HRN/gptdelta转基因小鼠模型的构建方法

摘要

本发明公开了一种肝脏细胞色素P450酶功能缺陷型gpt delta转基因小鼠模型的构建方法。本发明的提供的小鼠模型具有肝脏细胞色素P450还原酶敲除小鼠和gpt delta转基因小鼠一切特征，而且还可以进行化合物代谢与致突变之间关系的研究，特别适合于那些能够被肝CYP代谢活化肝外组织器官形成突变的化合物的研究。

权利要求

1.一种肝脏细胞色素P450酶功能缺陷型gpt delta转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：分别选用肝脏特异性CPR KO小鼠和gpt delta转基因小鼠进行杂交，得到F1代：loxp+/- +/- +/- loxp+/- -/- +/-cpr Cre gpt 和cpr Cre gpt 基因型小鼠；

loxp+/- +/- +/-

将F1代中的cpr Cre gpt 基因型的雌鼠和雄鼠再进行杂交，得到F2代：loxp+/+ +/- +/+ loxp+/+ -/- +/+cpr Cre gpt 和cpr Cre gpt 基因型小鼠；

loxp+/+ +/- +/+ loxp+/+ -/- +/+将F2代中的cpr Cre gpt 基因型雄鼠与cpr Cre gpt 基因型雌鼠进行交loxp+/+ +/- +/+ loxp+/+ -/- +/+配，产生更多F3代的cpr Cre gpt 和cpr Cre gpt 基因型小鼠；以及loxp+/+ +/- +/+ loxp+/+ -/- +/+将F3代中的cpr Cre gpt 基因型雄鼠与cpr Cre gpt 基因型雌鼠再交配后即可得到能正常繁育的肝脏细胞色素P450酶功能缺陷型gpt delta转基因小鼠模型。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CPR KO小鼠和gpt delta转基因小鼠具有相同C57BL/6J遗传背景。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述各步骤进一步包括对所获得的小鼠利用特异基因扩增引物进行基因型鉴定。

4.一种如权利要求1所述的肝脏细胞色素P450酶功能缺陷型gpt delta转基因小鼠模型在研究肝脏细胞P450酶与化合物致突变之间关系中的应用。

说明书

HRN/gpt delta转基因小鼠模型的构建方法

技术领域

[0001] 本发明涉及动物模型的构建方法，具体而言，涉及一种肝脏细胞色素P450酶功能缺陷型gpt delta（HRN/gpt delta）转基因小鼠模型的构建方法。

背景技术

[0002] 机体代谢过程对外源化合物既可解毒也可增毒，且与化合物对机体的致癌作用密切相关。肝脏细胞色素P450酶（缩写为CYP）在机体对外源性化合物的代谢过程中起到重要作用，但可用于揭示其致癌作用的研究工具非常有限。

[0003] 目前，研究肝脏P450酶对外源性化合物的代谢主要集中在体外实验上，包括肝脏微粒体、原代肝细胞、CYPs各亚型高表达细胞株和重组酶的应用。尽管这些体外方法具有很大应用价值，但是，由于外源性化合物的摄入途径不同、组织中有机阴（阳）离子转运体的存在、肾脏清除作用和肝外CYPs作用等复杂因素的存在，使得上述体外实验仍然难以精确预测外源性化合物在体内的实际代谢途径（Friedberg T,Pritchard MP,Bandera M,Hanlon SP,Yao D,McLaughlin LA,Ding S,Burchell B,Wolf CR.Merits and limitations of recombinant models for the study of human P450-mediated drug metabolism and toxicity:an intralaboratory comparison.Drug Metab Rev.1999.31(2):523-44.）。在体内代谢研究中，目前已有多个P450酶亚型敲除小鼠模型，这些模型已被广泛用来研究特异性P450酶亚型在外源性化合物的代谢和毒性中的作用。然而，CYP通常具有多种亚型，并且各亚型功能类似，底物存在交叉，使得单一亚型的基因敲除动物模型难以准确评价P450酶对外源性化合物毒性的影响。因此，使所有CYPs都失去功能的模型将是一个非常有用的工具。NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR/POR）为所有微粒体P450酶的氧化还原搭档，它提供P450酶氧化还原反应所需的第一个电子，基于此原理，Jun Gu等人开发了一个肝脏特异性P450还原酶-Cpr基因敲除小鼠模型（Hepatic Reductase Null，HRN,以下简称为肝脏特异性CPR KO小鼠模型），该基因表达的缺失将抑制所有肝脏P450酶的活性（Wu L,Gu J,Weng Y,Kluetzman K,Swiatek P,Behr M,Zhang QY,Zhuo X,Xie Q,Ding X.Conditional knockout of the mouse NADPH-cytochrome p450reductase gene.Genesis.2003Aug;36(4):177-81.）。该模型利用Cre/LoxP系统通过条件敲除（conditional knock）获得，小鼠在成熟过程中肝脏Cpr基因被逐渐敲除（出生2个月以后），最终使得肝脏P450酶活性丧失，而其他组织却不受影响。

[0004] 绝大多数致癌物具有遗传毒性，即损伤遗传物质(DNA或染色体)，引起基因突变进而致癌。遗传毒性的评价是预测致癌性的有效方法，其检测的对象包括DNA损伤及DNA损伤引起的基因突变、染色体损伤、重组和数目的改变等。评价通常采用标准组合试验进行，如评价DNA损伤的彗星试验、评价染色体损伤的微核试验和染色体畸变试验、评价基因突变的Ames试验、哺乳动物细胞基因突变试验和转基因动物突变检测试验等。与体外实验相比，体内实验方法假阳性发生率较低，并且具有考虑到与人体应用相关的吸收、代谢、分布和排泄的优点，因此体内实验的应用日益受到重视。现有的体内试验方法较少，经典的体内微核试验可预测致癌性，但是该方法只评价骨髓而不能预测毒性靶器官。转基因动物是一个非常重要的研究工具，可检测任何所需器官内的基因突变，还可以进行突变的机制分析。

[0005] 历来的转基因动物突变检测模型主要有Muta Mouse和Big Blue Mouse/Rat等（J A Gossen,W J de Leeuw,C H Tan,E C Zwarthoff,F Berends,P H Lohman,D L Knook,and J Vijg.Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice:a model for studying mutations in vivo,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1989,86:7971-7975.Kohler SW,Provost GS,Kretz PL,Fieck A,Sorge JA,Short JM.The use of transgenic mice for short-term,in vivo mutagenicity testing.Genet Anal Tech Appl.1990Dec;7(8):212-8.）。但是上述模型具有的共同缺陷是只能检测点突变和DNA小片段的缺失突变，而大片段的缺失突变就难以被检测出来。1996年，Nohmi等人建立了新的转基因动物模型gpt delta转基因小鼠（Nohmi T,Katoh M,Suzuki H,Matsui M,Yamada M,Watanabe M,Suzuki M,Horiya N,Ueda O,Shibuya T,Ikeda H,Sofuni T.A new transgenic mouse mutagenesis test system using Spi-and6-thioguanine selections.Environ Mol Mutagen.1996;28(4):465-70.），该模型的特点是在小鼠的不同器官不仅可以检测到包括点突变、移码突变、碱基置换等碱基的突变，还可以检测DNA片段大范围的缺失。此外，gpt基因的长度为456bp，有利于进一步通过测序对突变进行机制分析。

[0006] 确定肝脏细胞色素P450与体内致突变检测之间的关系对化合物的遗传易感性预测和预防有着重要的意义。目前具有的这两种小鼠模型中，肝脏特异性CPR KO小鼠模型不能进行体内突变检测，gpt delta转基因小鼠虽可做体内突变检测，但无法考察肝脏细胞色素P450在其中起的作用。因此，只有建立同时具备两种特性的动物模型才能解决这一问题。

发明内容

[0007] 针对现有技术中的不足，发明人致力于研究同时具备两种特性的动物模型。由此，本发明把正在应用的两种模型动物gpt delta转基因小鼠与具有相同C57BL/6J遗传背景的肝脏特异性CPR KO小鼠进行了杂交，通过检测基因型，选择所需子代动物进行反复交配，最终得到了肝脏特异性CPR缺陷型的gpt delta转基因小鼠新模型，即为肝脏P450酶功能缺陷型gpt delta转基因小鼠（Hepatic Reductase Null gpt delta转基因小鼠，简称为HRN/gpt delta转基因小鼠）。并且，在反复试验中本发明还克服了杂交不成功，子代不能存活或者基因型与预期不符，以及使杂交后小鼠的各个基因能够稳定遗传的技术难题。

[0008] 因此，本发明的一个目的是提供一种肝脏细胞色素P450酶功能缺陷型gpt delta转基因小鼠模型。

[0009] 本发明的另一个目的是提供一种肝脏细胞色素P450酶功能缺陷型gpt delta转基因小鼠模型的构建方法。

[0010] 本发明的再一个目的是提供该模型在研究肝脏细胞P450酶与化合物致突变之间关系中的应用。

[0011] 为实现上述目的，本发明提供了一种肝脏细胞色素P450酶功能缺陷型gpt delta转基因小鼠模型。

[0012] 根据本发明的另一个目的，本发明提供了一种构建上述模型的方法，该方法包括以下步骤：

[0013] （1）分别选用肝脏特异性CPR KO小鼠和gpt delta转基因小鼠进行杂交，得到F1loxp+/- +/- +/- loxp+/- -/- +/-代：cpr Cre gpt 和cpr Cre gpt 基因型小鼠。由于两种小鼠遗传背景一致，
均是C57BL/6J品系小鼠，所以子代小鼠不存在遗传背景差异问题。

[0014] （2）将F1代中的cprloxp+/-Cre+/-gpt+/-基因型的雌鼠和雄鼠再进行杂交，得到F2代：loxp+/+ +/- +/+ loxp+/+ -/- +/+
cpr Cre gpt 和cpr Cre gpt 基因型小鼠。

[0015] （3）将F2代中的cprloxp+/+Cre+/-gpt+/+基因型雄鼠与cprloxp+/+Cre-/-gpt+/+基因型雌loxp+/+ +/- +/+ loxp+/+ -/- +/+鼠进行交配，产生更多F3代的cpr Cre gpt 和cpr Cre gpt 基因型小鼠。

[0016] （4）将F3代中的cprloxp+/+Cre+/-gpt+/+基因型雄鼠与cprloxp+/+Cre-/-gpt+/+基因型雌鼠再交配后即可得到正常繁育的肝脏细胞色素P450酶功能缺陷型gpt delta转基因小鼠模型。

[0017] 上述步骤均需对所获得的小鼠利用特异基因扩增引物进行基因型鉴定。

[0018] 根据本发明的另一个目的，本发明提供了上述小鼠模型在研究肝脏细胞P450酶与化合物致突变之间关系中的应用。

[0019] 本发明的肝脏细胞色素P450酶功能缺陷型gpt delta转基因小鼠模型与以往技术相比的有益效果如下：

[0020] 首先，与现有技术相比，本发明的肝脏细胞色素P450酶功能缺陷型gpt delta转基因小鼠模型是通过将肝脏特异性CPR KO小鼠和gpt delta转基因小鼠经一系列杂交和基因型筛选后得到的，其兼具两种亲代模型的特征，是研究肝脏P450酶与化合物致突变之间关系不可或缺的技术手段。

[0021] 其次，本发明的新模型还具备两种亲代模型的全部应用：

[0022] a.具有肝脏特异性CPR KO小鼠方面的应用：化合物是否经过肝脏CYP的代谢及作用；肝外其他组织脏器中CYP在化合物代谢中的作用；肝脏微粒体和线粒体中CYP在内源性和外源性化合物代谢上的迥异；肝脏HO酶功能改变后相关的代谢变化；还可用于研究能够在肝内CYP代谢，但在肝外组织脏器中产生毒性的化合物；用于研究肝脏CYP代谢后肝毒性增强的化合物。

[0023] b.具有gpt delta转基因小鼠方面的应用：由于λEG10DNA存在于小鼠的基因组中，因此可以对小鼠全身的组织脏器做基因突变检测和分析，可检测点突变和缺失突变；以及化合物对不同组织器官的致突变作用的比较研究。

[0024] 再次，这种新模型不仅具有肝脏细胞色素P450还原酶敲除小鼠和gpt delta转基因小鼠一切特征，而且还可以进行化合物代谢与致突变之间关系的研究，特别适合于那些能够被肝CYP代谢活化肝外组织器官形成突变的化合物的研究。

[0025] 另外，在新模型构建的过程中，本发明还克服了杂交不成功，子代不能存活或者基因型与预期不符的难题，这是因为肝脏特异性CPR KO小鼠和gpt delta转基因小鼠均是C57BL/6J品系小鼠，遗传背景较为一致，所以杂交成功几率较大；肝脏特异性CPR KO小鼠和gpt delta转基因小鼠繁殖力正常，杂交后形成的新基因型小鼠中cpr基因敲除机制与λEG10序列之间无交互作用，因此子代小鼠不仅可以存活而且繁殖力正常。而且，由于肝脏特异性CPR KO小鼠和gpt delta转基因小鼠杂交之后可能会出现许多不同的基因型小鼠，loxp本发明所采用的基因型筛选过程可以有效解决这一难题。进一步地，发明人在cpr 基因、loxp
cre基因和gpt基因可以稳定遗传的基础上，杂交小鼠得到cpr 基因和gpt基因纯合子loxp
小鼠之后再进行正常繁殖，这样就保证新模型小鼠中的cpr 基因、cre基因和gpt基因在每一代中稳定遗传。

附图说明

[0026] 图1为肝脏细胞色素P450酶功能缺陷型gpt delta转基因小鼠模型构建的流程图。

[0027] 图2为F1代小鼠基因型的PCR鉴定结果，A为有cre基因的小鼠，其中，cprloxp基因杂合子扩出500bp和600bp两条带，cre基因扩出300bp一条带，gpt基因杂合子扩出loxp360bp（F-R1）和967bp（F-R2）两条带；B中为无cre基因小鼠，其中，cpr 基因杂合子，扩出500bp和600bp两条带，gpt基因杂合子扩出360bp（F-R1）和967bp（F-R2）两条带。

[0028] 图3为F2代小鼠基因型的PCR鉴定结果，A为有cre基因的小鼠，其中，cprloxp基因纯合子扩出600bp一条带，cre基因扩出300bp一条带，gpt基因纯合子扩出967bp（F-R2）loxp一条带；B为无cre基因小鼠，cpr 基因纯合子扩出600bp一条带，gpt基因纯合子扩出
967bp（F-R2）一条带。

[0029] 图4为根据本发明一个实施方式中F2代的肝脏特异性CPR缺陷型的gpt deltaloxp转基因小鼠中主要脏器鉴定结果。A为cpr 基因和cre基因，B为gpt基因，其中967bp为基因型鉴定中应用的引物F-R2的PCR结果，而600bp是引物gpt-F和gpt-R鉴定结果；
L：肝脏；K，肾脏；St，胃；B，膀胱；Sp，脾脏。

具体实施方式

[0030] 下面结合实施例对本发明作进一步阐述，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求书中包括的变通和修改。

[0031] 本发明人经过深入而广泛的研究，构建了一种遗传稳定、表型稳定的肝脏细胞色素P450酶功能缺陷型gpt delta转基因小鼠模型，具体为：分别选用亲代雄性肝脏特异性CPR KO小鼠和亲代雌性gpt delta转基因小鼠进行杂交（F0代）。将F1代中的loxp+/- +/- +/- loxp+/+ +/- +/+cpr Cre gpt 基因型的雌鼠和雄鼠再进行杂交得到F2代cpr Cre gpt 和
loxp+/+ -/- +/+
cpr Cre gpt 基因型小鼠，即为本发明所需基因型的小鼠，此过程需要大量筛检。然loxp+/+ +/- +/+ loxp+/+ -/- +/+
后，将F2代中的cpr Cre gpt 雄鼠与cpr Cre gpt 雌鼠通过交配进行扩大繁
loxp+/+ +/- +/+ loxp+/+ -/- +/+
殖，从而产生更多F3代的cpr Cre gpt 和cpr Cre gpt 基因型小鼠。将F3代
loxp+/+ +/- +/+ loxp+/+ -/- +/+
的cpr Cre gpt 雄鼠与cpr Cre gpt 雌鼠再交配后，对F4代子鼠进行鉴定基
因型，结果表明所得子鼠中三种基因均可稳定遗传，即说明自F3代起即可正常繁育。整个制作过程均需要利用特异基因扩增引物进行基因型鉴定。

[0032] 具体实施过程：

[0033] 1.F0代杂交：

[0034] 亲代雄性肝脏特异性CPR KO小鼠和亲代雌性gpt delta转基因小鼠进行杂交，产生F1代。在F1代子代小鼠出生后4周剪脚趾鉴定基因型。

[0035] 1.1提取基因组DNA：

[0036] 将剪下的脚趾放入1.5mL的Ep管中，加入0.4mL含0.4mg/mL蛋白酶K的DNA消化缓冲液，然后放入水浴锅内，55℃过夜消化（消化时间在16h以上）。次日，待小鼠脚趾消化完全后，向每个Ep管中加入0.4mL酚氯仿（pH8.0），上下颠倒混合50-60次，15,000g4℃离心20分钟。取300μL上清置入另1个新的1.5mL Ep管中，向其中加入750μL冰无水乙醇，上下轻轻颠倒混合5-10次，12,000rpm离心5分钟。弃上清，加入冰75%乙醇200μL洗2次。将含有基因组DNA的Ep管倒扣在吸水纸上30分钟，干燥DNA。向Ep管中加入80～
100μL TE缓冲液，室温放置2小时，使DNA充分溶解。

[0037] 1.2PCR检测基因型：

[0038] 用提取出来的基因组做PCR，检测F1代小鼠基因型。

[0039] 1.2.1引物序列和产物大小：

[0040] Cprloxp基因引物：

[0041] 上游引物1（F）：5’-TACAATGGACCAGGCTCTGC-3’

[0042] 下游引物2（R）：5’-AAGAGGGACAAAGAGCACC-3’

[0043] PCR产物：纯合，600bp（含loxp），一条带；杂合500bp（不含loxp）和600bp（含loxp）各一条带。

[0044] Cre基因引物：

[0045] 上 游 引 物 3（F）：5’-GGATTT CCGTCTCTGGTGTAGC-3’ 下 游 引 物 4（R）：5’-CATTGCCCCTGTTTCACTATCC-3’

[0046] PCR产物：300bp，一条带。

[0047] gpt基因引物：

[0048] 上游引物5（F）：5’-GTTGTACTTCCAACCATGCCAAAG-3’

[0049] 下游引物6（R1）：5’-CAGAAATCATTCCAGGTCCTTGC-3’

[0050] 下游引物7（R2）：5’-GTTCATCTGCTTTATGGGCAAGAG-3’

[0051] 上游引物8（gpt-F）：5’-GCGCAACCTATTTTCCCCTCGA-3’

[0052] 下游引物9（gpt-R）：5’-TGGAAACTATTGTAACCCGCCTG-3’

[0053] PCR产物：纯合子，967bp（引物F和引物R1的PCR产物），一条带；杂合子为360bp（引物F和引物R1的PCR产物）和967bp（引物F和引物R2的PCR产物），两条带；野生型只有360bp（引物F和引物R1的PCR产物）一条带。gpt-F和gpt-R产物为600bp，主要鉴定gpt基因。

[0054] 1.2.2PCR程序设定：

[0055] Cprloxp和Cre基因PCR程序设定：94℃预变性3分钟，94℃30秒，64℃30秒，72℃30秒，共36个循环，然后72℃延伸7分钟，4℃保存。

[0056] gpt基因PCR程序设定：94℃预变性4.5分钟，94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟，共30个循环，然后72℃延伸5分钟，4℃保存。

[0057] 1.2.3PCR产物鉴定：

[0058] PCR结束后取10μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。扩增结果见图1所示，A示出了有cre基因小鼠的基因型，其中，第1泳道为100bpDNA ladder Marker，第2loxp泳道为cpr 基因杂合子，500bp和600bp，第3泳道为cre基因，300bp，第4、5泳道为gpt基因杂合子360bp（F-R1）和967bp（F-R2）。图1中B示出了无cre基因（300bp）小鼠的loxp
基因型，其中，第1泳道为100bp DNA ladder Marker，第2泳道为cpr 基因杂合子，500bp和600bp，第4、5泳道为gpt基因杂合子360bp（F-R1）和967bp（F-R2）。

[0059] 杂交后形成的F1代基因型有两种：cprloxp+/-Cre+/-gpt+/-和cprloxp+/-Cre-/-gpt+/-。

[0060] 2.F1代杂交：

[0061] 将F1代雄性和雌性cprloxp+/-Cre+/-gpt+/-小鼠交配，并对F2代子鼠按照上述方式loxp+/+ +/- +/+鉴定基因型。测定结果表明F2代子鼠出现基因型较多，筛选并保留cpr Cre gpt 和loxp+/+ -/- +/+
cpr Cre gpt 基因型小鼠。

[0062] 如图2所示，A示出了有cre基因小鼠的基因型，其中，第1泳道为100bp DNA loxpladder Marker，第2泳道为cpr 基因纯合子，600bp，第3泳道为cre基因，300bp，第4、5泳道为gpt基因纯合子，无360bp（F-R1）基因产物，只有967bp（F-R2）。图2中B示出了无cre基因（300bp）小鼠的基因型，其中，第1泳道为100bp DNA ladder Marker，第2泳道loxp
为cpr 基因纯合子，600bp，第4、5泳道为gpt基因纯合子，无360bp（F-R1）基因产物，只有967bp（F-R2）。

[0063] 3.F2代扩大繁殖：

[0064] 将F2代雄性cprloxp+/+Cre+/-gpt+/+小鼠和雌性cprloxp+/+Cre-/-gpt+/+小鼠交配，并loxp+/+ +/- +/+对F3代子鼠按照上述方式鉴定基因型。由于F2代子鼠中cpr Cre gpt 小鼠和
loxp+/+ -/- +/+
cpr Cre gpt 小鼠所占比例较小，因此需要将两种小鼠交配后扩大繁殖。

[0065] 4.F3代正常繁殖：

[0066] 将F3代雄性cprloxp+/+Cre+/-gpt+/+小鼠和雌性cprloxp+/+Cre-/-gpt+/+小鼠交配，并对F4代子鼠按照上述方式鉴定基因型。结果表明，自F3代起即可正常繁殖，三种基因均可稳定遗传。