一种剪切力-均匀电场联合刺激的细胞培养装置

摘要

本发明提供了一种剪切力-均匀电场联合刺激的细胞培养装置，包括动物细胞培养箱、蠕动泵、上游储液瓶、下游储液瓶、信号发生器和平板流动腔。蠕动泵、上游储液瓶与下游储液瓶通过硅胶管连接，构成培养液灌流系统，为细胞加载剪切力刺激；信号发生器用于为平板流动腔提供电信号，平板流动腔通过平板电极-平板电极系统给细胞加载均匀的电场刺激；平板流动腔，用于提供细胞生长所需基底，并通过与培养液灌流系统和信号发生器相连为平板电极上的细胞提供剪切力-均匀电场共同作用的环境。本发明建立了剪切力刺激联合均匀电场刺激下的细胞培养环境，弥补现有技术不能模拟体内细胞处于力、电刺激共同作用环境的缺陷，为促进细胞、组织的功能化培养奠定基础。

权利要求

1.一种剪切力-均匀电场联合刺激的细胞培养装置，其特征在于：装置包括动物细胞培养箱（1）、蠕动泵（2）、上游储液瓶（3）、下游储液瓶（4）、三通（5）、空气滤器（6）、平板流动腔（7）和信号发生器（8）；信号发生器（8）设置在动物细胞培养箱（1）外部，其余设置在动物细胞培养箱（1）内部；

所述的蠕动泵（2）、上游储液瓶（3）、下游储液瓶（4）、三通（5）和空气滤器（6）共同构成培养液灌流系统，用于为平板流动腔（7）内的细胞生长提供循环的细胞培养液从而施加剪切力；

所述的信号发生器（8）有正极和负极两个电极，正极通过电极线与平板流动腔（7）的下平板电极相连，负极通过电极线与平板流动腔（7）的上平板电极相连，为平板流动腔（7）内的细胞生长提供均匀电场刺激；

所述的循环培养液灌流系统各部分具体连接为：上游储液瓶（3）与下游储液瓶（4）之间通过三条硅胶管连接，第一条硅胶管上连接有蠕动泵（2），硅胶管两端分别连接在下游储液瓶（4）的底部位置和上游储液瓶（3）的顶部位置，下游储液瓶（4）中的细胞培养液在蠕动泵的作用下被输送到上游储液瓶（3）；第二条硅胶管的两端分别连接在下游储液瓶（4）上靠近顶部的位置和上游储液瓶（3）上靠近顶部的位置，以连通两个储液瓶中细胞培养液上方的气体环境，同时第二条硅胶管通过三通（5）连接空气滤器（6），使得上游储液瓶（3）、下游储液瓶（4）中细胞培养液上方气体环境与动物细胞培养箱（1）中气体环境相通；第三条硅胶管的一端连接在下游储液瓶（4）的顶部位置，另一端连接在上游储液瓶（3）上的位置低于第二条硅胶管连接端，当上游储液瓶（3）内细胞培养液的水平面到达第三条硅胶管的位置时，细胞培养液回流到下游储液瓶（4）中；上游储液瓶（3）底部通过硅胶管与平板流动腔（6）的流体入口连通；下游储液瓶（4）顶部通过硅胶管与平板流动腔（7）的流体出口连通，形成一个细胞培养液循环系统；

所述的动物细胞培养箱（1）两侧分别有一个与外界相通的孔道，用于通过信号发生器（8）的电极线和蠕动泵（2）的电源线，所述的孔道与电极线、电源线的连接处是密封的；

所述的平板流动腔（7）包括盖子、上平板电极、下平板电极、硅胶垫圈、底座、流体入口和流体出口；其中，盖子上开有长方形槽，便于安装流体入口和流体出口，并在盖子上开有凹槽，以便于固定上平板电极；上平板电极上两端有两个圆孔，分别用来固定流体入口和流体出口；底座上也开有长方形槽和凹槽，以便于观察细胞和固定下平板电极；盖子和底座的长边两侧均钻有螺孔，用于安装螺丝以固定平行板装置；

所述的底座放置在最下面，在底座的凹槽中固定下平板电极，在下平板电极上放置有长方形硅胶垫圈，硅胶垫圈上放置上平板电极，盖子放置在上平板电极上；上平板电极、硅胶垫圈及下平板电极共同围成流动腔；

流体入口和流体出口分别用生物胶固定在上平板电极两端的圆孔上，与所述流动腔相通；

所述的平板流动腔（7）的盖子、底座以及流体入口、流体出口的材质为有机玻璃、聚碳酸酯；

所述的平板流动腔（7）的上平板电极和下平板电极由导电玻璃组成，或者由导电玻璃和导电聚合物组成；

所述的导电玻璃，为掺杂氟的二氧化锡导电玻璃，或者氧化铟锡导电玻璃；

所述的导电聚合物，为聚吡咯、或者聚吡咯与聚乳酸的共聚物、或者聚吡咯与壳聚糖的共聚物，沉积或平铺于导电玻璃上；

储液瓶的材质为玻璃、塑料、聚碳酸酯；储液瓶的容量在0.2L-1.0L之间；

所述的剪切力为定常流或者脉动流的流体剪切力；

所述的上平板电极和下平板电极面积、大小相同，位置相对，能提供均匀的电场刺激；

所述的剪切力-均匀电场联合刺激为剪切力刺激和均匀电场刺激同时加载。

说明书

一种剪切力-均匀电场联合刺激的细胞培养装置

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞工程和组织工程领域，特别是将力学环境与均匀电场环境联合作用于细胞的培养装置。

背景技术

[0002] 在组织工程中，细胞、组织的体外功能化培养已成为组织工程的核心，也是形成组织工程产业的必要技术基础。而提供与体内细胞生存条件相近似的或尽可能有利的体外生长环境，对于细胞、组织的三维培养和功能化至关重要。其中，机械力、电场等物理影响因子在其中起着不可忽视的作用。

[0003] 力学环境对器官、组织、细胞甚至亚细胞等各个层次的生命活动都有重要的影响。如血流产生的剪切力，直接作用于内皮细胞，对内皮细胞形态、结构和功能均产生影响，有别于静态培养情况。内皮细胞在剪切力作用下细胞面积和长轴逐渐增加，长轴沿流向排列；
剪切力能激活内皮细胞整合素、钾离子、钙离子通道等将机械信号转化为生化信号，从而促进内皮细胞黏附及分泌等；剪切力能够诱导人内皮细胞凋亡抑制蛋白表达，从而抑制内皮细胞凋亡，发挥抗动脉粥样硬化作用。细胞间隙液流体剪切力可有助于骨细胞感知细胞周围机械环境变化，在机械力信号传导中发挥重要的作用，从而影响骨细胞活化、骨细胞矿物动态平衡和矿化等。牵张力可调节成骨细胞的增殖、分化、矿化，这种调节表现出对牵张力大小的依赖性。低剪切力可激活血管平滑肌细胞的C-fos和C-myc基因，调节转录，从而调节剪切力-血管平滑肌细胞的信号转导通路，进而影响血管平滑肌细胞的增殖和凋亡。

[0004] 内源性生理性电场广泛存在于活体组织器官，对细胞行为具有明显的影响，外源性的电场对细胞功能也具有明显的影响。一定强度的电场刺激可影响血管内皮细胞的增殖能力。用电容耦合电场治疗小鼠脊椎骨骨质疏松，发现电场可逆转骨质疏松。电场可促进体外培养的成骨细胞的增殖和骨生长因子如骨形成蛋白、β转化生长因子、胰岛素样生长因子II的形成。在心肌细胞培养过程中，加载脉冲直流电场，发现肌原纤维α-肌动蛋白、间隙连接蛋白43、α-肌球蛋白重链及β-肌球蛋白重链呈高水平表达，心肌细胞形态变为狭长且平行于电场方向排列，可见闰盘，相邻心肌细胞间建立缝隙连接，呈电-机械偶联。无电场作用时，心肌细胞上述特征标记表达很低。有实验显示，对缺血性心肌病心力衰竭患者在绝对不应期施加脉冲直流电场，可加强心室整体的收缩功能，提高射血分数。

[0005] 由以上可知，力刺激或电场刺激的分别加载，能够对细胞的生长产生影响。单一的力刺激和单一的电场刺激对于维持细胞正常功能、促进细胞分化及分泌等已经被广泛研究。目前已经有研究者开始考虑将这两种因素的综合影响应用在组织、细胞的培养中。已有的电场加载方式中，采用的电极体系多为针电极-针电极、棒电极-棒电极等，而有的电极体系不能提供均匀的电场环境，如针电极-板电极体系。在我们的先期研究中，在剪切力加载装置中采用了针电极-板电极，不能提供均匀电场和剪切力刺激同时加载。国内至今也还未发现可同时对细胞加载剪切力和均匀电场刺激的培养装置。本发明提供一种能同时加载剪切力刺激和均匀电刺激的细胞培养装置。

发明内容

[0006] 体外环境与体内环境相差甚远，模拟体内细胞的生长环境，促进细胞的生长和分化，对推动细胞和组织工程快速发展有深远的影响，本发明提供了一种剪切力-均匀电场联合刺激的细胞培养装置。

[0007] 本发明的目的是为了解决现有方法不能模拟体内细胞处于剪切力、电刺激同时存在的物理微环境的技术问题，提出一种剪切力-均匀电场联合刺激细胞培养装置，将细胞置于剪切力刺激与电刺激的联合作用下，模拟体内细胞生存环境，促进细胞的生长及分化，构建出具有特定功能的细胞或组织。

[0008] 本发明为一种剪切力-均匀电场联合刺激的细胞培养装置，包括动物细胞培养箱、信号发生器，以及设置在动物细胞培养箱内部的蠕动泵、上游储液瓶、下游储液瓶、三通、空气滤器和平板流动腔。

[0009] 蠕动泵、上游储液瓶、下游储液瓶、三通和空气滤器共同构成培养液灌流系统，用于为平板流动腔内的细胞生长提供循环的细胞培养液从而施加剪切力；信号发生器有正极和负极两个电极，正极通过电极线与平板流动腔的下平板电极相连，负极通过电极线与平板流动腔的上平板电极相连，为平板流动腔内的细胞生长提供均匀的电场刺激；平板流动腔，用于提供细胞生长所需的空间。

[0010] 培养液灌流系统各部分具体连接为：上游储液瓶与下游储液瓶之间通过三条硅胶管连接，第一条硅胶管上连接有蠕动泵，硅胶管两端分别连接在下游储液瓶的底部位置和上游储液瓶的顶部位置，下游储液瓶中的细胞培养液在蠕动泵的作用下被输送到上游储液瓶；第二条硅胶管的两端分别连接在下游储液瓶上靠近顶部的位置和上游储液瓶上靠近顶部的位置，以连通两个储液瓶中细胞培养液上方的气体环境，同时第二条硅胶管通过三通连接空气滤器，使得上游储液瓶、下游储液瓶中细胞培养液上方气体环境与动物细胞培养箱中气体环境相通，有利于维持细胞所需的湿度和pH值，而空气滤器可以防止细菌进入，保证细胞生长的无菌环境；第三条硅胶管的一端连接在下游储液瓶的顶部位置，另一端连接在上游储液瓶上的位置低于第二条硅胶管连接端，当上游储液瓶内细胞培养液的水平面到达第三条硅胶管的位置时，细胞培养液回流到下游储液瓶中。上游储液瓶底部通过硅胶管与平板流动腔的流体入口连通；下游储液瓶顶部通过硅胶管与平板流动腔的流体出口连通，形成一个细胞培养液循环系统。

[0011] 平板流动腔的结构包括盖子、上平板电极、下平板电极、硅胶垫圈、底座、流体入口和流体出口。其中，盖子上开有长方体槽，便于安装流体入口和流体出口，并在盖子上开有凹槽，以便于固定上平板电极。上平板电极电极上有两个圆孔，分别用来固定流体入口和流体出口。底座上开有凹槽用来固定下平板电极，底座上还开有长方体槽以便于观察细胞。盖子和底座的长边两侧均钻有螺孔，用于安装螺丝以固定平行板装置。

[0012] 底座放置在最下面，在底座的凹槽中固定下平板电极，在下平板电极上放置有长方形硅胶垫圈，硅胶垫圈上放置上平板电极，盖子放置在上平板电极上，通过凹槽固定上平板电极；上平板电极、硅胶垫圈及下平板电极共同围成流动腔。

[0013] 流体入口和流体出口分别用生物胶固定在上平板电极两端的圆孔上，与所述流动腔相通。

[0014] 剪切力-均匀电场联合作用细胞培养装置中平板流动腔的盖子、底座以及流体入口、流体出口的材质为有机玻璃、聚碳酸酯。平板流动腔的上平板电极和下平板电极由导电玻璃组成，或者由导电玻璃和导电聚合物组成，导电玻璃为掺杂氟的二氧化锡导电玻璃，或者氧化铟锡导电玻璃；导电聚合物为聚吡咯、或者聚吡咯与聚乳酸的共聚物、或者聚吡咯与壳聚糖的共聚物，沉积或平铺于导电玻璃上，导电聚合物沉积时控制膜的透明度，以便于细胞观察。储液瓶的材质为玻璃、塑料、聚碳酸酯，经由循环培养液灌流系统中空气滤器与动物细胞培养箱相通；储液瓶的容量在0.2L-1.0L之间。

[0015] 剪切力刺激为定常流或者脉动流的流体剪切应力。电刺激为恒定电压、脉冲电压或者微直流电。上平板电极和下平板电极面积、大小相同，位置相对，能提供均匀的电场刺激。

[0016] 打开蠕动泵和信号发生器，同时对平板电极上的细胞加载剪切力刺激和均匀的电场刺激，为细胞提供剪切力-均匀电场联合刺激的生长环境。

[0017] 剪切力-均匀电场联合作用细胞培养装置整个循环管路放置在动物细胞培养箱内，保证37℃、95％相对湿度和5％CO2的培养条件。

[0018] 整个细胞培养装置，包括循环培养液灌流系统和平板流动腔安装、拆卸方便，可消毒，消毒条件为130℃、3个大气压，时间1小时。

[0019] 本发明与现有技术相比具有如下优点：

[0020] (1)本发明提供剪切力刺激与均匀电场刺激的联合加载方式，更有利于细胞生长和发育。剪切力与均匀电场的联合作用可改善细胞生长环境，从而促进细胞生长，提高细胞活性；

[0021] (2)本发明的平板电极对平板电极体系，能对细胞、组织的生长提供均匀的电场刺激；

[0022] (3)本发明的剪切力-均匀电场联合刺激细胞培养装置能够实现对离体细胞同时加载剪切力力刺激和电场刺激，选用透明的有机玻璃、聚碳酸酯及导电玻璃材料，便于在培养过程中实时观察，且生物相容性好、操作简单；

[0023] (4)本发明既可用于细胞、组织培养，也可用于细胞、组织生长研究，并且对细胞体外扩增、细胞/支架复合物的体外构建及功能化有积极的意义；

[0024] (5)本发明操作简单，稳定性好，具有较好的应用前景。

附图说明

[0025] 图1为剪切力-均匀电场联合刺激细胞培养装置结构示意图；

[0026] 图2为平板流动腔的示意图；

[0027] 图3平板流动腔组装图及部分零件示意图。

[0028] 图中：

[0029] 1-动物细胞培养箱 2-蠕动泵 3-上游储液瓶 4-下游储液瓶[0030] 5-三通 6-空气滤器 7-平板流动腔 8-信号发生器[0031] 701-盖子 702-上平板电极 703-下平板电极 704-硅胶垫圈[0032] 705-底座 706-流体入口 707-流体出口

具体实施方式

[0033] 如图1所示的，本发明是一种剪切力-均匀电场联合刺激的细胞培养装置，包括动物细胞培养箱1、蠕动泵2、上游储液瓶3、下游储液瓶4、三通5、空气滤器6、平板流动腔7和信号发生器8。其中，蠕动泵2、上游储液瓶3、下游储液瓶4、三通5、空气滤器6和平板流动腔7通过若干硅胶管连接，共同构成培养液灌流系统，用于为细胞加载剪切力，提供细胞生长所需营养。本发明的培养液灌流系统和平板流动腔7都置于动物细胞培养箱1中，以保持适于细胞生长的温度、湿度和pH值。

[0034] 培养液灌流系统各部分间连接，如图1所示，上游储液瓶3和下游储液瓶4之间通过三条硅胶管相连，第一条硅胶管连接有蠕动泵2，用于将下游储液瓶4中的细胞培养液送到上游储液瓶3，该硅胶管的两端分别连接在下游储液瓶4底部位置与上游储液瓶3的顶部位置。第二条硅胶管用于连通两个储液瓶中的气体环境，该硅胶管的两端分别连接在下游储液瓶4上靠近顶部的位置与上游储液瓶3上靠近顶部的位置，同时这条硅胶管通过三通5连接空气滤器6，使下游储液瓶4和上游储液瓶3的气体环境与动物细胞培养箱1中气体环境相通，防止细菌进入。第三条硅胶管用于使上游储液瓶3中的细胞培养液回流到下游储液瓶4，该硅胶管的两端分别连接在下游储液瓶4的顶部，与上游储液瓶3底部与第二条硅胶管连接端之间位置。

[0035] 如图1所示，细胞培养液装入下游储液瓶4中，蠕动泵2为下游储液瓶4中的细胞培养液流到上游储液瓶3提供动力，在上游储液瓶3中细胞培养液的水平面到达与下游储液瓶4所连接的第三条硅胶管的位置时，细胞培养液才回流到下游储液瓶4中。

[0036] 上游储液瓶3和下游储液瓶4的材质可为玻璃、塑料、聚碳酸酯。

[0037] 如图1所示的动物细胞培养箱1用于提供细胞生长所需的温度、湿度和二氧化碳环境，动物细胞培养箱1两侧分别有一个与外界相通的孔道，用于通过信号发生器8的电极线和蠕动泵2的电源线。动物细胞培养箱1两侧的孔道与电极线、电源线连接处是密封的。

[0038] 如图1所示的信号发生器8的正极和负极通过电极线与平板流动腔7相连接。

[0039] 平板流动腔7如图2所示，包括盖子701、上平板电极702、下平板电极703、硅胶垫圈704和底座705，以及一个流体入口706和一个流体出口707。

[0040] 如图2所示的平板流动腔7是一个集剪切力刺激与均匀电场刺激为一体的平板流动腔，其上平板电极702通过电极线与信号发生器8的负极相连，下平板电极703通过电极线与信号发生器8的正极相连，流体入口706通过硅胶管与上游储液瓶3的底部连通，流体出口707通过硅胶管与下游储液瓶4顶部相连通。通过打开蠕动泵2和信号发生器8，同时对下平板电极703上的细胞加载剪切力刺激和均匀电场刺激。

[0041] 将接种细胞的下平板电极703放于底座705上，固定在底座705上的凹槽内。再将硅胶垫圈704放于下平板电极703上，硅胶垫圈704围成长方形，并与放在其上的上平板电极702，围成流动腔。流体入口706与流体出口707用生物胶固定在上平板电极702的两个圆孔上，下平板电极703和硅胶垫圈704所围成的流动腔连通。盖子701放置在最上面，流体入口706与流体出口707从盖子701上长槽内通过，安装方便。用螺丝将盖子701和底座705固定。底座705开有的长方体槽和凹槽，可便于细胞观察和固定下平板电极703，盖子701上开有的长方体槽和凹槽，可便于安装流体入口706和流体出口707及固定上平板电极702。

[0042] 为便于平板电极与电极线相连，上平板电极702和下平板电极703在平板流动腔7两侧分别突出盖子701和底座705一部分。

[0043] 盖子701、底座705以及流体入口706、流体出口707的材质可为有机玻璃、聚碳酸酯。上平板电极702和下平板电极703可由导电玻璃组成，或者导电玻璃和导电聚合物共同组成。导电玻璃为掺杂氟的二氧化锡导电玻璃或者氧化铟锡导电玻璃；导电聚合物为聚吡咯，或者聚吡咯与聚乳酸的共聚物，或者聚吡咯与壳聚糖的共聚物，可沉积或平铺于导电玻璃上。导电聚合物沉积时控制膜的透明度，以便于观察细胞。

[0044] 剪切力可为定常流和脉动流的流体剪切力。

[0045] 信号发生器8可提供的电刺激可为恒定电压、脉冲电压、微直流电。

[0046] 上平板电极702和下平板电极703面积相同，位置相对，能提供均匀的电场刺激。

[0047] 下面提供了应用本发明装置的实施例进一步说明本发明，但本发明不仅限于以下实施例。

[0048] 实施例1剪切力-均匀电场联合刺激的内皮细胞培养

[0049] 在无菌条件下把人脐静脉内皮细胞按1×105/cm2密度接种在下平板电极703上，如氧化铟锡导电玻璃，细胞贴壁第二天，将接种了内皮细胞的下平板电极703固定在有机玻璃底座705凹槽上，再将硅胶垫圈704放于下平板电极703上，然后将上平板电极702放于硅胶垫片上，有机玻璃盖子701放在最上面，将上平板电极702固定在有机玻璃盖子701的凹槽内。为便于平板电极与电极线相连，上平板电极702和下平板电极703在平板流动腔7两侧分别突出盖子701和底座705一部分。最后用螺丝将有机玻璃盖子701和有机玻璃底座705固定。

[0050] 将高压灭菌后的上游储液瓶3、下游储液瓶4通过三根硅胶管如图1所示相连。再将上游储液瓶3通过硅胶管与流体入口706相连，下游储液瓶4通过根硅胶管与流体出口707相连。在下游储液瓶4中加入培养基。

[0051] 将连接好的装置放入动物细胞培养箱1中，以保证细胞生长对温度、湿度及二氧化碳的要求。将连通下游储液瓶4底部和上游储液瓶3顶部的一根硅胶管放入蠕动泵2中。分别将蠕动泵2的电源线和信号发生器8的电极线穿过动物细胞培养箱1侧面的孔接入动物细胞培养箱内。信号发生器8分别与上平板电极702、下平板电极703相连。打开调节好的蠕动泵2和信号发生器8的电源，使得剪切力刺激和均匀电场刺激联合作用于内皮细胞，内皮细胞在剪切力和均匀电场双重刺激的环境下生长、发育，完成培养物的培育。

[0052] 施加的剪切力刺激为15dyne/cm2，信号发生器提供恒定电压为200mV，联合刺激时间为6h。

[0053] 实施例2剪切力-均匀电场联合刺激的成骨细胞培养

[0054] 在无菌条件下把成骨细胞按1×105/cm2密度接种在下平板电极703上，如沉积有导电聚吡咯的导电玻璃，细胞贴壁第二天，将接种成骨细胞的下平板电极703固定在有机玻璃底座705凹槽上，再将硅胶垫圈704放于下平板电极703上，然后将上平板电极702放于硅胶垫片上，有机玻璃盖子701放在最上面，将上平板电极702固定在有机玻璃盖子701的凹槽内。为便于平板电极与电极线相连，上平板电极702和下平板电极703在平板流动腔7两侧分别突出盖子701和底座705一部分。最后用螺丝将有机玻璃盖子701和有机玻璃底座705固定。

[0055] 将高压灭菌后的下游储液瓶4、上游储液瓶3通过三根硅胶管如图1所示相连。再将上游储液瓶3通过一根硅胶管与流体入口706相连，下游储液瓶4通过另一根硅胶管与流体出口707相连。在下游储液瓶4中加入培养基。

[0056] 将连接好的装置放入动物细胞培养箱1中，以保证细胞生长的对温度、湿度及二氧化碳的要求。将连通下游储液瓶4底部和上游储液瓶3顶部的一根硅胶管放入蠕动泵2中。分别将蠕动泵2的电源线和信号发生器8的电极线穿过动物细胞培养箱1侧面的孔接入动物细胞培养箱内。信号发生器8正电极线与下平板电极703相连，负电极线与上平板电极702相连。打开调节好的蠕动泵2和信号发生器8的电源，使得剪切力刺激和电刺激联合作用于成骨细胞，使成骨细胞在剪切力和均匀电场双重刺激的环境下生长、发育，完成培养物的培育。

[0057] 施加的剪切力刺激为13dyne/cm2，信号发生器提供的恒定电压为150mV，联合刺激时间为24h。

[0058] 实施例3剪切力-均匀电场联合刺激的心肌细胞培养

[0059] 在无菌条件下把1-3天龄SD大鼠乳鼠的心肌细胞按1×105/cm2密度接种在下平板电极703上，下平板电极采用如掺杂氟的二氧化锡的导电玻璃，预培养3天后，将接种心肌细胞的下平板电极703固定于聚碳酸酯底座705凹槽上，再将硅胶垫圈704放于下平板电极703上，然后上平板电极702放于硅胶垫片上，聚碳酸酯盖子701放在最上面，将上平板电极702固定在聚碳酸酯盖子701的凹槽内。为便于平板电极与电极线相连，上平板电极702和下平板电极703在平板流动腔7两侧分别突出盖子701和底座705一部分。最后用螺丝将聚碳酸酯盖子701和聚碳酸酯底座705固定。

[0060] 将高压灭菌后的上游储液瓶3、下游储液瓶4通过三根硅胶管如图1所示相连。再将上游储液瓶3通过一根硅胶管与流体入口706相连，下游储液瓶4通过另一根硅胶管与流体出口707相连。在下游储液瓶4中加入培养基。

[0061] 将连接好的装置放入动物细胞培养箱1中，以保证细胞生长对温度、湿度及二氧化碳的要求。将连通下游储液瓶3底部和上游储液瓶4顶部的一根硅胶管放入蠕动泵2中。分别将蠕动泵2的电源线和信号发生器8的电极线穿过动物细胞培养箱1侧面的孔接入动物细胞培养箱内。信号发生器8电极线分别与下平板电极703、上平板电极702相连。打开调节好的蠕动泵2和信号发生器8的电源，使得剪切力刺激和均匀电场刺激联合作用于心肌细胞，使心肌细胞在剪切力和均匀电场双重刺激的环境下生长、发育，完成培养物的培育。

[0062] 施加的剪切力刺激为10dyne/cm2，信号发生器提供脉冲电压，幅值为100mV，频率为1Hz，脉冲宽度为10ms，联合刺激时间为12h。

[0063] 上述剪切力刺激、均匀电场刺激参数的设置，材料的改变是根据所培养的细胞特点不同进行选择的。