶是瑞氏木霉纤维素酶系的重要成员，而纤维素酶组分中该酶含量最少、活力普遍较低，因此成为纤维素酶解的瓶颈。在纤维素水解时，增加β-葡萄糖苷酶活性，会有效提高纤维素酶解的效率。

发明内容

[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供β-葡萄糖苷酶Mut1b及其表达基因与应用。

[0005] 一种表达β-葡萄糖苷酶Mut1b的基因mut1b，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0006] 上述β-葡萄糖苷酶Mut1b，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0007] 本发明所涉及的基因mut1b来自瑞氏木霉QM9414，在本发明的实施例1中提供了该基因Mut1b及β-葡萄糖苷酶Mut1b的制备方法。该方法是以瑞氏木霉QM9414的总RNA为模版，经反转录PCR方法得到cDNA，用特异性寡核苷酸引物通过PCR方法得到β-葡萄糖苷酶Cel1b的cDNA。该序列由1452个核苷酸组成，编码484个氨基酸。利用融合PCR方法，定点突变β-葡萄糖苷酶的cDNA，使其表达的第174位氨基酸的异亮氨酸I突变为半胱氨酸C，获得经过突变的基因mut1b。然后通过异源表达基因mut1b获得β-葡萄糖苷酶Mut1b。β-葡萄糖苷酶Mut1b的水解活性是野生型β-葡萄糖苷酶Cel1b的100倍左右，约为27.24U/mg。

[0008] 一种重组载体，该载体包含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的功能片断。

[0009] 一种重组细胞，该宿主菌包含有上述重组载体或表达上述β-葡萄糖苷酶Mut1b。

[0010] 上述基因mut1b，β-葡萄糖苷酶Mut1b、重组载体或重组细胞在酶解纤维素中的应用。

[0011] 有益效果

[0012] 本发明中的β-葡萄糖苷酶高水解活性突变体Mut1b可以用于工业上构建高产纤维素酶菌株以及高活性纤维素酶系统，有效提高纤维素酶解的效率，进而有助于高效转化农业废弃物资源，具有重要的经济价值和社会效益。

附图说明

[0013] 图1表达载体pET32a-mut1b的酶切后的电泳图；

[0014] 图2纯化后的β-葡萄糖苷酶Cel1b及β-葡萄糖苷酶Mut1b的电泳图；

[0015] 其中：WT为β-葡萄糖苷酶Cel1b；1为β-葡萄糖苷酶Mut1b；

具体实施方式

[0016] 下面结合说明书附图和实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域内的技术人员了解本发明，但本发明所保护范围不限于此。

[0017] 实施例中的瑞氏木霉购自美国典型微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为：ATCC NO.26921。

[0018] 实施例1β-葡萄糖苷酶Mut1b的基因分离、定点突变、异源表达和纯化[0019] (1)在瑞氏木霉MM培养基中接种瑞氏木霉(Trichoderma reesei)的孢子106个，30℃培养2～3天，收集菌丝，提取RNA，反转录得到cDNA；

[0020] 瑞氏木霉MM培养基组分：

[0021] 蛋白胨，2g；葡萄糖，20g；(NH4)2SO4，5g；K2HPO4，15g用1M NaOH调pH至5.5，定容值1L后，分装每瓶200ml，灭菌后每瓶加200×MgSO4(120g/l)1ml；200×CaCl2(120g/l)1ml；100×尿苷(1M)，2ml；1000×微量元素(FeSO4·7H2O，5g/l；MnSO4·H2O，1.6g/l；ZnSO4，1.4g/l；CoCl2，2g/l)，200μl。

[0022] RNA的提取采用Trizol法，Trizol试剂购自Invitrogen公司，步骤参见产品说明书。

[0023] 反转录采用购自Takara公司的RNAPCR Kit试剂盒，步骤参见产品说明书。

[0024] (2)以步骤(1)获得的cDNA为模板，以32a-cel1b F和I174C up R为引物，采用融合PCR的方法，得到点突变体的基因片段，引物序列如下：

[0025] 32a-cel1b F：CCGGAATTCCCCGAGTCGCTAGCTCTGCCC；SEQ ID NO.3

[0026] I174C up R：GTGGCATATCCATAGATGGCCTGGCACCAGGGTTCGTTGATGGTGATC；

[0027] SEQ ID NO.4

[0028] 反应体系(25μL)为：

[0029]

[0030]

[0031] 将反应组分混匀后离心，置于PCR仪中反应。反应程序为：94℃预变性5min；然后进行以下循环：94℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸1min，共进行30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经过纯化后，进行后续实验。

[0032] (3)以步骤(2)获得的点突变体的基因片段和32a-cel1b R为引物，以步骤(1)制得的cDNA为模版，通过融合PCR方法得到174位氨基酸I突变为C的完整基因，32a-cel1b R序列如下：

[0033] 32a-cel1b R：CCCAAGCTT TGCCGCCACT TTAACCCTCTGC；SEQ ID NO.5[0034] PCR扩增体系同步骤(2)。PCR产物经过纯化后，获得完整基因。

[0035] (4)用EcoRI和HindIII酶切步骤(3)制得的完整基因和载体pET-32a，然后将酶切后的完整基因连入pET32a，得突变体Mut1b表达质粒，利用pET-32a载体的测序通用引物，测序后，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；同时用EcoRI和HindIII酶切该表达质粒，结果表明目的基因mutce1b已经整合进pET-32a载体中，如图1所示。

[0036] (5)将Mut1b突变体表达质粒利用热激法转化大肠杆菌Origami B(DE3)，在LB培养基中培养到OD600大约为0.6时加入IPTG(终浓度为100μM)，20℃诱导过夜。11000rpm，离心2min，收集菌体后重悬于Lysis Buffer(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，1mM PMSF，pH8.0)；将上述菌体超声破碎，离心得到上清，对上清进行SDS-PAGE(以未诱导的菌体进行同样操作为对照)，发现上清中有明显的表达条带；该上清经过镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)纯化，得到I174C点突变体蛋白，即Mut1b蛋白，通过超滤离心更换缓冲液为pH7.0的50mM NaH2PO4缓冲液，分子量大约为68.31kD，电泳验证如图2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明涉及的Cel1b蛋白及其突变体(I174C)蛋白的最适反应pH都为6.0，最适反应温度都为30℃。

[0037] 对照例

[0038] 以实施例1步骤(1)制得的cDNA为模板，以32a-cel1b F和32a-cel1b R为引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，引物序列如下：

[0039] 32a-cel1b F：CCGGAATTCCCCGAGTCGCTAGCTCTGCCC；

[0040] 32a-cel1b R：CCCAAGCTT TGCCGCCACT TTAACCCTCTGC；

[0041] PCR扩增体系同实施例1步骤(2)。

[0042] 然后，用EcoRI和HindIII过夜酶切PCR产物和载体pET-32a，纯化后，通过连接转化产生表达载体；再通过实施例1步骤(5)的方法，获得纯化的野生型β-葡萄糖苷酶Cel1b，电泳验证如图2。

[0043] 实施例2β-葡萄糖苷酶Cel1b和突变后的β-葡萄糖苷酶Mut1b的性质研究[0044] (1)β-葡萄糖苷酶Cel1b和突变后的β-葡萄糖苷酶Mut1b的酶活测定[0045] 1)5mM p-nitrophenyl-6-D-glucopyranoside(pNPG)溶于50mM柠檬酸缓冲液(pH6.0)中；

[0046] 2)200μl反应液中含适当稀释酶液50μl，50mM HAc-NaAc缓冲液100μl，底物50μl，45℃，反应30min；

[0047] 3)加入10％Na2CO350μl终止反应，420nm测定对硝基酚生成量；

[0048] 4)以10μM对硝基酚加同样比例的10％Na2CO3做标准曲线以计算纤维二糖量和酶活力单位，每分钟每毫克蛋白转化1nmol的底物定义为一个酶活单位(1U)。

[0049] 结果见表1，发现其中的Mut1b的比酶活增加为野生型的143倍。

[0050] 表1

[0051]

[0052] (2)动力学参数分析

[0053] 为比较β-葡萄糖苷酶Cel1b和β-葡萄糖苷酶Mut1b水解活性的动力学参数的差异，选择不同的底物(pNPG)浓度0.1mM～24mM测定酶活，酶活测定方法同实施例2步骤(1)，反应温度为30℃，时间5min。测定结果用Michaelis-Menten公式非线性回归的方法Origin6.0作图，分别求出Km，Vmax，kcat和kcat/Km等动力学参数。每分钟每毫克蛋白转化1nmol的底物定义为一个酶活单位(1U)。通过动力学参数(Km，Kcat，Kcat/Km)的测定发现，β-葡萄糖苷酶Mut1b的Km基本没有变化，Kcat值却提高了60倍，这表明该突变体的比酶活的提高主要是由催化效率的提高导致，结果见表2。

[0054] 表2

[0055]