一种治疗HBV的siRNA

摘要

本发明公开了一种治疗HBV的siRNA，其序列如SEQ ID NO.3所示。可人工合成，也可通过体内转录合成。将本发明的siRNA转染HepG2.2.15细胞24h和48h后，发现均能够下调HBx基因的表达，细胞内以及上清中HBsAg和HBeAg的含量也明显下降，并且3p-siRNA的作用效果比化学合成的更加显著。可以作为抗HBV的药物应用。

权利要求

1.一种治疗HBV的siRNA，其特征在于：其序列如SEQ ID NO.3所示：SEQ ID NO.3：

CCGACCUUGAGGCAUACUU。

说明书

一种治疗HBV的siRNA

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于治疗HBV的siRNA，属基因工程领域。

背景技术

[0002] 目前，全世界约有4.2亿HBV携带者，HBV感染是严重影响人类健康的疾病之一。慢性HBV感染与肝纤维化、肝癌的发生密切相关。但是，大部分的慢性HBV患者并没有在常规的治疗方式下获得预期的结果。尽管干扰素能够抑制HBV的复制，但是HBV能够通过抑制干扰素的分泌和功能，从而对抗机体的抗病毒机制，而最终导致机体处于免疫耐受状态。比如，在慢性感染的病人的外周血和肝浸润细胞中，调节性T细胞的比例有明显增加。另外，HBsAg，HBeAg以及其他的病毒因子能够直接抑制TLR介导的固有免疫应答。HBV聚合酶能够阻断RIG-I和TLR3介导的IFN-β分泌。

[0003] 目前，RNAi技术已经广泛应用于抗HBV研究。无论是细胞水平，还是HBV动物模型，siRNA分子均取得明显的抗HBV效果。RNAi干扰药物必将成为今后研究的重点。

[0004] 能否设计一种分子，既能特异性的沉默HBV相关基因，同时能够诱导IFN的产生，从而能够改善HBV导致的免疫耐受状态。HBx特异的3p-siRNA的出现，使得这样的假想成为可能，为HBV的治疗提供了很好的指导意义。

发明内容

[0005] 针对上述现有技术，针对HBV治疗现状的不足，本发明提供了一种用于治疗HBV的siRNA。

[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0007] 一种用于治疗HBV的siRNA，其序列如SEQ ID NO.1所示：

[0008] SEQ ID NO.1：GGUCUUACAUAAGAGGACU。

[0009] 或：如SEQ ID NO.2所示：

[0010] SEQ ID NO.2：GGACGUCCUUUGUUUACGU。

[0011] 或：如SEQ ID NO.3所示：

[0012] SEQ ID NO.3：CCGACCUUGAGGCAUACUU。

[0013] 本发明的用于治疗HBV的siRNA，是通过以下方法制备得到的：

[0014] 1.siRNA的设计

[0015] (1)首先分析所研究的HBV亚型为ayw型，其序列如SEQ ID NO.4所示。

[0016] (2)针对HBV x基因的序列，设计针对HBV x基因的特异性沉默RNA，用siRNA设计软件，设定相关参数包括siRNA的长度为19个碱基序列；GC比例在35-50之间。将潜在的序列利用BLAST进行基因数据库的比较，排除和其他编码序列同源的序列。

[0017] (3)化学合成siRNA由广州锐博公司直接合成，其靶点和3p-siRNA相同，序列见表1，以及序列表SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3。

[0018] 表1化学合成siRNA序列

[0019]Name Type Sequence 5′-＞3
siRNA1-sense RNA GGUCUUACAUAAGAGGACUdTdT
siRNA1-sense RNA AGTCCTCTTATGTAAGACCdTdT
siRNA2-sense RNA GGACGUCCUUUGUUUACGUdTdT
siRNA2-ansense RNA ACGTAAACAAAGGACGTCCdTdT
siRNA3-sense RNA CCGACCUUGAGGCAUACUUdTdT
siRNA3-ansense RNA AAGUAUGCCUCAAGGUCGGdTdT

[0020] (4)3p-siRNA合成所需的DNA模板设计：T7 Promoter序列之前(5’端方向)多加6个碱基GATCAC。

[0021] 2.3p-siRNA的制备过程

[0022] (1)合成附带T7promoter的HBx-siRNA序列相对应的单链DNA(由北京六合华大基因科技股份有限公司合成)序列见表2。

[0023] 表2用于体外转录的DNA模板

[0024]Name Type Sequence 5′-＞3
siRNA-1GGGs-s DNA GATCACTAATACGACTCACTATAGGGGGTCTTACATAAGAGGACTTT
siRNA-1GGGs-a DNA AAAGTCCTCTTATGTAAGACCCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC
siRNA-1GGGa-a DNA AAGGTCTTACATAAGAGGACTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC
siRNA-1GGGa-s DNA GATCACTAATACGACTCACTATAGGGAGTCCTCTTATGTAAGACCTT
siRNA-2GGGs-s DNA GATCACTAATACGACTCACTATAGGGGGACGTCCTTTGTTTACGTTT
siRNA-2GGGs-a DNA AAACGTAAACAAAGGACGTCCCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC
siRNA-2GGGa-a DNA AAGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC
siRNA-2GGGa-s DNA GATCACTAATACGACTCACTATAGGGACGTAAACAAAGGACGTCCTT
siRNA-3GGGs-s DNA GATCACTAATACGACTCACTATAGGGCCGACCTTGAGGCATACTTTT
siRNA-3GGGs-a DNA AAAAGTATGCCTCAAGGTCGGCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC
siRNA-3GGGa-a DNA AACCGACCTTGAGGCATACTTCCCTATAGTGAGTCGTATTAGTGATC
siRNA-3GGGa-s DNA GATCACTAATACGACTCACTATAGGGAAGTATGCCTCAAGGTCGGTT[0025] (2)双链Oligo DNA的制备(体外转录试剂盒购自Takara公司)。

[0026] ①将合成的单链Oligo DNA用DEPC处理水溶解，配制成100pmol/μl的DNA溶液。

[0027] ②按下列组份配制Oligo DNA退火反应液，如表3所示；

[0028] 表3

[0029]10×Annealing Buffer 2μl
100pmol/μl Oligo A* 2μl
100pmol/μl Oligo B* 2μl
DEPC处理H2O 14μl

[0030] *A、B必须配对，具体配对情况如下：

[0031] Oligo-1和Oligo-2；Oligo-3和Oligo-4；

[0032] n-Oligo-1和n-Oligo-2；n-Oligo-3和n-Oligo-4。

[0033] 将上述Oligo DNA退火反应液置于PCR扩增仪上，95℃处理2分钟后，经45分钟冷却至25℃，然后在25℃保持10分钟。此时一对单链Oligo DNA便经退火形成双链Oligo DNA，双链Oligo DNA的浓度为：10pmol/μl。进行体外转录实验时应将本溶液稀释(使用DEPC处理水)成4pmol/μl后使用。

[0034] (3)体外转录反应

[0035] ①按下列组份配制RNA体外转录反应液，如表4所示：

[0036] 表4

[0037]10×Transcription Buffer 2μl
ATP Solution 2μl
GTP Solution 2μl
CTP Solution 2μl
UTP Solution 2μl
RNase Inhibitor 0.5μl
T7 RNA Polymerase 2μl
RNase free ddH2O 5.5μl
4pmol/μl双链Oligo DNA溶液(Oligo-1/-2)* 1μl
4pmol/μl双链Oligo DNA溶液(Oligo-3/-4)* 1μl
合计 20μl

[0038] ②将上述溶液均匀混合后轻微离心，将转录反应液收集于反应管底部，42℃反应16小时。

[0039] (4)siRNA的纯化

[0040] ①向上述反应液中加入水饱和的酸性苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，上下充分倒置混合后室温，10,000rpm，离心5分钟。

[0041] ②将上层(水层)移至另一新的1.5ml离心管中，加入等量的5M的醋酸钠(pH5.6)和4倍量的99.5％的乙醇。

[0042] ③室温静置5分钟后，4℃，12,000rpm离心10分钟。

[0043] ④除去上清液后加入1ml 75％的乙醇，4℃，12,000rpm离心5分钟[0044] ⑤除去上清液，轻微干燥后加入50μl的DEPC处理水溶解沉淀。

[0045] ⑥取1μl用DEPC水稀释10倍，其中2μl用于测定OD260nm值，剩余的8μl进行4％的琼脂糖凝胶电泳确认RNA纯度。

[0046] ⑦根据测定的浓度，将上述溶液稀释为20pmol/μl溶液，进行RNA干扰实验。

[0047] (上述⑤中得到的沉淀，即是3p-siRNA，其序列见序列表SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3)

[0048] 上述实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规实验方法，上述实验试剂均为市售产品。

[0049] 本发明的发明人将上述取得的化学合成siRNA和体外转录的3p-siRNA(两者在序列上没有差异，唯一差别就是体外转录的在5’有三磷酸)转染HepG2.2.15细胞24h和48h后，发现均能够下调HBx基因的表达，细胞内以及上清中HBsAg和HBeAg的含量也明显下降，并且3p-siRNA的作用效果比化学合成的更加显著。

[0050] 本发明的siRNA，尤其是体外转录的3p-siRNA，转染HepG2.2.15细胞后，发现能明显诱导RIG-I通路的激活，诱导干扰素和抗病毒蛋白的产生，使得其在抗HBV作用更加明显。可以作为抗HBV的药物应用。

附图说明

[0051] 图1为体外转录3p-siRNA的电泳图。

[0052] 图2为HBx-3p-siRNA在HepG2.2.15细胞中的沉默作用检测。

[0053] 图3为3p-siRNA可以抑制细胞上清中的HBsAg的含量。

[0054] 图4为3p-siRNA可以抑制细胞上清中的的HBeAg的含量。

[0055] 图5为3p-siRNA可以抑制细胞内的HBsAg的表达，其中，A：siRNA1；B：siRNA2；C：siRNA3；D：3p-siRNA1；E：3p-siRNA2；F：3p-siRNA3；G：Scramble。

[0056] 图6为3p-siRNA可以抑制细胞内的HBcAg的表达，其中，A：siRNA1；B：siRNA2；C：siRNA3；D：3p-siRNA1；E：3p-siRNA2；F：3p-siRNA3；G：Scramble。

[0057] 图7为3p-siRNA能明显诱导干扰素产生，其中，A表明，相比于化学合成siRNA，3p-siRNA更加明显诱导IFN-αmRNA的产生；B图代表的是IFN-β在mRNA水平的表达；C图显示的是荧光素酶报告基因检测IFN-β的诱导。

[0058] 图8为3p-siRNA能明显诱导抗病毒蛋白的产生，其中，A表明，3p-siRNA能诱导RIG-I的表达，同时能诱导抗病毒蛋白MxA和ISG15的表达；B表明，3p-siRNA能激活MAPK信号通路；C表明，3p-siRNA能激活NF-κB信号通路。

具体实施方式

[0059] 以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

[0060] 实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售产品。

[0061] 实施例

[0062] 1、化学合成siRNA的合成：

[0063] 针对HBV X基因设计siRNA：根据siRNA设计原则将三对siRNA交由广州锐博公司直接合成siRNA序列，见表1，及序列表SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3。

[0064] 2、3p-siRNA的体外转录：

[0065] (1)靶点以及序列和化学合成siRNA完全一致。

[0066] (2)合成附带T7 promoter的HBx-siRNA序列相对应的单链DNA，见表2。

[0067] (3)双链Oligo DNA的制备：将合成的单链Oligo DNA用DEPC处理水溶解，配制成100pmol/μl的DNA溶液。

[0068] ①按表3所示组份配制Oligo DNA退火反应液。

[0069] ②将上述Oligo DNA退火反应液置于PCR扩增仪上，95℃处理2分钟后，经45分钟冷却至25℃，然后在25℃保持10分钟。此时一对单链Oligo DNA便经退火形成双链Oligo DNA，双链Oligo DNA的浓度为：10pmol/μl。进行体外转录实验时应将本溶液稀释(使用DEPC处理水)成4pmol/μl后使用。

[0070] (4)体外转录反应

[0071] ①按表4所示组份配制RNA体外转录反应液。

[0072] ②将上述溶液均匀混合后轻微离心，将转录反应液收集于反应管底部，42℃反应16小时。

[0073] (5)siRNA的纯化

[0074] ①向上述反应液中加入水饱和的酸性苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，上下充分倒置混合后室温，10,000rpm，离心5分钟。

[0075] ②将上层(水层)移至另一新的1.5ml离心管中，加入等量的5M的醋酸钠(pH5.6)和4倍量的99.5％的乙醇。

[0076] ③室温静置5分钟后，4℃，12,000rpm离心10分钟。

[0077] ④除去上清液后加入1ml 75％的乙醇，4℃，12,000rpm离心5分钟。

[0078] ⑤除去上清液，轻微干燥后加入50μl的DEPC处理水溶解沉淀。

[0079] ⑥取1μl用DEPC水稀释10倍，其中2μl用于测定OD260nm值，剩余的8μl进行4％的琼脂糖凝胶电泳确认RNA纯度，如图1所示，从图1可以看出，3p-siRNA成功转录，片段大小为21bp。

[0080] ⑦根据测定的浓度，将上述溶液稀释为20pmol/μl溶液，进行RNA干扰实验。

[0081] 3、3p-siRNA可以抑制HBx的表达

[0082] 以HepG2.2.15细胞作为研究对象，使用Lipofectamin 2000(购自invitrogen)进行化学合成siRNA和体外转录3p-siRNA的转染，转染24h后，提取细胞总RNA，用引物用5’端引物5’-CCGTCTGTGCCTTCTCATCTGC-3’和3’端引物5’-ACCAATTTATGCCTACAGCCTCC-3’进行定量PCR扩增HBV X基因。PCR反应条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，45循环。HBx的表达水平，GAPDH作为内参进行比较，如图2所示，图2中，横坐标分别代表siRNA、3p-siRNA不同的处理组，纵坐标代表HBx相对于内参基因GAPDH的表达。从图2可以看出，siRNA和3p-siRNA均能明显抑制HBV X基因的表达，并且
3p-siRNA的抑制效果更加明显。

[0083] 4、3p-siRNA可以抑制细胞上清中的HBV的复制

[0084] 转染HepG2.2.15细胞后，转染3p-siRNA24h后，用定量PCR检测上清中的HBV DNA拷贝数。取细胞上清液，加入等体积的DNA浓缩液，充分混匀；煮沸10分钟，12,000rpm离心5分钟；上清液用于做PCR。HBV S的特异性引物是：上游5′ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT 3′，下游5′ACAGGGGGAAAGCCCTACGAA 3′；荧光探针是
5′FAM-TGGCTAGTTTACAGTGCCATTTG TAMRA 3′，FAM荧光基团作为荧光报告TAMRA作为淬灭荧光，反应条件是93℃预变性2分钟；95℃变性30s，55℃退火45s，45循环。

[0085] 5、3p-siRNA可以抑制细胞上清中的HBsAg的含量

[0086] 以HepG2.2.15细胞作为研究对象，使用Lipofectamin 2000进行3p-siRNA的转染，转染48h后，收集细胞上清，用ELISA试剂盒检测上清中的HBsAg的含量，如图3所示，图3中，横坐标分别代表siRNA、3p-siRNA不同的处理组，纵坐标代表HBsAg的含量。从图3可以看出，siRNA和3p-siRNA均能明显抑制细胞上清中HBsAg的含量，并且3p-siRNA的抑制效果更加明显。

[0087] 6、3p-siRNA可以抑制细胞上清中的的HBeAg的含量

[0088] 以HepG2.2.15细胞作为研究对象，使用Lipofectamin 2000进行3p-siRNA的转染，转染48h后，收集细胞上清，用ELISA试剂盒检测上清中的HBsAg的含量，如图4所示，图4中，横坐标分别代表siRNA、3p-siRNA不同的处理组，纵坐标代表HBeAg的含量。从图4可以看出，siRNA和3p-siRNA均能明显抑制细胞上清中HBeAg的含量，并且3p-siRNA的抑制效果更加明显。

[0089] 7、3p-siRNA可以抑制细胞内的HBsAg的表达

[0090] 以HepG2.2.15细胞作为研究对象，使用Lipofectamin 2000进行3p-siRNA的转染，转染48h后，收集细胞上清，用免疫组化方法检测细胞内HBsAg的表达，如图5所示，从图5可以看出，siRNA和3p-siRNA均能明显抑制胞内HBsAg的表达，并且3p-siRNA的抑制效果更加明显。

[0091] 8、3p-siRNA可以抑制细胞内的HBcAg的表达

[0092] 以HepG2.2.15细胞作为研究对象，使用Lipofectamin 2000进行3p-siRNA的转染，转染48h后，收集细胞上清，用免疫组化方法检测细胞内HBsAg的表达，如图6所示，从图6可以看出，siRNA和3p-siRNA均能明显抑制胞内HBcAg的表达，并且3p-siRNA的抑制效果更加明显。

[0093] 9、3p-siRN能明显诱导干扰素的产生

[0094] 分析3p-siRNA能够明显抑制HBV的复制和表达。分析其机制，表明在3p-siRNA在发挥RNAi作用的同时，能够明显诱导干扰素和抗病毒蛋白的产生。以HepG2.2.15细胞作为研究对象，使用Lipofectamin 2000进行3p-siRNA的转染，转染24h后，用定量PCR法和荧光素报告基因的方法检测干扰素的诱导表达，如图7所示，其中，横坐标分别代表siRNA、3p-siRNA不同的处理组，A图纵坐标代表IFN-α相对于内参基因GAPDH的表达；B图纵坐标代表IFN-β相对于内参基因GAPDH的表达；C图纵坐标代表IFN-β的诱导倍数。从图7可以看出，siRNA和3p-siRNA均能引起干扰素的诱导表达，并且3p-siRNA的诱导效果更加明显。

[0095] 10、3p-siRNA能明显抗病毒蛋白的产生

[0096] 以HepG2.2.15细胞作为研究对象，使用Lipofectamin 2000进行3p-siRNA的转染，转染48h后，用Western blot方法检测抗病毒蛋白的诱导表达，如图8所示，从图8可以看出，3p-siRNA可以明显诱导抗病毒蛋白的表达，这种诱导作用和3p-siRNA诱导RIG-I并激活RIG-I下游的MAPK和NF-κB信号通路有关。