一株产二甲苯单加氧酶的恶臭假单胞菌及其应用

摘要

本发明提供了一株产二甲苯单加氧酶菌株——恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZJB-LLJ，及其在微生物发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学430072，保藏编号CCTCC No：M 2011395，保藏日期2011年11月13日。本发明的有益效果主要体现在：提供了一种产二甲苯单加氧酶的新菌株，通过该菌株可以制备药物中间体5-甲基吡嗪-2-羧酸。使用本发明生产5-甲基吡嗪-2-羧酸，反应条件温和，节能，环保，更重要的是过程简单，产物提取容易，具有良好的工业应用前景。

权利要求

1.一株产二甲苯单加氧酶的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ZJB-LLJ，其保藏编号为CCTCC No：M 2011395，保藏日期为2011年11月13日。

2.如权利要求1所述的恶臭假单胞菌ZJB-LLJ在微生物发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以恶臭假单胞菌ZJB-LLJ经产酶培养获得的含酶菌体细胞为催化剂，以2,5-二甲基吡嗪为底物，在28~32℃、pH7.0~8.0下进行转化反应24~48小时，于反应液中获得所述5-甲基吡嗪-2-羧酸。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述产酶培养在以对二甲苯为唯一的碳源和能源的产酶培养基中进行，于28~32℃、pH7.0~8.0下培养12~24小时。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述产酶培养基质量组成如下：(NH4)2SO4

1.0~3.0 g/L；Na2HPO4·2H2O 1.0~5.0 g/L；KH2PO4 0.5~2.0 g/L；NaCl 1.0~5.0 g/L；

MgCl2·6H2O 0.1~0.5 g/L；CaCl2·2H2O 1.0~5.0 g/L；FeCl3·6H2O 0.1~0.5 g/L；ZnSO4·7H2O

0.05~0.2 g/L；MnCl2·4H2O 0.05~0.1 g/L；H3BO3 0.1~0.5 g/L；CaCl2·6H2O 0.1~0.3 g/L；CuCl2·2H2O 0.05~0.02 g/L；NiCl2·6H2O 0.01~0.03 g/L；Na2MoO4·2H2O 0.01~0.05 g/L；EDTA·Na2·2H2O 3.0~8.0 g/L；FeSO4·7H2O 1.0~3.0 g/L，对二甲苯0.5~2 mL/L，溶剂为水，pH 6.8~7.2。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物的初始浓度为2～6g/L。

说明书

一株产二甲苯单加氧酶的恶臭假单胞菌及其应用

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及一株产二甲苯单加氧酶菌株——恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZJB-LLJ，及其在微生物发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸中的应用。(二)背景技术

[0002] 5-甲基吡嗪-2-羧酸(5-Methylpyrazine-2-carboxylic acid)是一种米白色固体结晶，分子式为C6H6N2O2、分子量138.12、熔点166～169℃、外观淡黄色晶体、具有刺激性气味，暴露在空气中会缓慢氧化，由棕色油状物变为棕黑色粘稠状固体，需真空密封保存。5-甲基吡嗪-2-羧酸在医药工业领域有着广泛的用途，主要用于合成第二代磺崛类降血糖药物格列吡嗪、新型抗高血压药物阿西莫司以及抗结核药物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲醋等，因此对5-甲基吡嗪-2-羧酸的研究具有重要的实际应用价值。

[0003]

[0004] 5-甲基吡嗪-2-羧酸的化学合成主要有以下工艺(陈炳和等，化学试剂，2008，30(11)：869-870；韩光等，2000，17(3)：208-210)：

[0005] (1)氧化、氯化、水解、再氧化：用过氧化氢和乙酸酐把2，5-二甲基吡嗪氧化为单一的氮氧化物再经单甲基侧链氯化水解生成5-甲基-2-羟甲基吡嗪，再用高锰酸钾水溶液氧化5-甲基一2-羟甲基吡嗪得5-甲基吡嗪-2-羧酸，总收率为18％。

[0006] (2)氯化、酞化、水解、氧化：在氮气的保护下，用引发剂过氧化苯甲酞(BPO)引发N-氯代丁二酞亚胺(NCS)后，再对2，5一二甲基吡嗪进行氯化反应，可得到5-甲基-2-氯甲基吡嗪再与无水乙酸钠在无水乙醇中，在氮气保护下回流，可得到乙酞氧甲基衍生物，接着用固体氢氧化钠处理，反应生成5-甲基-2-羟甲基吡嗪，再用高锰酸钾氧化，在低温下用浓盐酸调pH值至5-甲基吡嗪-2-梭酸的等电点，再用冰水洗涤沉淀，用五氧化二磷真空干燥得5-甲基吡嗪-2-羧酸。总收率47％。

[0007] (3)环合、氧化、酸化和脱羧：以丙酮酸和邻苯二铵为基本原料，在催化剂焦亚硫酸钠的存在下环合，再经无机氧化剂氧化，用硫酸酸化、脱羧，在pH1.5-4.0用丁酮萃取分离，结晶、甩干、烘干、粉碎可得到5-甲基吡嗪-2-羧酸。

[0008] (4)分子间环合：二氨基顺丁烯二睛和丙酮醛经过环合反应生成二氰基吡嗪衍生物，再经过酸水解反应，生成5-甲基吡嗪-2，3-二羧基吡嗪，脱羧得到5-甲基吡嗪-2-羧酸及5-甲基吡嗪-3-羧酸两种异构体的混合物。

[0009] (5)N-溴代丁二酰亚一步氧化法：在干燥的反应瓶中加入2，5-二甲基吡嗪、乙酸乙酯、N-溴代丁二酰亚胺，置反应物于红外灯间歇照射10h，检测反应结束，然后蒸出乙酸乙酯，剩余物中加10％氢氧化钠至溶液pH8，用50mL氯仿萃取，分出水相，水相减压蒸至基本干，用浓盐酸调pH至2，用丁酮萃取3次，合并有机相，蒸除溶剂，残余物加50mL水重结晶得黄色粉末5-甲基吡嗪-2-羧酸，收率84％。

[0010] (6)环烷酸钴一步氧化法：此反应采用环烷酸钴空气氧化法，即在常压下，向2，5-二甲基吡嗪和环烷酸钴的混合体系中通入空气，加热回流。将石油醚加入装有搅拌器、进气管、回流冷凝管和温度计的四口烧瓶中，然后加入2，5-二甲基吡嗪，再加入环烷酸钴，搅拌均匀后为紫红色溶液，通入空气氧化，加入TEBAC0，再加入30％的氢氧化钠溶液，强力搅拌加热，溶液成灰揭色。当反应物开始回流后，加偶氮二异丁睛引发反应，回流温度控制在
76℃左右，反应时间为5h。停止加热后，静置分层，上层为透明棕色油层，下层为灰棕色不透明且含有颗粒状固体的溶液。倒出后振荡分液，上层褐色胶状物，下层为粉色透明溶液。
于上层中加入11％的氢氧化钠溶液，振荡摇匀后，过滤除杂质，滤液为黄棕色，与下层溶液合并，通氮气减压浓缩，然后用冰水冷至0～5℃，放置2小时，加浓盐酸调pH值为2.0，在
0℃放置2h，过滤，用冰水洗涤，滤饼用五氧化二磷干燥，再用丁酮溶解，呈棕色溶液，用活性炭脱色过滤，呈黄色溶液，通氮气减压蒸除大部分溶剂，剩余物充氮密封，在0℃左右静止过夜，有淡黄色晶体析出，过滤得淡黄色晶体，用五氧化二磷真空千燥，得5-甲基吡嗪-2-羧酸，收率36.53％。

[0011] (7)用KMnO4一步氧化法：该方法以2，5-二甲基吡嗪为原料，在抑制剂的存在下，加入KMnO4溶液反应1～10小时，热过滤除去MnO2的滤液经减压浓缩，用无机酸酸析，过滤得到部分产品5-甲基吡嗪-2-羧酸，滤液再用萃取剂萃取经减压蒸馏，再得到部分产品5-甲基吡嗪-2-羧酸。

[0012] 以上方法具有生产成本高，过程复杂，产率低，产物难分离，污染高等缺点。

[0013] 微生物法制备5-甲基吡嗪-2-羧酸具有反应条件温和，产物单一，区域选择行高等优点，代表着绿色化学的发展方向。(三)发明内容

[0014] 本发明的目的是提供一株能高区域选择性的催化单加氧反应的产二甲苯单加氧酶的菌株，及其在微生物发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸中的应用，以克服化学合成工艺的不足。

[0015] 本发明采用的技术方案是：

[0016] 一株产二甲苯单加氧酶菌株——恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZJB-LLJ，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学430072，保藏编号CCTCC No：M 2011395，保藏日期2011年11月13日。

[0017] 该菌株是本申请发明人从来自杭州附近、台州、东阳、金华等地100余份土样中，经初筛、复筛及分离纯化而得到的能高效的氧化2，5-甲基吡嗪制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的新菌株。根据它的生理生化特征，鉴定为Pseudomonas putida。

[0018] 该菌株的主要特征如下：

[0019] 菌落形态：于30℃在LB培养基平板培养24h，菌落呈圆形，直径，无褶皱，边缘光滑，有光泽，乳黄色，半透明。

[0020] 细胞形态：呈现椭球形，长约0.8μm，直径约为0.4μm。

[0021] 生理生化特性：对碳源阳性利用项目：α-D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、甘油、D-果糖-6-PO4、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、D-半乳糖醛酸、D-葡糖酸、D-葡糖醛酸、葡糖醛酰胺、粘液酸、奎尼酸、D-糖二酸、L-乳酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、L-苹果酸、γ-氨基丁酸、β-羟基-D，L丁酸、丙酸、乙酸。对碳源阴性利用项目：糊精、D-麦芽糖、D-海藻糖、D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、D-松二糖、水苏糖、D-棉子糖、α-D-乳糖、D-蜜二糖、β-甲基-D糖苷、D-水杨苷、N-乙酰-D葡糖胺、N-乙酰-β-D甘露糖胺、N-乙酰-D半乳糖胺、N-乙酰神经氨酸、D-半乳糖、3-甲基葡萄糖、L-海藻糖、L-鼠李糖、肌苷、D-山梨糖醇、D-甘露醇、D-阿糖醇、肌醇、D-葡萄糖-6-PO4、D-天冬氨酸、D-丝氨酸、凝胶、甘氨酰-L-脯氨酸、果胶、L-半乳糖酸内酯、p-羟基-苯基乙酸、D-乳酸甲酯、D-苹果酸、溴琥珀酸、吐温40、α-羟基丁酸、α-酮基-丁酸、乙酰乙酸。对化学物质的阳性敏感项目：pH 6、1％NaCl、1％乳酸钠、亚碲酸钾、丁酸钠。对化学物质的阴性敏感项目：pH 5、4％NaCl、8％NaCl、梭链孢酸、D-丝氨酸、醋竹桃霉素、利福霉素SV、二甲胺四环素、林可霉素、盐酸胍、硫酸四癸钠、万古霉素、四唑紫、四唑蓝、萘啶酸、氯化锂、噻肟单酰胺菌素、溴酸钠。

[0022] 该菌株16SrDNA扩增产物的实际长度为1529bp，序列如下：

[0023] AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGGGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTT[0024] 本发明还涉及所述的恶臭假单胞菌ZJB-LLJ在微生物发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸中的应用。

[0025] 具体的，所述应用为：以恶臭假单胞菌ZJB-LLJ经产酶培养获得的含酶菌体细胞为催化剂，以2，5-二甲基吡嗪为底物，在28～32℃、pH7.0～8.0下进行转化反应24～48小时，于反应液中获得所述5-甲基吡嗪-2-羧酸。反应结束后反应液离心去上清用高效液相色谱检测可检测到产生所诉5-甲基吡嗪-2-羧酸。

[0026] 因为为产酸反应，为提高反应产率，发酵反应过程需用NaOH溶液调节pH在7.0～8.0之间。可以使反应尽快完成且产率最高。

[0027] 所述产酶培养在以对二甲苯为唯一的碳源和能源的产酶培养基中进行，于28～32℃、pH7.0～8.0下培养12～24小时。为防止对二甲苯对菌株的毒性影响，对二甲苯以蒸汽的形式为菌株生长提供碳源为佳，具体做法为，在玻璃摇瓶中间焊接一玻璃管子，将对二甲苯加入到中间的小管子中。

[0028] 通常的，在产酶培养之前，菌株需用常规适用恶臭假单胞菌的种子培养液进行扩大培养得到种子液，种子液再以5％体积比的接种量接种于产酶培养基中。所述的种子培养基浓度组成可如下：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl5g/L，溶剂为水。

[0029] 所述产酶培养基以对二甲苯为唯一的碳源和能源，还可添加其他常见微量元素，本发明中产酶培养基质量组成可如下：(NH4)2SO4 1.0～3.0g/L；Na2HPO4·2H2O 1.0～5.0g/L；KH2PO4 0.5～ 2.0g/L；NaCl 1.0 ～5.0g/L；MgCl2·6H2O 0.1 ～0.5g/L；CaCl2·2H2O1.0～5.0g/L；FeCl3·6H2O 0.1～0.5g/L；ZnSO4·7H2O 0.05～0.2g/L；MnCl2·4H2O 0.05～
0.1g/L；H3BO3 0.1～0.5g/L；CaCl2·6H2O 0.1～0.3g/L；CuCl2·2H2O 0.05～0.02g/L；
NiCl2·6H2O 0.01～ 0.03g/L；Na2MoO4·2H2O 0.01 ～0.05g/L；EDTA·Na2·2H2O 3.0 ～
8.0g/L；FeSO4·7H2O 1.0～3.0g/L，对二甲苯0.5～2mL/L，溶剂为水，pH 6.8～7.2。为防止对二甲苯对菌株的毒性影响，对二甲苯以蒸汽的形式为菌株生长提供碳源，具体做法是在玻璃摇瓶中间焊接一玻璃管子，对二甲苯是加入到中间的小管子中。

[0030] 具体的，所述产酶培养基质量组成如下：(NH4)2SO4 2.0g/L；Na2HPO4·2H2O 2.5g/L；KH2PO4 1.0g/L；NaCl 3.0g/L；MgCl2·6H2O 0.4g/L；CaCl2·2H2O 2.5g/L；FeCl3·6H2O0.25g/L；ZnSO4·7H2O 0.1g/L；MnCl2·4H2O 0.09g/L；H3BO3 0.3g/L；CaCl2·6H2O 0.2g/L；
CuCl2·2H2O 0.01g/L；NiCl2·6H2O 0.02g/L；Na2MoO4·2H2O 0.03g/L；EDTA·Na2·2H2O 5.0g/L；FeSO4·7H2O 2.0g/L，对二甲苯1mL/L，溶剂为水，pH 7.0。为防止对二甲苯对菌株的毒性影响，对二甲苯以蒸汽的形式为菌株生长提供碳源，具体做法是在玻璃摇瓶中间焊接一玻璃管子，对二甲苯加入到中间的小管子中。

[0031] 所述转化反应是直接在前述产酶培养基中进行，即在产酶培养后添加底物进行转化反应，底物的初始浓度为2～6g/L。

[0032] 本发明的有益效果主要体现在：提供了一种产二甲苯单加氧酶的新菌株，通过该菌株可以制备药物中间体5-甲基吡嗪-2-羧酸，摇瓶发酵培养产物积累为1.4g/L，产率为40％。使用本发明生产5-甲基吡嗪-2-羧酸，反应条件温和，节能，环保，更重要的是过程简单，产物提取容易，具有良好的工业应用前景。
(四)附图说明

[0033] 图1为富集及发酵培养示意图；

[0034] 图2为菌株ZJB-LLJ单菌落形态(A)和扫描电镜下的形态(B)；

[0035] 图3为菌株16S rDNA序列PCR扩增argrose电泳图；

[0036] 图4为ZJB-LLJ菌株与NCBI上的菌株的进化树分析结果；

[0037] 图5为发酵培养过程中底物，产物的浓度变化及菌体量的变化；●表示底物的浓度变化，■表示产物的浓度变化，▲表示菌体量的变化，表示pH的变化；

[0038] 图6为不同诱导物培养过程中产物浓度的变化；●表示对二甲苯，▲表示间二甲苯，■表示二甲苯；

[0039] 图7为底物加入时间对反应的影响；

[0040] 图8为不同pH培养基对反应的影响；

[0041] 图9为恒定的不同pH发酵过程中产物变化；■pH6，●pH7，▲pH8，◆pH10。(五)具体实施方式

[0042] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0043] 实施例1：微生物的筛选、鉴定

[0044] 1.微生物的筛选

[0045] 菌种保藏：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH7.0；

[0046] 种子液培养基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，pH 7.0；

[0047] 发酵产酶培养基、菌种富集培养基：

[0048] (NH4)2SO4 2.0g/L；Na2HPO4·2H2O 2.5g/L；KH2PO4 1.0g/L；NaCl 3.0g/L；MgCl2·6H2O 0.4g/L；CaCl2·2H2O 2.5g/L；FeCl3·6H2O 0.25g/L；ZnSO4·7H2O 0.1g/L；
MnCl2·4H2O 0.09g/L；H3BO3 0.3g/L；CaCl2·6H2O 0.2g/L；CuCl2·2H2O 0.01g/L；NiCl2·6H2O
0.02g/L；Na2MoO4·2H2O 0.03g/L；EDTA·Na2·2H2O 5.0g/L；FeSO4·7H2O 2.0g/L，对二甲苯
1mL/L，溶剂为水，pH 7.0。对二甲苯以蒸汽的形式为菌株生长提供碳源，具体做法是在玻璃摇瓶中间焊接一玻璃管子，1ml对二甲苯是加入到中间的小管子中。

[0049] 从化工厂的排污口附近，菜园果园植物丛采集土样，同时土样来源的地理分布的差异也会给筛选工作带来更多成功的机会。因而从杭州附近、台州、东阳、金华等地采集得到了共100余份土样用以菌种筛选。具体过程如下：

[0050] 取少许土样于发酵产酶培养基中150r/min温度为30℃的摇床上经过两次富集培养，经过稀释涂布的选取单菌落转接至试管斜面并编号于生化培养箱中培养培养1天。再从斜面转接至摇瓶发酵产酶培养基中，以对二甲苯蒸汽诱导培养12h后加入100μL 2，
5-二甲基吡嗪。培养2天后，取样离心，过膜处理后用高效液相色谱检测(柱子：C18柱，乙腈∶水＝3∶7，流速1mL/min，检测波长275nm，柱温40℃)。选择有转化活性的菌株，最终选择出一株转化活性最高的菌株(编号为ZJB-LLJ，即CCTCCNO：M 2011395)做后续的菌种鉴定及摇瓶发酵条件优化实验。

[0051] 2.微生物菌株编号为“ZJB-LLJ”菌株的生理生化鉴定

[0052] 从土壤中经过富集培养然后用稀释涂布法，经过高效液相色谱检测筛选得到三株可以将2，5-二甲基吡嗪氧化为5-甲基吡嗪-2-羧酸的菌株，从中选出一株氧化活性最强的标号为ZJB-LLJ如图2(A)，菌落形态较小，圆形，边缘光滑，有光泽，乳黄色，半透明。通过电子显微镜扫描得到细胞形态呈现细胞呈现椭球形，长约0.8μm，直径约为0.4μm图2(B)。

[0053] 利用Biolog(GEN III)自动微生物鉴定系统对菌株ZJB-LLJ进行了94种表型测试(Biolog微生物自动鉴定专用试剂及培养基等购自Biolog公司)，包括71种碳源利用情况检测以及23种化学敏感性检测：将菌株接种于BUG平板培养基，33℃恒温培养2天，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液(IF-A)混合，制成菌悬液，用浊度计调整至95％T。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在Biolog GEN III微孔鉴定板的各孔中，每孔100μL。
将微孔鉴定板放在33℃培养箱中，分别在培养12h和24h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。经Biolog读数仪分析代谢指纹，菌株ZJB-LLJ可较强利用27种碳源，对其他44种碳源不能利用或利用能力较弱；菌株ZJB-LLJ对16种化学物质敏感。Biolog系统给出24h鉴定结果，如表1和表2所示。

[0054] 表1：菌株ZJB-LLJ对Biolog GEN III板上71种碳源的利用能力

[0055]

[0056]

[0057] 表2：菌株ZJB-LLJ对Biolog GEN III板上23种化学物质的化学敏感性[0058]

[0059]

[0060] 3.16S rDNA全序列测定与分析

[0061] 3.1.16S rDNA序列扩增

[0062] 以提取到的细胞总DNA为模板，利用设计的引物扩增菌株ZJB-LLJ的16S rDNA序列，将PCR产物进行0.9％的琼脂糖凝胶电泳，从图2可以看出经PCR扩增成功获得了一长约为1.5kb的片段，符合预期结果。

[0063] 3.2.16S rDNA分析

[0064] 将经PCR扩增的片段克隆到T载体、抽提质粒后的含有本实验获得的16S rDNA片段的重组质粒，经测序确认该片段实际长度为1529bp，如图3所示。

[0065] 3.3.菌种属种的确定

[0066] 将6.2.2中获得的序列与GenBank中保存的数据进行相似性分析发现，本发明所鉴定微生物ZJB-LLJ与Pseudomonas putida(EU439422.1)同源性最高(homology，99％/1529bps，based on 16S rDNA)，根据微生物分子遗传学鉴定原则，基于16S rDNA序列的同源性高于95％，鉴定菌基本属于对照菌。因此，本实验鉴定的微生物属于Pseudomonas属的putida种，中文名称为恶臭假单胞菌。

[0067] 将测得的序列信息输入National Center Biontechnology Information中使用BLAST程序进行对比和进一步分析，然后使用相关软件对菌株进行序列比对和系统发育树的构建。结果见图4。

[0068] 4.发酵反应进程

[0069] 经实验测得种子液的生长曲线，结果显示从5h开始进入对数生长期，12h结束。之后进入稳定期。所以后面的发酵产酶培养选择12h的种子液。

[0070] 如图5所示，发酵产酶培养过程中，菌体量不断增加，培养60h OD最大值为0.48。诱导产酶培养12h后加入底物，底物浓度由1.71g/L逐渐变小，到44h出现最小值0.69g/L。加入底物后，产物浓度由零逐渐变大，44h后达到最大值0.65g/L。pH由6.8逐渐减小，到52小时达到最小是5.2之后pH又有所回升。

[0071] 4.2诱导物对反应的影响

[0072] 选择二甲苯，对二甲苯，间二甲苯，邻二甲苯(浓度均为1mL/L)作为诱导物研究诱导物对反应的影响(为防止对二甲苯对菌株的毒性影响，二甲苯，对二甲苯，间二甲苯，邻二甲苯分别以蒸汽的形式为菌株生长提供碳源，具体做法是在玻璃摇瓶中间焊接一玻璃管子，诱导物是加入到中间的小管子中)。

[0073] 实验结果如图6所示，二甲苯和间二甲苯开始时反应较慢，产物浓度较小。12h后反应加快，36h出现峰值，浓度稍微变小后又升高。对二甲苯初期反应较快，产物浓度较大，12h后反应变慢，36h出现峰值，浓度变小后再升高。最后产物浓度最高的是二甲苯0.39g/L，其次是对二甲苯0.37g/L，然后是间二甲苯0.36g/L，邻二甲苯基本没有活性。综合考虑，对二甲苯能最好的诱导单加氧酶的产生。

[0074] 4.3底物加入时间对反应的影响

[0075] 转接12h的种子液后在不同的时间加入底物，分别培养48h后取样离心，用HPLC检测。实验结果如图7：0h底物加入时间即转接后立即加入底物，产物浓度为0.24g/L。12h之前，随着诱导时间的增加，最终产物浓度随之增加。最大值0.63g/L出现在12h时。此后随着底物加入时间的变长，产物浓度开始变小。所以底物加入时间确定为12h。

[0076] 4.4发酵产酶培养基初始不同pH(反应过程不再调节pH)对反应的影响。如图8所示，pH3和4时产物浓度为零，说明pH过小对菌体生长有抑制作用。pH5时产物浓度为0.10g/L，随着pH的增大，产物浓度也逐渐增大，pH10h产物浓度达到最大的0.91g/L，pH11和12时产物浓度为零，反应基本停止，说明碱性过大对菌体生长也会有抑制作用。

[0077] 接下来的恒定pH下的实验结果如图9显示，在pH为8的时候整个发酵过程的产物积累量都为最大，到发酵的最后阶段pH7、8、9基本达到一致，并且底物已经完全转化，产物量达到1.41g/L。而更小的pH6的产量为1.18g/L，pH10的产量更小，只有0.55g/L。这说明中性偏碱的发酵环境更适合产物的积累。