一种树上干杏的多倍体诱导方法

摘要

本发明涉及一种树上干杏的多倍体诱导方法，是针对新疆树上干杏这一独特品种进行组织培养及四倍体诱导的方法，该方法由新疆树上干杏无菌种子出芽、继代两次、秋水仙素诱导、染色体鉴定、流式细胞仪的分析、生根、温室炼苗七个步骤完成。本发明所述方法具有：将化学诱变与组织培养的结合，使得多倍体诱导中融入了组织培养的优点。相对于浸种法、涂抹法等途径来说更有优势。通过本发明所述方法有效的诱导和筛选出树上干杏多倍体，对于提高树上干杏产量和抗逆性等具有重要意义，有助于克服树上干杏在长期种植中出现的品种退化问题，进一步提高其市场竞争力。

权利要求

1.一种树上干杏多倍体的诱导方法，其特征在于按下列步骤进行：

a、将树上干杏种去除种皮后用100mg/L赤霉素溶液浸泡24h，再用清水浸泡24h进行预处理，然后用清水冲洗5min，在超净工作台上，用浓度为75％乙醇时间30s，0.1％HgCl2时间1min，15％H2O2时间20min依次进行消毒，再用无菌水冲洗6次，然后置于灭菌的滤纸上，待水分晾干接种于MS固体培养基上培养并置于培养室，培养室温度为20℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度20001x，进行30天的无菌培养； b、将步骤a培养的杏无菌种子苗，长到1-2厘米切下，接种到固体培养基QL’+0.1-0.8mg/L6-BA+0.01-0.08mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂7g/L中，pH5.88，进行18-25天丛芽继代培养两次，QL’培养基的组成为：QL’培养基大量元素、DKW培养基的微量元素、DKW培养基的有机元素和DKW培养基的铁盐的混合物，其中QL’培养基中的QL’培养基的大量元素为KNO31800mg/L、NH4NO3400mg/L、CaNO3·4H2O1199.46mg/L、MgSO4·7H2O359.65mg/L和KH2PO4270mg/L；DKW培养基的微量元素为MnSO4·H2O33.5mg/L、Zn(NO3)2·6H2O17mg/L、CuSO4·5H2O0.25mg/L、H3BO34.8mg/L和Na2MoO40.39mg/L；DKW培养基的铁盐为EDTA45.4mg/L和FeSO4·7H2O33.8mg/L；DKW培养基的有机元素为盐酸硫胺素VB12.0mg/L、烟酸1.0mg/L和甘氨酸Gly2.0mg/L； c、将步骤b中的丛芽继代培养的单苗接种于含有0.2％-0.8％的秋水仙素固体培养基QL’+0.1-0.8mg/L6-BA+0.01-0.08mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂4g/L中，培养时间18天，温度25℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度3000lx进行诱导两次，然后对诱导新叶芽分别按常规方法进行染色体检测和流式细胞仪测试，以确定诱导苗的倍性，QL’培养基的组成为：QL’培养基大量元素、DKW培养基的微量元素、DKW培养基的有机元素和DKW培养基的铁盐的混合物，其中QL’培养基中的QL’培养基的大量元素为KNO3 1800mg/L、NH4NO3400mg/L、CaNO3·4H2O1199.46mg/L、MgSO4·7H2O359.65mg/L和KH2PO427Omg/L；DKW培养基的微量元素为MnSO4·H2O33.5mg/L、Zn(NO3)2·6H2O17mg/L、CuSO4·5H2O0.25mg/L、H3BO34.8mg/L和Na2MoO40.39mg/L；DKW培养基的铁盐为EDTA45.4mg/L和FeSO4·7H2O33.8mg/L；DKW培养基的有机元素为盐酸硫胺素VB12.0mg/L、烟酸1.0mg/L和甘氨酸Gly2.0mg/L； d、将步骤c诱导苗接入固体培养基1/2DKW+0.1-0.8mg/LIBA，在温度25℃±1℃暗培养

12d进行生根；

e、将步骤d生根的单苗，逐一从培养基中轻轻取出，洗去根部所带的琼脂，移入含有

0.1-0.8mg/LIBA溶液中浸泡4小时后移栽到草炭土中进行温室炼苗，经过20天组培苗长出新叶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c将苗接种于培养基底部，并将培养基覆盖全苗。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤e温室为保持温度15-25℃，湿度

80-90％。

说明书

一种树上干杏的多倍体诱导方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及新疆树上干杏多倍体的诱导方法。

背景技术

[0002] 树上干杏(俗称吊死干、花干杏)，属蔷薇科(Rosaeeae)、李亚科(Prunoideae)、杏属(Prunus)，是我国天山北麓特克斯河谷和伊犁河谷特有的杏资源，因其果实成熟后不落地、直接在树上风干而得名。树上干杏无论是干果还是鲜果品味都极好，其核壳极薄，轻磕即破，果仁香甜可口，实为风沙地区的无价之宝，具有很高的经济价值。就杏本身来看，杏树全身是宝，几乎每一处都能为人所用。杏果肉不仅香甜可口而且营养丰富。杏果肉中除了含有蛋白质、纤维、各种糖、有机酸和矿物质外，还有丰富的维生素。杏仁也含有丰富的营养。杏仁除了食用还可入药，能止咳祛痰、润肺止泻，治风寒肺病、惊痫头痛、慢性气管炎等疾病，早在《本草纲目》中就有记载。另外，杏仁油既是高级润滑油，又可护肤化妆品的原料。杏核壳可提取栲胶，可制作活性炭；杏叶可作牛羊的饲料；杏的树皮可提取单宁和杏胶；枝干可加工成木炭和绘画用的炭条、炭黑等；杏木是做家具的上好材料。杏的加工制品是我国传统的出口创汇产品，为我国创取大量外汇。另外，杏树特有的抗寒抗旱耐贫瘠的品质，使它既能防风固沙，又能防止水土流失。在“三北防护林”体现中，杏树被认为是最适宜的经济林树种之一，其生态效益越来越受到社会的重视。

[0003] 多倍体遗传适应性较强，在竞争中胜过它们的二倍体祖先。多倍体的适应性，突出的表现是具有较强的抗寒性、抗热性、抗旱性，以及对不良土壤条件也有较强的适应性。多倍体育种包括两大途径，即自然多倍体的发掘与人工诱导。由于自然多倍体的数量是有限的，不可能达到多倍体育种中所需要的具有丰富遗传背景的大量群体，因此多倍体的育种主要通过人工诱导这一途径。植物多倍化后能引起广泛的变异，产生新的品种，在农业上具有广泛的应用前景。用于药材生产可提高有效成分含量；用于林木生产可达到速生，增强抗性的目的；用于蔬菜水果上可使果实变大；用于园艺作物上可形成无籽果实。树上干杏的果实较一般的杏品种小且产量易受天气的影响，御寒能力差，因此期望能利于多倍体诱导技术改善树上干杏的抗寒能力差以及果实小的特点，得到具有果实大，含糖量高，适应性强且抗性强的杏品种，进一步提高其市场竞争力，开拓新的市场，这对扩大新疆林果业种植面积，提高果农经济收入来说具有重要意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于，提供一种树上干杏的多倍体诱导方法，该方法由新疆树上干杏无菌种子出芽、继代两次、秋水仙素诱导、染色体鉴定、流式细胞仪的分析、生根、温室炼苗七个步骤完成。通过本发明所述的方法可以有效的诱导和筛选出树上干杏多倍体，有助于克服树上干杏在长期种植中出现的品种退化问题，进一步提高其市场竞争力。

[0005] 本发明所述的一种树上干杏多倍体诱导方法，按下列步骤进行：

[0006] a、将树上干杏种去除种皮后用100mg/L赤霉素溶液浸泡24h，再用清水浸泡24h进行预处理，然后用清水冲洗5min，在超净工作台上，用浓度为75％乙醇时间30s，0.1％HgCl2时间1min，15％H2O2时间20min依次进行消毒，再用无菌水冲洗6次，然后置于灭菌的滤纸上，待水分晾干接种于MS固体培养基上培养并置于培养室，培养室温度为20℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度2000lx，进行30天的无菌培养；

[0007] b、将步骤a培养的杏无菌种子苗，长到1-2厘米切下，接种到固体培养基QL’+0.1-0.8mg/L6-BA+0.01-0.08mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂7g/L中，pH5.88，进行18-25天丛芽继代培养两次；

[0008] c、将步骤b中的丛芽继代培养的单苗接种于含有0.2％-0.8％的秋水仙素固体培养基QL’+0.1-0.8mg/L6-BA+0.01-0.08mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂4g/L中，pH5.88，培养时间18天，温度25℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度3000lx进行诱导两次，然后对诱导新叶芽分别按常规方法进行染色体检测和流式细胞仪测试，以确定诱导苗的倍性；

[0009] d、将步骤c诱导苗接入固体培养基1/2DKW+0.1-0.8mg/LIBA进行生根，在温度25℃±1℃暗培养12d；

[0010] e、将步骤d生根的单苗，逐一从培养基中轻轻取出，洗去根部所带的琼脂，移入含有0.1-0.8mg/LIBA溶液中浸泡4小时后移栽到草炭土中进行温室炼苗，经过20天组培苗长出新叶。

[0011] 步骤b、c中QL’培养基的组成为：QL’培养基大量元素、DKW培养基的微量元素、DKW培养基的有机元素和DKW培养基的铁盐的混合物。

[0012] QL’培养基中的QL’培养基大量元素为KNO3、NH4NO3、CaNO3·4H2O、MgSO4·7H2O和KH2PO4；DKW培养基的微量元素为MnSO4·H2O、Zn(NO3)2·6H2O、Cu SO4·5H2O、H3BO3和Na2MoO4；DKW培养基的有机元素为盐酸硫胺素VB1、烟酸和甘氨酸Gly；DKW培养基的铁盐为乙二胺四乙酸二钠和FeSO4·7H2O。

[0013] 步骤c将苗接种于培养基底部，并将培养基覆盖全苗。

[0014] 步骤e温室为保持温度15-25℃，湿度80-90％。

[0015] 本发明所述的一种树上干杏的多倍体诱导方法，该方法对诱导新叶芽分别按常规方法进行染色体检测和流式细胞仪测试，以确定诱导苗的倍性中染色体检测：切取新生叶芽生长点，直接侵入到0.002mol/L8-羟基喹啉溶液0-4℃处理2-8小时，接着用卡诺氏固定液为无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1室温下固定12-24小时，用蒸馏水漂洗后，在58℃-60℃用1mol/L盐酸溶液恒温下酸解10min，吸去处理液，用蒸馏水冲洗3次，将叶芽放在蒸馏水中，在室温下处理30min，弃去蒸馏水用改良品红染色4-24小时，切下叶芽叶鞘1-2mm的部分置于载玻片上，用镊子捣碎后，盖上盖玻片，轻轻将细胞敲散，在40倍镜下观察即可。

[0016] 流式细胞仪测试：称取约1g嫩叶在装有2mL提取缓冲液(15mmol·L-1Tri s-HCl，-1 -1 -1 -1pH 7.5，80mmol·L ，KCl，20mmol·L ，NaCl，20mmol·L ，EDTA-Na-2，15mmol·L 巯基乙醇和0.05(V/V)TritonX-100)的培养皿中用剪刀剪碎，400目尼龙网过滤，4℃离心-1
(1000r·min )3min，用提取缓冲液离心漂洗3次，制备的细胞核悬浮液离心后弃上清液，在沉淀中加入70％的酒精，用封口膜封好离心管口寄往北京鼎国昌盛有限公司检测。

[0017] 本发明所述的方法，其中步骤b、c中QL’培养基的组成为：QL’培养基大量元素为KNO3、NH4NO3、CaNO3·4H2O、MgSO4·7H2O和KH2PO4，DKW培养基的微量元素为MnSO4·H2O、Zn(NO3)2·6H2O、Cu SO4·5H2O、H3BO3和Na2MoO4，DKW培养基的有机元素为盐酸硫胺素VB1、烟酸和甘氨酸Gly，DKW培养基的铁盐为EDTA和FeSO4·7H2O，将各组分分别按比例进行混合即可得到QL’培养基。见表：

[0018] 表：QL’大量元素、DKW微量元素、DKW铁盐元素、DKW有机元素

[0019])
L/gm 0. 0. 0.
( 2 1 2
素 BV1
元机 素胺 ylG
有 硫 酸
WKD 酸盐 酸烟 氨甘

)L/g 4. 8.
m( 54 33
素元 OH72
盐铁 A ·O4
WKD TDE SeF

)L/ 5 5 9
gm( .33 71 2.0 8.4 3.0

素元量微WK OH·OSn24 OH6·)ON(n223 OH5·OS u24 OB33 OoMa42
D M Z C H N
6
)L/g 00 0 4.99 56.9 0
m( 81 04 11 53 72
素 O2 O2
元量大’LQ ONK3 ONHN34 H4·ONaC3 H7·OSgM4 OPHK42

[0020] 本发明所述一种树上干杏多倍体诱导方法，该方法特点在于：

[0021] 将化学诱变与组织培养的结合，使得多倍体诱导中融入了组织培养的优点。首先，实验条件易于控制，由于组培是在室内进行的，这就在很大程度上降低了外界环境因素对于试验的干扰和影响；其次，为多倍体诱导提供更多的处理方法以及诱导材料。相对于浸种法、涂抹法等途径来说更有优势。采用本方法在丛芽继代培养中，增殖倍数可达5.2，最多可达9个；经过秋水仙素处理后的无菌苗抽出新叶芽，植株外观叶片与对照苗差异显著，生根率达到最大值83.3％，平均每株生根数目为4条，生根指数为499.8。该方法苗的诱导成活率高，植株体现出多倍体特征，对于提高树上干杏产量和抗逆性等具有重要意义。

附图说明

[0022] 图1为本发明中树上干杏二倍体与多倍体无菌苗的对照

[0023] 图2为本发明中树上干杏二倍体与多倍体无菌生根苗的对照

[0024] 图3为本发明中树上干杏二倍体无菌苗的染色体图

[0025] 图4为本发明中树上干杏多倍体无菌苗的染色体图

[0026] 图5为本发明中树上干杏多倍体流式细胞仪测试结果图

[0027] 图6为本发明中树上干杏组培苗二倍体与多倍体温室炼苗对照

具体实施方式

[0028] 本发明采用树上干杏为对象：

[0029] 实施例1：

[0030] 将新疆树上干杏种去除种皮后用100mg/L赤霉素(GA3)溶液浸泡24h，再用清水浸泡24h进行预处理，然后用清水冲洗5min，在超净工作台上，用75％乙醇时间30s，0.1％HgCl2时间1min，15％H2O2时间20min依次进行消毒，再用无菌水冲洗6次，然后置于灭菌的滤纸上，待水分晾干接种于MS培养基上培养并置于培养室，培养室温度为20℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度2000lx，进行30天的无菌培养；

[0031] 将培养的杏无菌种子苗，长到1-2厘米切下，接种到固体培养基QL’+0.1mg/L6-BA+0.01mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂7g/L中，pH5.88，进行20天丛芽继代培养两次；

[0032] 将丛芽继代培养的单苗接种于含有0.2％的秋水仙素固体培养基QL’+0.1mg/L6-BA+0.01mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂4g/L中，pH5.88，将苗接种于培养基底部，培养基覆盖全苗，时间培养18天，温度25℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度3000lx进行诱导两次，经过秋水仙素处理后的无菌苗抽出新叶芽，植株外观叶片与对照苗差异显著，然后对诱导新叶芽分别按常规方法进行染色体检测和流式细胞仪测试，以确定诱导苗的倍性；

[0033] 将新叶芽进行染色体的检测：切取新生叶芽生长点，直接侵入到0.002mol/L8-羟基喹啉溶液0-4℃处理4小时，接着用卡诺氏固定液为无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1室温下固定12小时，用蒸馏水漂洗后，在温度58℃用1mol/L盐酸溶液恒温下酸解10min，吸去处理液，用蒸馏水冲洗3次，将叶芽放在蒸馏水中，在室温下处理30min，弃去蒸馏水用改良品红染色8小时，切下叶芽叶鞘1-2mm的部分置于载玻片上，用镊子捣碎后，盖上盖玻片，轻轻将细胞敲散，在40倍镜下观察即可；

[0034] 流式细胞仪测试：称取1g嫩叶在装有2mL提取缓冲液3min，用提取缓冲液离心漂洗3次，制备的细胞核悬浮液离心后弃上清液，在沉淀中加入浓度为70％的乙醇，用封口膜封好离心管口寄往北京鼎国昌盛有限公司检测；

[0035] 将诱导苗接入固体培养基1/2DKW+0.1mg/LIBA，在温度25℃±1℃暗培养12d进行生根；

[0036] 将生根的单苗，逐一从培养基中轻轻取出，洗去根部所带的琼脂，移入含有0.1mg/LIBA溶液中浸泡4小时后移栽到草炭土中进行温室炼苗，温室保持温度15℃，湿度80％，经过20天组培苗长出新叶。

[0037] 实施例2：

[0038] 将新疆树上干杏种去除种皮后用100mg/L赤霉素(GA3)溶液浸泡24h，再用清水浸泡24h进行预处理，然后用清水冲洗5min，在超净工作台上，用浓度为75％乙醇时间30s，0.1％HgCl2时间1min，15％H2O2时间20min依次进行消毒，再用无菌水冲洗6次，然后置于灭菌的滤纸上，待水分晾干接种于MS固体培养基上培养并置于培养室，培养室温度为
20℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度2000lx，进行30天的无菌培养；

[0039] 将培养的杏无菌种子苗，长到1-2厘米切下，接种到固体培养基QL’+0.2mg/L6-BA+0.05mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂7g/L中，pH5.88，进行18天丛芽继代培养两次；

[0040] 将丛芽继代培养的单苗接种于含有0.4％的秋水仙素固体培养基QL’+0.2mg/L6-BA+0.03mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂4g/L中，pH5.88，将苗接种于培养基底部，培养基覆盖全苗，培养时间18天，温度25℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度3000lx进行诱导两次，经过秋水仙素处理后的无菌苗抽出新叶芽，植株外观叶片与对照苗差异显著，然后对诱导新叶芽分别按常规方法进行染色体检测和流式细胞仪测试，以确定诱导苗的倍性；

[0041] 将新叶芽进行染色体的检测：切取新生叶芽生长点，直接侵入到0.002mol/L8-羟基喹啉溶液0-4℃处理4小时，接着用卡诺氏固定液为无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1室温下固定20小时，用蒸馏水漂洗后，在温度58℃用1mol/L盐酸溶液恒温下酸解10min，吸去处理液，用蒸馏水冲洗3次，将叶芽放在蒸馏水中，在室温下处理30min，弃去蒸馏水用改良品红染色4小时，切下叶芽叶鞘1-2mm的部分置于载玻片上，用镊子捣碎后，盖上盖玻片，轻轻将细胞敲散，在40倍镜下观察即可；

[0042] 流式细胞仪测试：称取1g嫩叶在装有2mL提取缓冲液3min，用提取缓冲液离心漂洗3次，制备的细胞核悬浮液离心后弃上清液，在沉淀中加入浓度为70％的乙醇，用封口膜封好离心管口寄往北京鼎国昌盛有限公司检测；

[0043] 将诱导苗接入固体培养基1/2DKW+0.8mg/LIBA，在温度25℃±1℃暗培养12d进行生根；

[0044] 将生根的单苗，逐一从培养基中轻轻取出，洗去根部所带的琼脂，移入含有0.3mg/LIBA溶液中浸泡4小时后移栽到草炭土中进行温室炼苗，温室保持温度20℃，湿度85％，经过20天组培苗长出新叶。

[0045] 实施例3：

[0046] 将新疆树上干杏种去除种皮后用100mg/L赤霉素(GA3)溶液浸泡24h，再用清水浸泡24h进行预处理，然后用清水冲洗5min，在超净工作台上，用浓度为75％乙醇时间30s，0.1％HgCl2时间1min，15％H2O2时间20min依次进行消毒，再用无菌水冲洗6次，然后置于灭菌的滤纸上，待水分晾干接种于MS培养基上培养并置于培养室，培养室温度为
20℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度2000lx，进行30天的无菌培养；

[0047] 将培养后的杏无菌种子苗，长到1-2厘米切下，接种到固体培养基QL’+0.6mg/L6-BA+0.08mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂7g/L中，pH5.88，进行22天丛芽继代培养两次；

[0048] 将丛芽继代培养的单苗接种于含有0.6％的秋水仙素固体培养基QL’+0.4mg/L6-BA+0.05mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂4g/L中，pH5.88，将苗接种于培养基底部，培养基覆盖全苗，时间18天，温度25℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度3000lx进行诱导两次，经过秋水仙素处理后的无菌苗抽出新叶芽，植株外观叶片与对照苗差异显著，然后对诱导新叶芽分别按常规方法进行染色体检测和流式细胞仪测试，以确定诱导苗的倍性；

[0049] 将新叶芽进行染色体的检测：切取新生叶芽生长点，直接侵入到0.002mol/L8-羟基喹啉溶液0-4℃处理2小时，接着用卡诺氏固定液为无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1室温下固定24小时，用蒸馏水漂洗后，在温度58℃用1mol/L盐酸溶液恒温下酸解10min，吸去处理液，用蒸馏水冲洗3次，将叶芽放在蒸馏水中，在室温下处理30min，弃去蒸馏水用改良品红染色12小时，切下叶芽叶鞘1-2mm的部分置于载玻片上，用镊子捣碎后，盖上盖玻片，轻轻将细胞敲散，在40倍镜下观察即可；

[0050] 流式细胞仪测试：称取1g嫩叶在装有2mL提取缓冲液3min，用提取缓冲液离心漂洗3次，制备的细胞核悬浮液离心后弃上清液，在沉淀中加入浓度为70％的乙醇，用封口膜封好离心管口寄往北京鼎国昌盛有限公司检测；

[0051] 将诱导苗接入固体培养基1/2DKW+0.4mg/LIBA，在温度25℃±1℃暗培养12d进行生根；

[0052] 将生根的单苗，逐一从培养基中轻轻取出，洗去根部所带的琼脂，移入含有0.8mg/LIBA溶液中浸泡4小时后移栽到草炭土中进行温室炼苗，温室保持温度18℃，湿度82％，经过20天组培苗长出新叶。

[0053] 实施例4：

[0054] 将新疆树上干杏种去除种皮后用100mg/L赤霉素(GA3)溶液浸泡24h，再用清水浸泡24h进行预处理，然后用清水冲洗5min，在超净工作台上，用浓度为75％乙醇时间30s，0.1％HgCl2时间1min，15％H2O2时间20min依次进行消毒，再用无菌水冲洗6次，然后置于灭菌的滤纸上，待水分晾干接种于MS固体培养基上培养并置于培养室，培养室温度为
20℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度2000lx，进行30天的无菌培养；

[0055] 将培养杏无菌种子苗，长到1-2厘米切下，接种到固体培养基QL’+0.8mg/L6-BA+0.01mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂7g/L中，pH5.88，进行18-25天丛芽继代培养两次；

[0056] 将丛芽继代培养的单苗接种于含有0.8％的秋水仙素固体培养基QL’+0.1mg/L6-BA+0.08mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂4g/L中，pH5.88，将苗接种于培养基底部，培养基覆盖全苗，培养时间18天，温度25℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度3000lx进行诱导两次，经过秋水仙素处理后的无菌苗抽出新叶芽，植株外观叶片与对照苗差异显著，然后对诱导新叶芽分别按常规方法进行染色体检测和流式细胞仪测试，以确定诱导苗的倍性；

[0057] 将新叶芽进行染色体的检测：切取新生叶芽生长点，直接侵入到0.002mol/L8-羟基喹啉溶液0-4℃处理8小时，接着用卡诺氏固定液为无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1室温下固定12小时，用蒸馏水漂洗后，在温度58℃用1mol/L盐酸溶液恒温下酸解10min，吸去处理液，用蒸馏水冲洗3次，将叶芽放在蒸馏水中，在室温下处理30min，弃去蒸馏水用改良品红染色24小时，切下叶芽叶鞘1-2mm的部分置于载玻片上，用镊子捣碎后，盖上盖玻片，轻轻将细胞敲散，在40倍镜下观察即可；

[0058] 流式细胞仪测试：称取1g嫩叶在装有2mL提取缓冲液3min，用提取缓冲液离心漂洗3次，制备的细胞核悬浮液离心后弃上清液，在沉淀中加入浓度为70％的乙醇，用封口膜封好离心管口寄往北京鼎国昌盛有限公司检测；

[0059] 将诱导苗接入固体培养基1/2DKW+0.8mg/LIBA，在温度25℃±1℃暗培养12d进行生根；

[0060] 将生根的单苗，逐一从培养基中轻轻取出，洗去根部所带的琼脂，移入含有0.4mg/LIBA溶液中浸泡4小时后移栽到草炭土中进行温室炼苗，温室保持温度22℃，湿度86％，经过20天组培苗长出新叶。

[0061] 实施例5：

[0062] 将新疆树上干杏种去除种皮后用100mg/L赤霉素(GA3)溶液浸泡24h，再用清水浸泡24h进行预处理，然后用清水冲洗5min，在超净工作台上，用浓度为75％乙醇时间30s，0.1％HgCl2时间1min，15％H2O2时间20min依次进行消毒，再用无菌水冲洗6次，然后置于灭菌的滤纸上，待水分晾干接种于MS培养基上培养并置于培养室，培养室温度为
20℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度2000lx，进行30天的无菌培养；

[0063] 将培养的杏无菌种子苗，长到1-2厘米切下，接种到固体培养基QL’+0.1mg/L6-BA+0.08mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂7g/L中，pH5.88，进行18-25天丛芽继代培养两次；

[0064] c、将步骤b中的丛芽继代培养的单苗接种于含有0.7％的秋水仙素固体培养基QL’+0.4mg/L6-BA+0.08mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂4g/L中，pH5.88，将苗接种于培养基底部，培养基覆盖全苗，培养时间18天，温度25℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度3000lx进行诱导两次，经过秋水仙素处理后的无菌苗抽出新叶芽，植株外观叶片与对照苗差异显著，然后对诱导新叶芽分别按常规方法进行染色体检测和流式细胞仪测试，以确定诱导苗的倍性；

[0065] 将新叶芽进行染色体的检测：切取新生叶芽生长点，直接侵入到0.002mol/L8-羟基喹啉溶液0-4℃处理2小时，接着用卡诺氏固定液为无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1室温下固定12小时，用蒸馏水漂洗后，在温度58℃用1mol/L盐酸溶液恒温下酸解10min，吸去处理液，用蒸馏水冲洗3次，将叶芽放在蒸馏水中，在室温下处理30min，弃去蒸馏水用改良品红染色20小时，切下叶芽叶鞘1-2mm的部分置于载玻片上，用镊子捣碎后，盖上盖玻片，轻轻将细胞敲散，在40倍镜下观察即可；

[0066] 流式细胞仪测试：称取1g嫩叶在装有2mL提取缓冲液3min，用提取缓冲液离心漂洗3次，制备的细胞核悬浮液离心后弃上清液，在沉淀中加入浓度为70％的乙醇，用封口膜封好离心管口寄往北京鼎国昌盛有限公司检测；

[0067] 将诱导苗接入固体培养基1/2DKW+0.6mg/LIBA，在温度25℃±1℃暗培养12d进行生根；

[0068] 将生根的单苗，逐一从培养基中轻轻取出，洗去根部所带的琼脂，移入含有0.1mg/LIBA溶液中浸泡4小时后移栽到草炭土中进行温室炼苗，温室为保持温度25℃，湿度90％，经过20天组培苗长出新叶。

[0069] 实施例6：

[0070] 将新疆树上干杏种去除种皮后用100mg/L赤霉素(GA3)溶液浸泡24h，再用清水浸泡24h进行预处理，然后用清水冲洗5min，在超净工作台上，用浓度为75％乙醇时间30s，0.1％HgCl2时间1min，15％H2O2时间20min依次进行消毒，再用无菌水冲洗6次，然后置于灭菌的滤纸上，待水分晾干接种于MS固体培养基上培养并置于培养室，培养室温度为
20℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度2000lx，进行30天的无菌培养；

[0071] 将培养的杏无菌种子苗，长到1-2厘米切下，接种到固体培养基QL’+0.8mg/L6-BA+0.08mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂7g/L中，pH5.88，进行18-25天丛芽继代培养两次；

[0072] 将丛芽继代培养的单苗接种于含有0.5％的秋水仙素固体培养基QL’+0.6mg/L6-BA+0.06mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂4g/L中，pH5.88，将苗接种于培养基底部，培养基覆盖全苗，培养时间18天，温度25℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度3000lx进行诱导两次，经过秋水仙素处理后的无菌苗抽出新叶芽，植株外观叶片与对照苗差异显著，然后对诱导新叶芽分别按常规方法进行染色体检测和流式细胞仪测试，以确定诱导苗的倍性；

[0073] 将新叶芽进行染色体的检测：切取新生叶芽生长点，直接侵入到0.002mol/L8-羟基喹啉溶液0-4℃处理7小时，接着用卡诺氏固定液为无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1室温下固定20小时，用蒸馏水漂洗后，在温度58℃用1mol/L盐酸溶液恒温下酸解10min，吸去处理液，用蒸馏水冲洗3次，将叶芽放在蒸馏水中，在室温下处理30min，弃去蒸馏水用改良品红染色16小时，切下叶芽叶鞘1-2mm的部分置于载玻片上，用镊子捣碎后，盖上盖玻片，轻轻将细胞敲散，在40倍镜下观察即可；

[0074] 流式细胞仪测试：称取1g嫩叶在装有2mL提取缓冲液3min，用提取缓冲液离心漂洗3次，制备的细胞核悬浮液离心后弃上清液，在沉淀中加入浓度为70％的乙醇，用封口膜封好离心管口寄往北京鼎国昌盛有限公司检测；

[0075] 将诱导苗接入固体培养基1/2DKW+0.6mg/LIBA，在温度25℃±1℃暗培养12d进行生根；

[0076] 将生根的单苗，逐一从培养基中轻轻取出，洗去根部所带的琼脂，移入含有0.5mg/LIBA溶液中浸泡4小时后移栽到草炭土中进行温室炼苗，温室保持温度16℃，湿度84％，经过20天组培苗长出新叶。

[0077] 实施例7：

[0078] 将新疆树上干杏种去除种皮后用100mg/L赤霉素(GA3)溶液浸泡24h，再用清水浸泡24h进行预处理，然后用清水冲洗5min，在超净工作台上，用浓度为75％乙醇时间30s，0.1％HgCl2时间1min，15％H2O2时间20min依次进行消毒，再用无菌水冲洗6次，然后置于灭菌的滤纸上，待水分晾干接种于MS培养基上培养并置于培养室，培养室温度为
20℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度2000lx，进行30天的无菌培养；

[0079] 将培养的杏无菌种子苗，长到1-2厘米切下，接种到固体培养基QL’+0.5mg/L6-BA+0.01mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂7g/L中，pH5.88，进行18-25天丛芽继代培养两次；

[0080] 将丛芽继代培养的单苗接种于含有0.6％的秋水仙素固体培养基QL’+0.8mg/L6-BA+0.08mg/LIBA+30mg/L蔗糖+琼脂4g/L中，pH5.88，将苗接种于培养基底部，培养基覆盖全苗，培养时间18天，温度25℃±1℃，光照时间16h/d，光照强度3000lx进行诱导两次，经过秋水仙素处理后的无菌苗抽出新叶芽，植株外观叶片与对照苗差异显著，然后对诱导新叶芽分别按常规方法进行染色体检测和流式细胞仪测试，以确定诱导苗的倍性；

[0081] 将新叶芽进行染色体的检测：切取新生叶芽生长点，直接侵入到0.002mol/L8-羟基喹啉溶液0-4℃处理5小时，接着用卡诺氏固定液为无水乙醇∶冰乙酸＝3∶1室温下固定12小时，用蒸馏水漂洗后，在58℃用1mol/L盐酸溶液恒温下酸解10min，吸去处理液，用蒸馏水冲洗3次，将叶芽放在蒸馏水中，在室温下处理30min，弃去蒸馏水用改良品红染色10小时，切下叶芽叶鞘1-2mm的部分置于载玻片上，用镊子捣碎后，盖上盖玻片，轻轻将细胞敲散，在40倍镜下观察即可；

[0082] 流式细胞仪测试：称取1g嫩叶在装有2mL提取缓冲液3min，用提取缓冲液离心漂洗3次，制备的细胞核悬浮液离心后弃上清液，在沉淀中加入浓度为70％的乙醇，用封口膜封好离心管口寄往北京鼎国昌盛有限公司检测；

[0083] 将诱导苗接入固体培养基1/2DKW+0.4mg/LIBA，在温度25℃±1℃暗培养12d进行生根；

[0084] 将生根的单苗，逐一从培养基中轻轻取出，洗去根部所带的琼脂，移入含有0.8mg/LIBA溶液中浸泡4小时后移栽到草炭土中进行温室炼苗，温室保持温度23℃，湿度88％，经过20天组培苗长出新叶。