一种制备多功能纳米载体的方法

摘要

本发明公开了一种通过退溶技术和层层组装修饰技术制备多功能纳米载体的方法。在搅拌条件下，在蛋白质的水溶液中,逐渐滴加不良溶剂乙醇，使蛋白质从溶液中逐渐析出并沉淀出来纳米粒子；加入戊二醛交联剂稳定纳米粒子结构后，用水洗涤；在纳米粒子表面交替沉积多层聚电解质膜，最外层沉积接枝有短链聚氧乙烯的聚电解质，得到聚电解质修饰的纳米粒子；进一步在聚氧乙烯的羧基端固定靶向分子适配体，从而得到多功能纳米载体。本发明制备方法简单、材料来源广泛、生产效率高，得到的纳米粒子具有良好的稳定性和靶向癌细胞等特点，有良好的应用前景。

权利要求

1.一种制备多功能纳米载体的方法，包括以下步骤：

1）将浓度为100mg/mL的蛋白质水溶液，调至pH=7；在磁力搅拌下，以0.5mL/min的速度加入乙醇，蛋白质水溶液与乙醇的体积比1：4，持续搅拌，然后加入0.8 % w/v 戊二醛交联剂，戊二醛与蛋白质质量比为1μg：1mg，反应6小时，离心洗涤，冻干，得到蛋白质纳米粒子；

2）将相对分子质量为2000的一端带有羧基、一端带有醛基的聚乙二醇加入10mg/mL的相对分子质量为15000的聚烯丙基胺或者相对分子质量为15000聚赖氨酸溶液中，保持二者的质量比为4.3：1，调节混合溶液pH值为8.5，反应6小时后透析，冻干，得到聚烯丙基胺-g-聚乙二醇-COOH或聚赖氨酸-g-聚乙二醇-COOH；

3）将聚阳离子、聚阴离子和聚烯丙基胺-g-聚乙二醇-COOH分别溶解于1M NaCl溶液中，各配成2mg/mL的聚电解质溶液；或者将聚阳离子、聚阴离子和聚赖氨酸-g-聚乙二醇-COOH分别溶解于1M NaCl溶液中，各配成2mg/mL的聚电解质溶液；

4）取步骤1）制备的蛋白质纳米粒子分散于水中，得到浓度为0.5% w/w蛋白质粒子悬浮液，于离心管中超声分散，离心除去上清液；往离心管中加入1mL三蒸水，超声分散；加入步骤3）配制的聚阳离子溶液0.5mL，孵化15min，期间轻微振荡离心管；离心去上清，水洗，得到吸附聚阳离子的蛋白质纳米粒子悬浮液，然后加入步骤3）配制的0.5mL聚阴离子溶液，孵化15min，期间轻微振荡，离心去上清，水洗；重复以上过程，在纳米粒子表面交替吸附带相反电荷的聚电解质，组装2个双层后得到表面为聚阴离子的核壳结构的纳米粒子；

5）将步骤4）所得的核壳结构的纳米粒子分散到 1mL三蒸水中，超声30s，加入0.5 mL步骤3）配制的聚烯丙基胺-g-聚乙二醇-COOH或者聚赖氨酸-g-聚乙二醇-COOH，反应

15min，期间轻微振荡，然后离心去上清，水洗，得到表面为聚烯丙基胺-g-聚乙二醇-COOH或聚赖氨酸-g-聚乙二醇-COOH的纳米粒子；

6）将步骤5）所得的微粒分散到 1mL三蒸水中，超声30s，加入0.5mL 1.5mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺溶液，孵化15min；再加入0.5mL 1.5mg/mL 的N-二甲胺基丙基-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐和6μg/mL适配体分子，反应20min，离心去上清，水洗，得到多功能纳米载体。

2.根据权利要求1所述的制备多功能纳米载体的方法，其特征是所说的蛋白质是牛血清白蛋白、人血清白蛋白或者明胶。

3.根据权利要求1所述的制备多功能纳米载体的方法，其特征是所说的聚阳离子是聚烯丙基胺盐酸盐、聚二烯丙基二甲基季铵盐、壳聚糖、胶原、聚赖氨酸、阳离子化葡聚糖、阳离子化聚丙烯酸酯或聚乙烯亚胺。

4.根据权利要求1所述的制备多功能纳米载体的方法，其特征是所说的聚阴离子是聚苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、硫酸软骨素、硫酸肝素、透明质酸、硫酸葡聚糖、DNA或羧甲基纤维素钠。

说明书

一种制备多功能纳米载体的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种制备多功能纳米载体的方法，尤其是利用退溶技术和层层组装修饰技术相结合制备多功能纳米微粒的方法。

背景技术

[0002] 药物纳米载体包括脂质体、胶束、纳米乳、聚合物纳米粒、固体脂质纳米粒、柔性囊泡，经表面修饰后可获得可控的生物学性质，进而在治疗或诊断上同时执行多种重要功能。 纳米技术对医学发展具有重要的推动作用，疾病诊断、预防和治疗的实际需求对纳米技术提出了获得更先进的药物传输系统和早期检测与诊断技术的期望，如早期诊断和预警；代谢产物中的生物标志物的发现及其微量或痕迹量或瞬间的样品量的检测技术；适于大量或批量的实用检测技术平台；靶向、缓释、可控的药物载体等。

[0003] 理想的纳米药物载体具备以下性质：①具有较高的载药量；②具有较高的包封率；③有适宜的制备及提纯方法；④载体材料可生物降解，毒性较低或没有毒性；⑤具有适当的粒径与粒形；⑥具有较长的体内循还时间。延长纳米粒在体内的循环时间，能使所载的有效成分浓度增大且循环时间延长，这样药物能更好地发挥全身治疗或诊断作用，增强药物在病灶靶部位的疗效。

[0004] 近年来，发展了许多新的纳米载体的制备方法，如多嵌段共聚物形成胶束或囊泡、脂质体、树枝状聚合物等。其中，由于蛋白的可降解性和生物相容性，以蛋白质为原料采用退溶法得到尺寸均匀可控的纳米粒子的方法被广泛应用。而这种方法制备的蛋白纳米粒子缺乏多功能和良好的稳定性，需要对其表面进行修饰以达到多功能性。而以胶体微粒为模板，利用层层自组装技术在模板粒子上组装聚合物超薄膜，具有结构和性能可控、易赋予各种独特功能等特点。尤其是各种活性基团为下一步接枝靶向分子奠定了基础。纳米微粒及其表面包覆的多层膜的渗透性以及包埋物质的释放性能可以通过环境条件如温度、离子种类和离子强度、pH值、溶液性质、光、电、声等进行控制。因此在药物控制释放、酶的包埋与催化反应、组织工程等领域显示了十分重要的应用前景。结合退溶技术和层层组装技术可以使充分发挥各自优势，制备出多功能纳米载体。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种通过退溶技术和层层组装修饰技术制备多功能纳米载体的方法。

[0006] 本发明的制备多功能纳米载体的方法，包括以下步骤：

[0007] 1）将浓度为100mg/mL的蛋白质水溶液，调至pH=7；在磁力搅拌下，以0.5mL/min的速度加入乙醇，蛋白质水溶液与乙醇的体积比1：4，持续搅拌，然后加入0.8 % w/v 戊二醛交联剂，戊二醛与蛋白质质量比为1μg：1mg，反应6小时，离心洗涤，冻干，得到蛋白质纳米粒子；

[0008] 2）将相对分子质量为2000的一端带有羧基、一端带有醛基的聚乙二醇加入10mg/mL的相对分子质量为15000的聚烯丙基胺或者相对分子质量为15000聚赖氨酸溶液中，保持二者的质量比为4.3：1，调节混合溶液pH值为8.5，反应6小时后透析，冻干，得到聚烯丙基胺-g-聚乙二醇-COOH或聚赖氨酸-g-聚乙二醇-COOH；

[0009] 3）将聚阳离子、聚阴离子和聚烯丙基胺-g-聚乙二醇-COOH分别溶解于1M NaCl溶液中，各配成2mg/mL的聚电解质溶液；或者将聚阳离子、聚阴离子和聚赖氨酸-g-聚乙二醇-COOH分别溶解于1M NaCl溶液中，各配成2mg/mL的聚电解质溶液；

[0010] 4）取步骤1）制备的蛋白质纳米粒子分散于水中，得到浓度为0.5% w/w蛋白质粒子悬浮液，于离心管中超声分散，离心除去上清液；往离心管中加入1mL三蒸水，超声分散；加入步骤3）配制的聚阳离子溶液0.5mL，孵化15min，期间轻微振荡离心管；离心去上清，水洗，得到吸附聚阳离子的蛋白质纳米粒子悬浮液，然后加入步骤3）配制的0.5mL聚阴离子溶液，孵化15min，期间轻微振荡，离心去上清，水洗；重复以上过程，在纳米粒子表面交替吸附带相反电荷的聚电解质，组装2个双层后得到表面为聚阴离子的核壳结构的纳米粒子；

[0011] 5）将步骤4）所得的核壳结构的纳米粒子分散到 1mL三蒸水中，超声30s，加入0.5 mL步骤3）配制的聚烯丙基胺-g-聚乙二醇-COOH或者聚赖氨酸-g-聚乙二醇-COOH，反应15min，期间轻微振荡，然后离心去上清，水洗，得到表面为聚烯丙基胺-g-聚乙二醇-COOH或聚赖氨酸-g-聚乙二醇-COOH的纳米粒子；

[0012] 6）将步骤5）所得的微粒分散到 1mL三蒸水中，超声30s，加入0.5mL 1.5mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺溶液，孵化15min；再加入0.5mL 1.5mg/mL 的N-二甲胺基丙基-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐和6μg/mL适配体分子，反应20min，离心去上清，水洗，得到多功能纳米载体。

[0013] 本发明中所说的蛋白质是牛血清白蛋白、人血清白蛋白或明胶；所说聚阳离子是聚烯丙基胺盐酸盐、聚二烯丙基二甲基季铵盐、壳聚糖、胶原、聚赖氨酸、阳离子化葡聚糖、阳离子化聚丙烯酸酯或聚乙烯亚胺；所说聚阴离子是聚苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、硫酸软骨素、硫酸肝素、透明质酸、硫酸葡聚糖、DNA或羧甲基纤维素钠。

[0014] 本发明的原理是：在蛋白质溶液中，逐渐滴加蛋白质的不良溶剂乙醇，蛋白质则会逐渐沉淀出来，形成微小的纳米粒子，通过化学交联使纳米粒子的结构得以稳定，从而得到在水中能够稳定存在的纳米粒子；通过层层组装可以提高纳米粒子的胶体稳定性，减少聚集及大颗粒的形成；最后通过组装接枝有聚乙二醇（PEG）的聚烯丙基胺-g-聚乙二醇-COOH，可以进一步减少粒子间的聚集，同时利用PEG端基的羧基在N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）/N-二甲胺基丙基-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）作用下，共价偶联靶向分子适配体，该适配体对癌细胞有高亲和性，可实现粒子的靶向传递。

[0015] 本发明的有益效果在于：

[0016] 本发明材料来源广泛，可控性好，灵活性好，适合多种多功能粒子的制备；得到的纳米微粒，具有良好的稳定性和靶向癌细胞等特点，有良好的应用前景。

附图说明

[0017] 图 1 是 牛血清白蛋白（BSA）纳米粒子的透射电镜照片。

[0018] 图 2 是 (PAH/PSS)2多层膜修饰BSA纳米粒子干燥后的透射电镜照片。

[0019] 图 3 是 (PAH/PSS)2/PAH-g-PEG-COOH多层膜修饰BSA纳米粒子干燥后的透射电镜照片。

[0020] 图 4 是 (PAH/PSS)2/PAH-g-PEG-AS1411（AS1411，一种适配体）多层膜修饰BSA纳米粒子干燥后的透射电镜照片。

[0021] 图 5 是(PLL/heparin)2/PLL-g-PEG多层膜修饰BSA纳米粒子干燥后的透射电镜照片。

具体实施方式

[0022] 以下结合实例进一步说明本发明，但这些实例并不用来限制本发明。

[0023] 实施例1

[0024] 1）将浓度为100mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）水溶液，调至pH=7；在磁力搅拌下，以0.5mL/min的速度加入乙醇，水溶液与乙醇的体积比1：4，持续搅拌，然后加入0.8% w/v戊二醛，使交联剂与BSA的质量比为1μg：1mg，反应6小时，离心洗涤3次，冻干，得到BSA纳米粒子，其透射电镜图见图1；

[0025] 2）将一定量的相对分子质量为2000的一端带有羧基、一端带有醛基的聚乙二醇加入10mg/mL的相对分子质量为15000的聚烯丙基胺溶液中，保持二者的质量比为4.3：1，调节溶液pH值为8.5，反应6小时后透析，冻干，得到聚烯丙基胺-g-聚乙二醇-COOH；

[0026] 3）将聚苯乙烯磺酸钠（PSS）、聚烯丙基胺盐酸盐（PAH）和聚烯丙基胺-g-聚乙二醇-COOH分别溶解于1M NaCl溶液中，各配成2mg/mL的溶液；

[0027] 4）取一定量步骤1）制备的蛋白质纳米粒子分散于水中，得到浓度为0.5% w/w蛋白质粒子悬浮液，于离心管中超声分散，离心除去上清液；往离心管中加入1mL三蒸水，超声分散；加入步骤3）配制的PAH溶液0.5mL，孵化15min，期间轻微振荡离心管；离心去上清，水洗，得到吸附PAH的蛋白质纳米粒子悬浮液，然后加入步骤3）配制的0.5mL PSS溶液，孵化15min，期间轻微振荡，离心去上清，水洗；重复以上过程，在BSA纳米粒子表面交替吸附PAH和PSS，组装2个双层后得到PSS为表面层的核壳结构的纳米粒子，其透射电镜图见图2；

[0028] 5）将步骤4）所得的微粒分散到 1mL三蒸水中，超声30s，加入0.5 mL 2mg/mL聚烯丙基胺-g-聚乙二醇-COOH水溶液，孵化15min，期间轻微振荡，然后离心去上清，水洗三次，得到包覆PEG的纳米粒子，其透射电镜图见图3；

[0029] 6）将步骤5）所得的纳米粒子分散到 1mL三蒸水中，超声30s，加入0.5mL 1.5mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺溶液，孵化15min；加入0.5mL 1.5mg/mL 的碳二亚胺和6μg/mL 氨基修饰的适配体，反应20min，离心去上清，水洗三次，得到多功能纳米粒子，其透射电镜图见图4。

[0030] 实施例2

[0031] 步骤同实例1，但在步骤2）中是将相对分子质量为2000的一端带有羧基、一端带有醛基的聚乙二醇加入10mg/mL的相对分子质量为15000聚赖氨酸溶液中，保持二者的质量比为4.3：1，调节混合溶液pH值为8.5，反应6小时后透析，冻干，合成的是聚赖氨酸-g-聚乙二醇-COOH；在步骤3）-5）中使用聚赖氨酸（PLL）溶液代替2mg/mL的PAH溶液，肝素（heparin）溶液代替PSS溶液，聚赖氨酸-g-聚乙二醇-COOH溶液代替聚烯丙基胺-g-聚乙二醇-COOH溶液，所得多功能纳米微粒的透射电镜图见图5。

[0032] 实施例3

[0033] 步骤同实例1，但在步骤3）和4）中使用聚赖氨酸溶液代替PAH溶液，肝素溶液代替PSS溶液。

[0034] 实施例4

[0035] 步骤同实例1，但在步骤3）和4）中使用壳聚糖溶液代替PAH溶液，硫酸软骨素溶液代替PSS溶液。

[0036] 实施例5

[0037] 步骤同实例1，但在步骤1中用人血清白蛋白代替牛血清白蛋白，在步骤3）和4）中使用聚乙烯亚胺溶液代替PAH溶液，透明质酸溶液代替PSS溶液。

[0038] 实施例6

[0039] 步骤同实例1，但在步骤1）中用明胶代替牛血清白蛋白，在步骤3）和4）中使用阳离子化葡聚糖溶液代替PAH溶液，DNA溶液代替PSS溶液。

[0040] 表1 是具有不同最外层的粒子在不同介质中的稳定性对比。

[0041] 表1

[0042]Top H2O PBS Medium（10%FBS）
BSA 214(0.06) 634(0.26) 247(0.18)
PSS 222(0.10) agglomeration 487(0.21)
PAH 699(0.19) agglomeration 443(0.24)
PAH(15)-g-PEG(2)9 267(0.18) 435(0.19) 267(0.19)
PAH(15)-g-PEG(2)25.6 290(0.11) 284(0.08) 253(0.23)
PAH-g-PEG-COOH41.7 296(0.12) 287(0.10) 260(0.20)
PAH-g-PEG41.7-Apt 290(0.12) 288(0.11) 265(0.19)
Heparin 527(0.11) Agglomeration 550(0.19)
PLL-g-PEG5.3 278 --- ---
PLL-g-PEG11.9 277 --- ---
PLL-g-PEG20.4 266 --- ---