SCX/HIC双功能混合模式色谱固定相及其制备方法

摘要

本发明公开了一种结构通式（I）所示的用于蛋白质分离的强阳离子交换/疏水混合模式色谱固定相，其中X为-OCH3或-OCH2CH3；R为，其中n=1~5；或，其中n=1~6；或PEG200-1000。本发明将胱氨酸通过硅烷偶联剂键合到表面带有羟基的活化硅胶表面上，再用DTT将硅胶表面的胱氨酸二硫键打开形成巯基化硅胶，然后再用H2O2将巯基氧化为磺酸基形成磺酸基键合硅胶衍生物，最后再与脂肪族醇（或芳香族醇或PEG等）反应而获得疏水/强阳离子交换色谱固定相。该固定相可以分别在疏水模式和强阳离子交换模式下实现对蛋白质的有效地分离，用一根装填这种双功能分离介质的色谱柱可代替两根常用的强阳离子交换和疏水色谱柱对蛋白质进行分离纯化。

权利要求

1.结构式（I）所示的疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相， 其中X为-OCH3或-OCH2CH3;

为硅胶；

R为 ，其中n=1~5；或 ，其中n=1~6。

2.权利要求1所述疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相的制备方法，包括以下步骤：（1）胱氨酸与硅烷偶联剂反应后加入硅胶反应得胱氨酸键合硅胶衍生物；

（2）将胱氨酸键合硅胶衍生物与DTT反应得半胱氨酸键合硅胶衍生物；

（3）将半胱氨酸键合硅胶衍生物与浓硫酸反应得到磺酸基键合硅胶衍生物；

（4）将磺酸基键合硅胶衍生物与脂肪族醇、芳香族醇，以及DIC、DMAP反应得疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相。

3.根据权利要求2所述疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）取1份重量的胱氨酸溶于碱性缓冲溶液中，调节pH至11.0，冰浴搅拌下，加入

0.5～1份重量的硅烷偶联剂，冰浴搅拌反应30 min，然后升温至60～80℃反应12～24小时，反应完毕，用冰醋酸调反应液pH至4.0～7.0，加入0.5～1份重量的硅胶，80～95℃下反应1.5～4小时，过滤、洗涤、干燥，即可得到胱氨酸键合硅胶衍生物；

（2）将1份重量的胱氨酸键合硅胶衍生物分散于pH为7～8的缓冲溶液中，加入0.1～

0.4份重量的DTT，室温搅拌反应1～3小时，过滤、洗涤、干燥即可得到半胱氨酸键合硅胶衍生物；

（3）将半胱氨酸键合硅胶衍生物分散于甲醇和25～35%的H2O2的混合溶液中，搅拌下滴入浓硫酸，使反应液呈弱酸性，在20～35℃下反应10～24小时，产物过滤、洗涤、干燥即可得到磺酸基键合硅胶衍生物；

（4）将1份重量的磺酸基键合硅胶衍生物分散于有机溶剂中，加入1.5～3份重量的脂肪族醇、芳香族醇，1.5～3份重量的DIC，0.1～0.3份重量的DMAP，室温搅拌24～48小时，产物过滤、洗涤、干燥即可得疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相。

4.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述碱性缓冲溶液为0.5mol/L的Na2CO3缓冲溶液，每克胱氨酸所需缓冲溶液的量为50～70mL。

5.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述硅烷偶联剂结构如下：

其中X为-OCH3或-OCH2CH3。

6.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所用的硅胶为全多孔硅胶小球，粒径为3～40µm，孔径为50～300�，且经过1:1盐酸活化3～7小时，然后洗至中性，100～160℃真空干燥10～24小时。

7.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所用缓冲溶液为1mol/L的Tris-HCl缓冲溶液，每克胱氨酸键合硅胶衍生物所需缓冲溶液的量为10～20mL。

8.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相的制备方法，其特征在于：步骤（3）中的氧化反应以甲醇与25～35%的H2O2体积比1:2～5的混合溶液再加入浓硫酸使之呈弱酸性为反应介质，每克半胱氨酸键合硅胶衍生物所需反应液体积为30～

40mL。

9.根据权利要求3所述疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所用有机溶剂为二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺，每克磺酸基键合硅胶衍生物所需有机溶剂的量为25～40mL。

10.权利要求1所述的疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相在蛋白分离纯化中的应用。

说明书

SCX/HIC双功能混合模式色谱固定相及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于蛋白质分离的高效液相色谱固定相，具体地说是一种疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相，本发明还涉及该混合模式固定相的制备方法和用途。

背景技术

[0002] 随着生物技术和生命科学的发展，无论重组蛋白质药物的生产还是蛋白质组学的研究都依赖于蛋白质的高效快速的分离技术。复杂样品的分析对分离科学提出了越来越高的要求，而发展新型高效分离材料、分离模式和高灵敏度的检测方法是解决该问题的有效途径之一。

[0003] 多维液相色谱(MDLC)是蛋白质组学等复杂样品分离分析的关键技术。通常的一根色谱柱只能利用一种分离模式对生物大分子进行分离纯化，如反相(RPLC)、疏水(HIC)、离子交换(IEC)和亲合(AFC)等。所以目前二维液相色谱(2DLC)的构建就需要两根作用力性质完全不同的色谱柱。“混合模式色谱”(Mixed mode chromatography, MMC)是利用蛋白质与固定相配基之间多种相互作用力进行分离的[姚善泾等，化工学报，2007，58:2169-2177；Zhao G F, et al.,J Biotech, 2009,144 :3–11; Mc Laughlin, et al., Chem Rev, 1989, 89：309-319]。混合保留机理的分离介质可提供两种以上的作用力用于溶质的分离。与单一色谱分离模式相比，MMC具有更高的选择性和吸附量。一些学者采用溴化氰法把脂肪胺和芳香胺交联在琼脂糖上, 合成疏水相互作用固定相。由于配体上带有胺基，使这种疏水固定相具有一定的离子交换性质，因此认为蛋白质的分离是静电相互作用和疏水相互作用的共同结果。1986年，Regnier小组首次合成了阴离子交换/疏水色谱混合模式的阴离子交换固定相[Kennedy L A, et al,J Chromatogr A, 1986, 359: 73-84] ;
随后Horvath小组报道了同样的结果[Melander W R, et al, J Chromatogr, 1989, 469:
3-27]。虽然现在MMC有反相和离子交换混合模式[Apfelthaler E, et al, J Chromatogr. A, 2008, 1191: 171-181]、反相和亲水混合模式[Liu X, et al. J Chromatogr. A,
2008, 1191: 83-89]、亲水和离子交换混合模式[Strege M A, et al., Anal Chem, 2000,
72: 4629-4633]等类型，但MMC仍以一种作用力为主，另一种力为辅，所以混合保留机理的色谱填料都是以一种分离模式为主的，即一种分离模式的分离较好，而另一种分离差，不能有效地用于蛋白质样品的二维分离，因此不能称之为二维色谱填料。

[0004] 虽然混合模式色谱柱已商品化，如GE公司的Capto MMC和Capto adhere，Pall公司的HEA，PPA和MEP色谱柱等，均是以离子交换为主，疏水作用为辅。所以，迄今为止, 尚未发现任何一种混合色谱填料可以分别用两种完全不同的功能（如IEC和HIC）对蛋白质进行二维液相分离，而且都能得到以某种单一分离模式进行分离时达到的分离效果。2009年发明人研究小组合成出了一种同时具有疏水和弱阳离子交换双功能基团的新型高效色谱分离介质[柯从玉等，科学通报，2008，53：614 ~ 616；Geng XD, et al., J Chromatogr A,2009, 1216: 3553-3562]。在高盐浓度下表现为疏水色谱的性质，可作为疏水色谱分离介质使用；而在低盐浓度条件下表现为离子交换色谱的性质，可作为离子交换色谱分离介质使用，并深入研究了在疏水和离子交换两种模式下蛋白质的混合保留机理[Liu P, et al., J Chromatogr. A, 2009, 1216: 7497–7504]。与相应的单机理色谱填料相比，表现出独特的选择性，在一定程度上提高了分离能力。在此基础上，利用阀切换技术，采用一根具有WCX-HIC的二维色谱柱构建了在线二维液相色谱分离系统，称之为单柱-二维液相色谱分离新技术[Geng XD, et al., J Chromatogr A, 2009, 1216: 3553-3562]。

[0005] 文献报道的2DLC中，多在第二维采用RPLC。但由于强的疏水性和有机环境，大多数蛋白质会失去活性甚至变性。而HIC和IEC分离条件温和，能更好地保持生物大分子的天然结构和生物活性，IEC配合HIC最适合蛋白质的分离纯化[Ascenjo J A, et al., J Mol Recog., 2004, 17: 236-247]。上述的IEC-HIC单柱二维色谱，最大程度地保证了整体蛋白的生物活性，实现了活性整体蛋白的快速分离纯化。

[0006] 目前单柱二维色谱新技术刚刚起步，该技术的实现主要依赖于双功能色谱填料的开发与制备。但是专门为分离蛋白质而设计的双功能色谱填料还很少，种类很有限。与常规的二维色谱不同的是，利用这种IEC/HIC双功能分离介质，可以在一根色谱柱上完成HIC-IEC或IEC-HIC二维色谱。该单柱二维色谱柱的优异功能表现在，可实现用一根该色谱柱代替两根常用的离子交换和疏水色谱柱的快速分离蛋白的新方法，这将大大降低生物大分子分离纯化所需要的分离介质的数量，从而大大降低生物大分子，特别是重组蛋白药物的生产成本，对生物大分子的分离纯化具有广阔的应用前景。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种新型疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相，以满足分别在离子交换模式和疏水模式下实现对蛋白质的高效分离要求。

[0008] 本发明的另一目的在于提供上述色谱固定相的制备方法。

[0009] 为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

[0010] 结构式（I）所示的疏水/强阳离子交换(HIC/SAC)混合模式色谱固定相， [0011]

[0012] 其中X为-OCH3或-OCH2CH3;

[0013] R为 ，其中n=1~5；或 ，其中n=1~6；或PEG200-1000。

[0014] 所述固定相通过将胱氨酸以硅烷偶联剂为桥梁键合到表面带有羟基的活化硅胶表面上，再用DTT将硅胶表面的胱氨酸二硫键打开形成巯基化硅胶，然后再用H2O2将巯基氧化为磺酸基形成磺酸基键合硅胶衍生物，最后再与脂肪族醇、芳香族醇或PEG等反应而获得疏水/强阳离子交换色谱固定相。其制备方法包括以下步骤：

[0015] （1）胱氨酸与硅烷偶联剂反应后加入硅胶反应得胱氨酸键合硅胶衍生物；

[0016] （2）将胱氨酸键合硅胶衍生物与DDT反应得半胱氨酸键合硅胶衍生物；

[0017] （3）将半胱氨酸键合硅胶衍生物与浓硫酸反应得到磺酸基键合硅胶衍生物；

[0018] （4）将磺酸基键合硅胶衍生物与脂肪族醇、芳香族醇或PEG反应得疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相。

[0019] 具体的说，制备方法如下：

[0020] （1）取1份重量的胱氨酸溶于一定体积的碱性缓冲溶液中，然后调节pH至11.0左右，冰浴搅拌下，缓慢滴入0.5～1份重量的硅烷偶联剂，滴加完毕，继续冰浴搅拌30 min，然后升温至60～80℃，反应12～24小时，反应完毕，溶液呈浅黄色，冷却至室温，用冰醋酸调反应液PH至4.0～7.0，加入0.5～1份重量的硅胶，80～95℃下反应1.5～4小时，过滤，依次用三次水、甲醇、丙酮、甲醇洗涤，所得固体50℃真空干燥5～15小时，即可得到胱氨酸键合硅胶衍生物。该步键合反应可表示为：

[0021]

[0022] 所用缓冲溶液为0.5 mol/L的Na2CO3缓冲溶液，每克胱氨酸所需缓冲溶液的量为50～70 mL；所用的硅烷偶联剂有如下结构：

[0023]

[0024] 其中X为-OCH3或-OCH2CH3；所用的硅胶为全多孔硅胶小球，粒径为3～40 µm，孔径为50～300�，且经过1:1盐酸活化3～7小时，然后洗至中性，100～160℃真空干燥10～24小时。

[0025] （2）将所述步骤（1）制备的1份重量的胱氨酸键合硅胶衍生物分散于pH为7～8的缓冲溶液中，加入0.1～0.4份重量的DDT，室温搅拌反应1～3小时，过滤，依次用三次水、甲醇各洗涤两遍，所得固体50℃真空干燥5～15小时，即可得到半胱氨酸键合硅胶衍生物。该步反应可表示为：

[0026]

[0027] 所用缓冲溶液为1 mol/L的Tris-HCl缓冲溶液，每克胱氨酸键合硅胶衍生物所需缓冲溶液的量为10～20 mL。

[0028] （3）将所述步骤（2）制备的半胱氨酸键合硅胶衍生物分散于甲醇和25～35%的H2O2的混合溶液中，搅拌下滴入适量浓硫酸，使反应液呈弱酸性（pH为3至6），在20～35℃下反应10～24小时，产物过滤。依次用三次水、甲醇各洗涤两遍，所得固体50℃真空干燥5～15小时，即可得到磺酸基键合硅胶衍生物。该步氧化反应可以表示为：

[0029]

[0030] 氧化反应以甲醇与25～35%的H2O2(体积比1:2～5)的混合溶液再加入适量浓硫酸使之呈弱酸性为反应介质，每克半胱氨酸键合硅胶衍生物所需反应液体积为30～40 mL。

[0031] （4）将所述步骤（3）制备的1份重量的磺酸基键合硅胶衍生物分散于有机溶剂中，加入1.5～3份重量的脂肪族醇(或芳香族醇或PEG等)、1.5～3份重量的DIC、0.1～0.3份重量的DMAP，室温搅拌24～48小时，产物过滤，依次用三次水、甲醇各洗涤两遍，所得固体50℃真空干燥5～15小时，即可得到疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相。该步反应可表示为：

[0032]

[0033] 其中X为-OCH3或-OCH2CH3;

[0034] R为 ，其中n=1~5；或 ，其中n=1~6；PEG200（400、600、800或1000）。

[0035] 所用有机溶剂为二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺，每克磺酸基键合硅胶衍生物所需有机溶剂的量为25～40mL。

[0036] 本发明的优点与积极效果：

[0037] （1）采用简单易行的方法首次合成了用于蛋白分离的疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相，该固定相稳定、合成成本低、使用寿命长、分离效果好。

[0038] （2）实验表明该疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相，可以在离子交换和疏水两种模式下分别实现对混合蛋白质的有效分离。

[0039] （3）用一根装填这种双功能分离介质的色谱柱可代替两根常用的强阳离子交换和疏水色谱柱对蛋白质进行分离纯化，用一根色谱柱就可实现IEC-HIC或HIC-IEC二维色谱分离。

附图说明

[0040] 图1为本发明实施例制备的疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相的IR光谱图；

[0041] 图2为本发明实施例制备的疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相在离子交换模式下对五种蛋白质的分离色谱图；

[0042] 图3为本发明实施例制备的疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相在疏水模式下对七种蛋白质的分离色谱图；

[0043] 图4为使用实施例1所制备的色谱填料装柱对八种蛋白进行分离色谱图。

具体实施方式

[0044] 本发明所述的一种用于蛋白质分离的疏水/强阳离子交换双功能混合模式色谱固定相，可以在离子交换和疏水两种模式下分别实现对混合蛋白质的有效分离。下面结合实施实例和附图，对本发明做进一步说明。应当理解，实施例仅限于说明本发明而不是对本发明的限定。

[0045] 实施例1

[0046] （1）取3.3g(约13.7 mmol)胱氨酸溶于150 mL 0.5 mol/L的Na2CO3缓冲溶液中，然后调节pH至11.0，加至250 mL三颈烧瓶中，冰浴搅拌下，缓慢滴入3 mL(约13.7 mmol) TM560，滴加完毕，继续冰浴搅拌30 min，然后升温至65℃，反应24小时，反应完毕，溶液呈浅黄色，冷却至室温，用冰醋酸调反应液pH至5.5，加入2 g硅胶，90℃下反应2小时，过滤，依次用三次水、甲醇、丙酮、甲醇洗涤，所得固体50℃真空干燥8小时，即可得到胱氨酸键合硅胶衍生物。取茚三酮乙醇溶液5.0 mL，加入少量胱氨酸硅胶衍生物，90℃加热5 min，发现溶液成紫色，说明胱氨酸已成功键合于硅胶表面上。

[0047] （2）取2.0 g胱氨酸键合硅胶衍生物分散于30 mL pH为8的Tris-HCl缓冲溶液中，加入0.2 g DDT，室温搅拌反应1.5小时，过滤，依次用三次水、甲醇各洗涤两遍，所得固体50℃真空干燥10小时，即可得到半胱氨酸键合硅胶衍生物。取半胱氨酸键合硅胶衍生物少许，加入5 mL茚三酮乙醇溶液中，溶液呈黄色，90℃加热5 min，黄色变淡，说明胱氨酸已被还原成巯基；另用硝普钠对巯基进行鉴定，其实验步骤为：

[0048] 溶液：I. 1.5 g 硝普钠溶于5 mL 2 mol/L盐酸溶液及95 mL甲醇中，加10mL 25%氢氧化铵溶液，过滤，即得；

[0049] Ⅱ. 2 g氰化钠溶于5ml水，用甲醇稀释至100 mL。

[0050] 取少许半胱氨酸键合硅胶衍生物均匀铺于透明玻璃般上，先喷溶液I、再喷溶液Ⅱ，结果发现硅胶表面呈淡红色，说明硅胶表面有巯基存在。

[0051] （3）取100 mL三颈烧瓶，依次加入2.0 g半胱氨酸键合硅胶衍生物，甲醇15 mL，35%的H2O2 50 mL，搅拌下滴入适量浓硫酸，使反应液呈弱酸性（pH为3），在30℃下反应24小时，产物过滤，依次用三次水、甲醇各洗涤两遍所得固体50℃真空干燥8小时，即可得到磺酸基键合硅胶衍生物。取少许磺酸基键合硅胶衍生物按步骤（2）用硝普钠进行实验，结果无红色出现，说明硅胶表面已无巯基存在，已被氧化。

[0052] （4）取100 mL三颈烧瓶，依次加入2.0 g磺酸基键合硅胶衍生物，50 mL DMF，4 mL苯甲醇、2 mL DIC、0.3 g DMAP，室温搅拌36小时，产物过滤，依次用三次水、甲醇各洗涤两遍，所得固体50℃真空干燥10小时，即可得到疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相。-1
所得固定相用傅里叶变换红外光谱仪进行测试，测试结果如图1所示，在1205cm 处有个强-1
的宽吸收峰，在1078cm 处有个吸收很强的峰，这两个峰部分重叠在一起，说明硅胶表面含- -1 -1
有-SO3 ；同时在794 cm 处有个尖峰，而且较强，说明苯环存在；在1631 cm 处有个尖峰，-1
说明羰基存在；在3486 cm 处有个较宽的吸收峰，说明亚胺基存在，综合以上信息，说明所-
合成填料配基同时含有-SO3 和苯环。

[0053] 发明人将苯甲醇换为PEG400和正丙醇重复上述实验，很容易获得疏水/强阳离子交换混合模式色谱固定相。

[0054] 实施例2

[0055] 使用实施例1所制备的色谱填料装柱，然后在强阳离子交换模式下对五种标准蛋白进行分离。分离条件：

[0056] 流动相：A液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH 6.5); B液: 20 mmol/L KH2PO4 + 1.0 mol/L NaCl (pH 6.5), 线性梯度洗脱，0→100%B，30 min；流速为1.0 mL/min，对myoglobin、RNase B、RNase A、cytochrome c、lysozyme等五种蛋白质实现了良好的分离（如图2所示1、2、3、4、5分别为myoglobin、RNase B、RNase A、cytochrome c、lysozyme）。

[0057] 实施例3

[0058] 使用实施例1所制备的色谱填料装柱，然后在疏水模式下对七种标准蛋白进行分离。分离条件：

[0059] 流动相: A液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH 7.0) + 3.0 mol/L (NH4)2SO4 (pH 7.0); B 液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH 7.0),线性梯度洗脱，0→100%B，30 min，流速为1.5 mL/min，对cytchrome c、myoglobin、RNase A、lysozyme、OVA、α-amylase、insulin等七种蛋白质实现了良好的分离(如图3所示1、2、3、4、5、6、7分别为cytchrome c、myoglobin、RNase A、lysozyme、OVA、α-amylase、insulin)。

[0060] 实施例4

[0061] 使用实施例1制备的色谱填料装柱，对八种蛋白进行分离，第一维在强阳离子交换模式下进行分离，收集强阳离子交换模式下未分开的组份，进行第二维疏水模式分离，如图4所示，经过第二维疏水模式分离后八种蛋白获得了完全分离。分离条件：

[0062] 流动相： A液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH 7.0)； B液: 20 mmol/L KH2PO4 (pH7.0) + 3.0 mol/L (NH4)2SO4 (pH 7.0)，梯度模式如图4虚线所示，流速为1.0 mL/min，对
1, HSA; 2, BSA; 3, insulin; 4, myoglobin; 5, RNase B; 6, α-chymotrypsin; 7, cytochrome c; 8, lysozyme等八种蛋白质实现了良好的分离。