枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，具体是一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，该基因的核苷酸序列以及氨基酸序列是如序列表中所示SEQIDNO:1和SEQIDNO:2，本发明构建植物表达载体，获得转基因拟南芥植株，对其进行耐盐性和耐旱性评价，证明该基因作为目的基因导入植物，提高植物抗逆性，对于植物品种改良具有重要的现实意义，对于具有优良抗性的植物的抗逆机制的深入研究，有助于明确逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控，为进一步充分利用这些优良抗性基因来提高植物的抗逆性提供一定的实验数据和奠定理论基础，同时有助于了解GPXs在植物活性氧信号转导中的作用，促进人们对活性氧作为信号分子的了解。

权利要求

1.一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，其特征是该基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列。

2.根据权利要求1所述的一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，其特征是该基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。

3.根据权利要求1所述的一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，其特征是该基因的核苷酸序列编码的蛋白质具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因在提高拟南芥耐盐以及耐干旱中的应用。

说明书

枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，具体是一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因。

背景技术

[0002] Mills最初发现动物细胞内具有抗氧化作用的GPX，其功能被认为是防御红血球氧化引起的溶血，并将其命名为谷胱甘肽过氧化物酶。过去一直认为这是经典的GPX，现在把具有这种功能的酶命名为GPX-1.后来，Flohe研究小组纯化并分析了分布在细胞中并作用于各种有机过氧化物及H2O2的GPX，研究表明它是由4个蛋白质亚基构成的四聚体，每个亚基各含1个硒半胱氨酸，并且它是以离子化硒醇(selenol)的形式形成酶的氧化还原活性中心。大量的研究表明，哺乳动物的GPXs有着较高的催化活性，可迅速清除体内产生的多余的活性氧（ROS），并且GPXs多数以谷胱甘肽GSH(glutathione)作为底物催化分解生物体内产生的H2O2。目前，根据GPXs所包含的半胱氨酸残基的不同，可简单将其分为含硒和不含硒两大类。

[0003] 植物中同样也存在属于GPX家族的酶类，直到最近几年，在植物中也开展了GPXs的功能研究，最初的研究是从烟草的叶片里克隆了与动物依赖硒的GPXs有着较高同源性的cDNA。后来从柑橘、拟南芥、和中国大白菜等多种植物中分离得到了类似基因。研究发现，不同于动物基因组GPXs核苷酸UGA终止密码子处插入的硒代半胱氨酸残基，植物基因组GPXs核苷酸序列携带的是一个半胱氨酸残基。动物中含硒代半胱氨酸残基的GPXs有较强的催化活性，而植物中多数是半胱氨酸残基，这就大大降低了GPXs在植物中的催化作用。然而，也有人在研究柑橘的GPXs时，用硒代半胱氨酸残基代替了半胱氨酸残基，却没有出现类似于哺乳动物的GPXs的活性。

[0004] 植物中GPXs的结构、对底物的特异性及在植物组织的分布上都不相同，它们对抵御外界胁迫起了很重要的作用，但我们对其功能及结构特性的认识仍很有限，还需要做大量的工作。因此，克隆和鉴定植物中GPXs，研究抗逆机制以及与逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控，可为充分利用这些优良抗性基因提高植物的抗逆性提供一定的实验数据和奠定理论基础。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，可作为目的基因导入植物，提高植物抗逆性，进行植物品种改良。

[0006] 本发明是采用以下技术方案实现的：一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，该基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列。

[0007] 由所述的一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，该基因的核苷酸序列编码的氨基酸序列是如SEQ ID NO:2所示的序列。

[0008] 由所述的一种枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因，该基因的核苷酸序列编码的蛋白质具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

[0009] 所述的枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因在提高植物抗逆性中的应用。

[0010] 本发明从山西省农业生物技术研究中心园艺作物生物技术研究室构建壶瓶枣（Ziziphus jujuba Mill hupingzao）结果枝（即枣吊）cDNA文库中筛选到枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因的全序列，将其命名为ZjGPX（Ziziphus jujuba glutathione peroxidase）。生物信息学分析表明ZjGPX 基因cDNA序列全长为510bp，编码170个氨基酸，其中包含有
16个酸性氨基酸，19个碱性氨基酸，计算得知蛋白质的相对分子量为19.26KD，理论等电点为5.00，脂肪指数为76.69。

[0011] 根据枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因cDNA编码的序列，设计带有EcoRⅠ和Sma Ⅰ酶切位点的特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。其上游引物为GY1的序列为：5'—ACGAATTCTCATGACTAGCCAGC—3'， 包含EcoRⅠ限制性酶切位点（即有下划线部分），三个保护碱基ACG及此蛋白的起始密码子ATG。下游引物为GY2的序列为：5'—ATCCCGGGTTGAGATTCCCAAGA—3'，包含该Sma Ⅰ限制性酶切位点（即下划线部分），两个保护性碱基AT及谷胱甘肽过氧化物酶的终止密码子TGA。经限制性内切酶EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ修饰后连接于植物表达载体PEZR(K)-LNY上，然后再经含卡纳霉素的LB平板筛选转化子、PCR鉴定、酶切鉴定、测序证明植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjGPX构建成功。通过冻融法将携带目的基因的植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjGPX 转入农杆菌LBA4404的感受态细胞中，经含卡纳霉素的LB平板筛选转化子、PCR鉴定、酶切鉴定、测序证明工程菌PEZR(K)-LNY-ZjGPX构建成功。农杆菌介导ZjGPX 基因转化拟南芥，经含卡那霉素的1/2MS培养基筛选获得含有目的基因ZjGPX 的转基因拟南芥植株T0代，经PCR鉴定目的基因证实ZjGPX 成功转入拟南芥。将转ZjGPX 基因的T2代拟南芥种子和野生型（WT）拟南芥种子均播种在加不同浓度NaCl的1/2MS培养基上，对转ZjGPX基因植株及其T2代进行耐盐性评价，观察其生长状况，发现转ZjGPX 基因拟南芥植株在盐胁迫处理下长势和根系明显好于野生型（WT）拟南芥植株。将长出2片真叶的转ZjGPX 基因的T2代拟南芥植株和野生型（WT）拟南芥植株进行耐盐、耐旱胁迫处理，15天后观察其生长状况，发现转ZjGPX基因的拟南芥耐盐性明显提高，转ZjGPX 基因的拟南芥耐旱性明显提高。

[0012] 本发明为了进一步研究ZjGPX 基因在枣树体内的表达，分别对辣椒枣组培苗进行干旱、NaCl胁迫处理，研究逆境因素对ZjGPX 基因表达的影响。CTAB法提取所辣椒枣组培苗的总RNA，经OD260值测定、甲醛变性胶电泳等方法检测证明所提RNA浓度和纯度都符合标准，质量合格。反转录所提总RNA，定量PCR检测结果分析证实ZjGPX 可受干旱、NaCl胁迫等逆境因素诱导表达。

[0013] 此外，本发明为了进一步研究枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因ZjGPX及编码蛋白ZjGPX，本发明构建了重组原核表达载体pGEX-4T-2-ZjGPX，实现其在大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）中的原核表达，为该基因编码蛋白的结构、功能、调控等方面研究提供了一定的实验数据。

[0014] 与现有技术相比，本发明首次从枣树中分离出枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因ZjGPX，该基因作为目的基因导入植物，提高植物抗逆性，对于植物品种改良具有重要的现实意义，对于具有优良抗性的植物的抗逆机制的深入研究，有助于明确逆境相关基因的分子结构、表达、功能及调控，为进一步充分利用这些优良抗性基因来提高植物的抗逆性提供一定的实验数据和奠定理论基础，同时有助于了解GPXs在植物活性氧信号转导中的作用，促进人们对活性氧作为信号分子的了解。

附图说明

[0015] 图1为ZjGPX 与已知GPX 基因氨基酸同源性对比树状图。

[0016] 图2为枣树谷胱甘肽过氧化物酶的三维结构预测图。

[0017] 图3为PCR目的基因产物图谱。

[0018] 图4 为pGEX-4T-2及目的基因ZjGPX 酶切图谱。

[0019] 图5为重组质粒的酶切鉴定图。

[0020] 图6为工程菌pGEX-4T-2-ZjGPX-B的PCR鉴定图。

[0021] 图7为pGEX-4T-2-ZjGPX-B 诱导产物的SDS-PAGE分析。

[0022] 图8为IPTG对蛋白表达量的影响与融合蛋白的纯化。

[0023] 图9为PCR目的基因产物图谱。

[0024] 图10为PEZR(K)-LNY及目的基因的酶切图谱。

[0025] 图11为重组质粒的酶切鉴定图谱。

[0026] 图12为筛选出的转ZjGPX 基因拟南芥T0代幼苗。

[0027] 图13为筛选出的转ZjGPX 基因拟南芥T0代植株。

[0028] 图14为转ZjGPX 基因拟南芥T1不同株系拟南芥基因检测。

[0029] 图15为转ZjGPX 基因拟南芥和WT拟南芥种子在不同浓度的NaCl培养基上的萌发情况。

[0030] 图16为转ZjGPX 基因拟南芥和WT拟南芥植株在不同浓度的NaCl培养基上根系的生长情况。

[0031] 图17为转ZjGPX 基因拟南芥和WT拟南芥植株盐胁迫后生长情况的对比图。

[0032] 图18为转ZjGPX 基因拟南芥和WT拟南芥植株干旱胁迫后生长情况的对比图。

[0033] 图19为RNA甲醛变性胶电泳图谱。

[0034] 图20为辣椒枣组培苗经不同浓度的NaCl胁迫后的ZjGPX 相对表达量的对比表。

[0035] 图21为辣椒枣组培苗经PEG-6000胁迫（模拟干旱处理）后的ZjGPX 相对表达量的对比表。

具体实施方式

[0036] 实施例1：枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因ZjGPX的生物信息学分析

[0037] 本发明从山西省农业生物技术研究中心园艺作物生物技术研究室构建壶瓶枣（Ziziphus jujuba Mill hupingzao）结果枝（即枣吊、落性枝）cDNA文库中筛选到枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因ZjGPX 的全序列。

[0038] 将所测定ZjGPX基因序列通过Blastx搜索NCBI的核苷酸数据库，进行序列相似性分析；用DNAStar进行氨基酸序列比对并做此蛋白的进化树；用ProtParam计算蛋白质的相对分子量和理论等电点；连接至http://www.expasy.org/prosite进行保守序列分析；将此蛋白的氨基酸序列提交Swiss-Model预测其三级结构。

[0039] 生物信息学分析表明：枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因cDNA序列为全长510bp的开放读码框（ORF），通过在NCBI数据库Blastx搜索进行序列相似性分析表明，该蛋白与已知的其它植物谷胱甘肽过氧化物酶具有极高的同源性，与蓖麻的同源性为95%，杨树的同源性为93%，拟南芥的同源性为93%；对ZjGPX 蛋白的氨基酸序列与其它属的物种的谷胱甘肽过氧化物酶用DNAStar构建进化树，如图1所示，枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因的氨基酸序列和蓖麻的GPX亲缘关系最近，7个物种的谷胱甘肽过氧化物酶被聚为5个类群，拟南芥和杨树聚为一类；玉米和高粱聚为一类；枣、葡萄、蓖麻单独聚为一类；聚类分析还表明枣谷胱甘肽过氧化物酶和6物种GPX的氨基酸同源性均达到73.8%以上；ZjGPX基因cDNA序列全长为510bp，用ProtParam分析该序列得，它编码170个氨基酸，其中包含有16个酸性氨基酸，19个碱性氨基酸，计算得知蛋白质的相对分子量为19.26KD，理论等电点为5.00，脂肪指数为76.69；连接至http://www.expasy.org/prosite进行保守序列分析，结果表明该基因编码的蛋白具有一个谷胱甘肽过氧化物酶活性位点，其氨基酸序列为第31个氨基酸到第46个氨基酸“GKvLLIvNVaSkCGmT”，还有一个谷胱甘肽过氧化物酶保守肽段，其氨基酸序列为“LAFPCNQF”，即第68个氨基酸到第75个氨基酸；在蛋白质结构数据库中搜索到ZjGPX 同源模型2p5rA，用Swiss Model 程序(http://au.expasy.org/tools/) 进行同源建模(homology modeling)，推测ZjGPX 基因编码蛋白的三维结构如图2所示，枣树谷胱甘肽过氧化物酶与白杨树谷胱甘肽过氧化物酶有极高的相似性，推测其可能与白杨树谷胱甘肽过氧化物酶有着相似的功能。上述生物信息学分析方法均为本领域技术人员熟知的常规技术手段。

[0040] 实施例2：ZjGPX基因原核表达载体的构建

[0041] 1.材料、试剂及仪器

[0042] 1.1 载体和菌株

[0043] 大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株；克隆载体pSPORT1-ZjGPX、原核表达载体pGEX-4T-2均由山西省农业科学院生物技术研究中心园艺作物研究室保存。

[0044] 1.2 酶与试剂盒

[0045] DNA回收试剂盒QIAquick®购自QIAGEN公司；限制性内切酶BamH Ⅰ、Sma Ⅰ、Sal Ⅰ、T4DNA连接酶、DNA Marker（15000bp、2000 bp ladder）等均购自大连TaKaRa（宝生物）工程有限公司。

[0046] 1.3 试剂及仪器设备

[0047] 抗生素氨苄青霉素购自上海生工生物工程服务有限公司。质粒提取、琼脂糖凝胶电泳中所用的其他试剂均购自天津天大化工。

[0048] 主要的仪器设备有电子天平（Sarorius BS200s-WE1）、超净工作台（上海迅博医疗设备厂Vs-840-2）、隔水式恒温培养箱（上海市跃进医疗器械一厂PYX-DHS）、高压灭菌锅（TOMY SS-325）、高速冷冻离心机（Thero HP-62）、高速台式冷冻离心机（Beck man J-25）、PCR扩增仪（Eppendorf AG）、UVP凝胶成像分析仪（美国BioSpectrum 600）、真空干燥箱（HETO VR-1）、水浴恒温振荡器（国华企业SHZ-82A）、电热恒温水浴锅（天津市华北实验仪器有限公司）、恒温金属浴（杭州博日科技有限公司）、恒温磁力搅拌器（江苏金城国胜实验仪器厂79W-1）、DYY-6B型电泳仪（北京市六一仪器厂）、JY-DF系列电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)、Saritorius PH计、分光光度计（eppendorf BioPhotometer）。

[0049] 2. 实验方法

[0050] 2.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制作

[0051] 用CaCl2法制备大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞，具体方法见精编分子生物学实验指南，与细菌接触的液体及容器都需经过灭菌处理。

[0052] 2.2 PCR引物的设计与合成

[0053] 根据枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因cDNA编码的序列，设计带有BamHⅠ和Sma Ⅰ酶切位点的特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

[0054] 枣 树 谷 胱 甘 肽 过 氧 化 物 酶 基 因 的 上 游 引 物G1 序 列 为：5'——TATGGATCCATGACTAGCCAGCCCA——3'，包含BamHⅠ限制性酶切位点（即有下划线部分），三个保护碱基TAT，及谷胱甘肽过氧化物酶ZjGPX 基因的起始密码子ATG。下游引物 G2的序列为：5'——ATCCCGGGTCATGAGATTCCCAAGA——3'，包含Sam Ⅰ限制性酶切位点（即有下划线部分），两个保护碱基AT，及谷胱甘肽过氧化物酶ZjGPX 基因的终止密码子TCA。

[0055] 2.3 载体pGEX-4T-2的制备及目的基因ZjGPX 的扩增

[0056] 2.3.1 碱裂解法快速提取质粒pGEX-4T-2和pSPORT1-ZjGPX

[0057] 碱裂解法快速提取质粒pGEX-4T-2和pSPORT1-ZjGPX，具体步骤见精编分子生物学实验指南。

[0058] 2.3.2 目的基因序列的扩增

[0059] 以克隆载体pSPORT1（携带目的片段）为模板，用设计的特异性引物进行PCR扩增。先利用梯度PCR技术设置不同的温度，找出最佳退火温度为61℃。

[0060] PCR反应体系：10×PCR buffer 5µl（含Mg2+离子），dNTP 1µl，上下游引物各1µl（20pmol/L），rTaq聚合酶0.3µl，模板DNA 1µl（2.3µg/µl），灭菌超纯水加至总体积为50µl。扩增条件为：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸2 min，共40个循环，最后72℃延伸5 min。

[0061] 2.4 目的基因ZjGPX 和载体pGEX-4T-2的BamH Ⅰ和Sma Ⅰ酶切

[0062] 利用BamH Ⅰ和Sma Ⅰ分别酶切目的基因ZjGPX 的PCR产物和载体pGEX-4T-2。

[0063] 目的基因ZjGPX 的PCR产物的酶切反应体系如下：

[0064]

[0065] 注：PCR产物的体积依据其浓度而定，最少酶切1～2µg目的基因片段。最后加超纯水至总体积为50µl。

[0066] 载体pGEX-4T-2的酶切反应体系：

[0067]

[0068] 分别取5 ml 双酶切产物，1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分析，确认片段大小都与预期相吻合。

[0069] 2.5 酶切产物的纯化及连接

[0070] 按照DNA纯化试剂盒说明操作，纯化双酶切后的目的基因及载体。

[0071] 用T4 DNA连接酶将制备好的pGEX-4T-2载体与ZjGPX基因片段进行连接，连接反应体系总体积为10 μl，包括0.5 μl T4 DNA连接酶、300 ng ZjGPX 基因片段和300 ng pGEX-4T-2，16℃过夜连接。

[0072] 2.6 连接产物的转化

[0073] 将5µl连接产物加入到100µl的新鲜或保存于-80℃的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min。放入预加温到42℃的循环水浴中热休克90s，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却3-5min。加400µlSOC培养基，将管转移到37℃的摇床上，温浴40min使细菌复苏，复苏期应温和的摇动细胞（转速低于225r/min）。取适当体积的转化菌液转移到含氨苄青霉素的LB平板，涂匀。将平板置于温室直至液体被吸收，倒置平板，37℃静置培养过夜。

[0074] 2.7 转化产物的鉴定

[0075] 2.7.1 PCR鉴定方法

[0076] 待转化菌在含有氨苄青霉素的LB平板上长出菌落后，用无菌牙签挑取转化单菌落至50µl超纯水中，沸水浴5min使菌裂解。取1µl作为模板进行PCR阳性鉴定，反应体系2+
为：10×PCR buffer 1.5µl（含Mg ），dNTP0.2µl，上下游引物各0.5µl（20pmol/L），rTaq聚合酶0.1µl，模板DNA 1µl（2.3µg/µl），灭菌超纯水加11.2µl至总体积为15µl.扩增条件同前。将PCR鉴定为阳性的转化菌划线培养。

[0077] 2.7.2酶切鉴定

[0078] 将PCR鉴定为阳性的转化菌用碱裂法提取质粒DNA后，用限制性内切酶BamHⅠ和Sal Ⅰ对重组质粒进行酶切鉴定。

[0079] 载体pGEX-4T-2-ZjGPX 的BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切反应体系：

[0080]

[0081] 琼脂糖凝胶电泳酶切反应液，验证酶切片段的大小，保存携带目的片段的阳性菌株送，并将阳性菌株往上海生工生物工程技术服务有限公司测序，验证重组质粒读码框的正确性。

[0082] 3.原核表达载体pGEX-4T-2-ZjGPX构建的结果与分析

[0083] 3.1 ZjGPX cDNA的扩增

[0084] 利用设计的特异性上下游引物进行PCR扩增后，产物在1.0%琼脂糖中电泳，经EB染色后在紫外灯下观测到一条约510bp的条带，与所设计的扩增目的片段大小吻合，如图3所示，图中：M：DL2000；1-2：目的基因PCR产物。

[0085] 3.2 目的基因片段及载体片段的制备

[0086] 将PCR产物和pGEX-4T-2质粒用BamHⅠ和Sma Ⅰ双酶切，酶切产物经琼脂糖电泳， PCR产物大小约为510bp，pGEX-4T-2载体片段约为4.9Kb，与预期结果相符（如图4所示，图中：M1：DL2000；1：目的基因ZjGPX酶切产物；M2：DL15000 Marker；2：pGEX-4T-2酶切产物）。分别纯化目的片段与载体片段，用于连接。

[0087] 3.3 重组质粒的鉴定

[0088] 将连接产物转入大肠杆菌感受态细胞DH5α中后，从含有氨苄青霉素的培养基上挑取阳性单菌落进行PCR鉴定，将PCR鉴定为阳性的克隆子用碱裂减法提取质粒DNA后，质粒pGEX-4T-2-ZjGPX用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切鉴定，结果如图5所示，图中：DL2000 Marker；1-7：阳性质粒。双酶切的片段大小约为515bp，与预期结果相符；初步推断重组质粒构建成功，且重组质粒的大小约为5.4Kb左右。测序结果表明该转化菌的质粒中确实含有目的片段，且读码框正确，重组质粒构建成功。

[0089] 实施例3：ZjGPX在大肠杆菌中的表达及蛋白纯化

[0090] 1 材料、试剂及仪器

[0091] 1.1 载体和菌株

[0092] 大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株；原核表达载体pGEX-4T-2均由山西省农业科学院生物技术研究中心园艺作物研究室保存。

[0093] 1.2 试剂盒及仪器

[0094] 融合蛋白纯化试剂盒Glutathione Resins购自大连TaKaRa（宝生物）工程有限公司。

[0095] 本实施例用到的仪器主要有超声波仪（West Germany Elma D-7700），DYY-6B型电泳仪（北京市六一仪器厂）、DYCZ-28A型电泳槽（北京市六一仪器厂）、索尼数码相机（索尼（中国）有限公司DSC-T500）。其他的仪器见精编分子生物学实验指南。

[0096] 1.3 试剂配方

[0097] 融合蛋白纯化的相关试剂配方：萃取buffer(loading buffer):140mM NaCl；10mM Na2HPO4；1.8mM KH2PO4(pH7.5)。

[0098] 洗脱buffer：33mM 谷胱甘肽 溶解在50mM Tris-HCl（pH8.0）。准备新鲜的。

[0099] 回收buffer：

[0100] 第一种buffer：0.1M Tris-HCl；0.5M NaCl(pH8.5)。

[0101] 第二种buffer：0.1M 醋酸钠；0.5M NaCl(pH4.5)。

[0102] 第三种buffer：140mM NaCl；10mM 10mM Na2HPO4； 1.8mM KH2PO4(pH7.5)。

[0103] 其他试剂及SDS-PAGE电泳相关试剂配方见精编分子生物学实验指南。

[0104] 2. 实验方法

[0105] 2.1 基因工程菌pGEX-4T-2-ZjGPX-B的构建和筛选

[0106] 用CaCl2法制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，具体方法见精编分子生物学实验指南。分装成100µl或200µl小份，液氮中冷冻，-70℃贮存备用。

[0107] 将实施例2中构建的重组质粒pGEX-4T-2-ZjGPX 和载体pGEX-4T-2通过热激法，导入表达菌株E.coliBL21（DE3）感受态细胞中，涂于含氨苄青霉素的LB平板，37℃静置培养过夜。

[0108] 从37℃过夜培养的转化有重组质粒pGEX-4T-2-ZjGPX的平板上分别随机挑选生长良好的几个单菌落，进行PCR鉴定，方法同实施例2，将鉴定出的阳性工程菌重新划线保存一份，备用。

[0109] 2.2 SDS-PAGE不连续系统电泳样品制备

[0110] 从鉴定出的阳性工程菌pGEX-4T-2-ZjGPX-B（导入pGEX-4T-2-ZjGPX 质粒的E.coliBL21（DE3）的菌株）与对照菌pGEX-4T-2-B（导入pGEX-4T-2质粒的E.coliBL21（DE3）的菌株）进行SDS-PAGE检测。融合蛋白的诱导方法如下：

[0111] ①分别挑取对照菌pGEX-4T-2-B一个单菌落和阳性工程菌pGEX-4T-2-ZjGPX-B几个单菌落，接入10 mL含氨苄青霉素LB液体培养基，37℃培养过夜。

[0112] ②翌日早晨按1∶100的比例接种于相同的LB培养基上，37℃培养2h左右，至OD600值约为0.5 。

[0113] ③在培养物中加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，37℃继续通气培养4个小时。

[0114] ④取2 mL样品放于微量离心管中，室温，8000rpm离心3 min。

[0115] ⑤去上清。

[0116] ⑥将沉淀重悬于200 μl 2×SDS上样缓冲液，加20μl β-巯基乙醇，混匀。100℃加热5-10 min，冰上放置约5分钟至冷却，取20μl进行SDS-PAGE电泳。

[0117] 2.3 SDS-PAGE电泳操作程序

[0118] ①将玻璃板依次用自来水、SDS、自来水洗净，用无水乙醇擦拭干净，再用超纯水冲洗干净，晾干。待玻璃板干后，根据厂家的说明安装玻璃板。

[0119] ② 称取1.5 g琼脂粉，放入三角瓶，加入100 mL 1×电泳缓冲液，加热溶解，置桌面上冷却至不烫手（约50-60℃），开始在玻璃板外边缘灌注电极胶。电极胶装完后，静置15 min左右使胶凝结。

[0120] ③ 按照下表1所示先配制15 mL 15%分离胶。迅速在两玻璃板的间缝中注入分离胶溶液，注意不要动作太大，防止出现气泡。可用5 mL移液器吸取胶溶液均匀灌下，不要把胶溶液溢到外面。离玻璃板上端5cm左右停止灌注，用少许超纯水封住胶的液面将胶面压平，将凝胶垂自放置于室温约30 min待胶完全凝固。

[0121] 表1 SDS-PAGE分离胶和浓缩胶成分表

[0122]

[0123] ④用滤纸吸干液面上的水，按照表2.1所示配制5 mL 5%的浓缩胶，灌注至离玻璃板上端2 mm左右停止灌注，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，避免混入气泡，将凝胶垂直置室温下。

[0124] ⑤ 待胶凝结完全后，小心拔出梳子，立即用去离子水洗涤加样槽以去除未聚合的沉凝物，一小时左右后，在电泳槽中加入1×电泳缓冲液。

[0125] ⑥ 用微量移液器加样分别加样20μl至加样槽。

[0126] ⑦ 打开电泳仪，开始电泳，浓缩胶稳压70 v，但是电流不要超过20 mA，当凝胶中溴酚蓝到达分离胶时升压至150 v继续电泳，当溴酚蓝电泳至凝胶底部（即分离胶底部）1 cm处，电泳结束。

[0127] ⑧将胶卸下，左下切角作为正反面标记，加入适量的固定液进行固定处理。

[0128] ⑨ 凝胶固定约1.5 h，考马斯亮蓝R-250染色2 h，最后脱色至背景清晰为止。

[0129] ⑩ 照相保存，观察分析结果。

[0130] 2.4 GST-ZjGPX 融合蛋白表达诱导条件的优化

[0131] 2.4.1 IPTG诱导时间对GST-ZjGPX 融合蛋白表达的影响

[0132] 选取鉴定出的阳性工程菌pGEX-4T-2-ZjGPX-B，37℃振荡培养至OD600值为0.5左右，加人IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，37℃诱导培养，于1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h取出2 mL菌液，以不含插入子的pGEX-4T-2-B作为空白对照，对照菌pGEX-4T-2-B同样加人IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，37℃诱导培养，于4 h取出2 mL菌液，按上述样品制备的方法制备样品，每个样品取20 μl，进行SDS-PAGE检测，分析IPTG在不同的诱导时间下对蛋白表达量的影响。

[0133] 2.4.2 IPTG诱导浓度对GST-ZjGPX 融合蛋白表达的影响

[0134] 选取鉴定出的阳性工程菌pGEX-4T-2-ZjGPX-B，37℃振荡培养至OD600值为0.5左右，加入IPTG至终浓度分别为0.1、0.4、0.8、1.0、1.2 、1.6mmol/L，37℃诱导培养4 h，以不含插入子的pGEX-4T-2-B作为空白对照，对照菌pGEX-4T-2-B加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，按上述样品制备的方法制备样品，每个样品取20 μl，进行SDS-PAGE检测，分析IPTG在不同诱导浓度下对蛋白表达量的影响。

[0135] 2.5 融合蛋白GST-ZjGPX 的纯化

[0136] 细胞抽提物的制备、GST-ZjGPX 融合蛋白的纯化及GST纯化柱的再生，具体操作程序见融合蛋白纯化试剂盒Glutathione Resins说明书。

[0137] 3. ZjGPX 蛋白原核表达及纯化结果与分析

[0138] 3.1 工程菌pGEX-4T-2-ZjGPX-B的筛选

[0139] 将构建成功的原核表达载体pGEX-4T-2-ZjGPX 转入大肠杆菌E.coliBL21（DE3）后，从筛选平板上挑取单菌落经PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果表明，在510bp处有明显的目的基因扩增条带，与预期结果一致，如图6所示，图中M：DL 2000Marker；1-6：阳性菌落。证明带有目的基因ZjGPX 的载体pGEX-4T-2-ZjGPX 成功转入大肠杆菌（E.coli）BL21（DE3）中。

[0140] 3.2 工程菌pGEX-4T-2-ZjGPX-B表达融合蛋白的SDS-PAGE分析

[0141] 工程菌pGEX-4T-2-ZjGPX-B经IPTG诱导4 h后取样，电泳结果如图7所示，图中M：蛋白Marker；13：对照空菌体；5、6、9、10：表达有45KD融合蛋白的阳性菌体。 经SDS-PAGE电泳观察到含有质粒pGEX-4T-2-ZjGPX 的大肠杆菌BL21（DE3）在IPTG诱导的条件下，与对照空菌体pGEX-4T-2-B相比在大约45KD处产生一条特异性蛋白条带，表明诱导枣树谷胱甘肽过氧化物酶表达成功。(GST大小约为26KD，目的蛋白大小为19.26KD，故融合蛋白大小约为45KD)。

[0142] 3.3 IPTG不同诱导时间和浓度对蛋白表达量的影响及融合蛋白纯化结果[0143] OD600值约为0.5的工程菌pGEX-4T-2-ZjGPX-B新鲜菌液中加人IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，37℃诱导培养，分别于1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h取出2 mL菌液。

[0144] OD600值约为0.5的工程菌pGEX-4T-2-ZjGPX-B新鲜菌液中加入IPTG至终浓度分别为0.1、0.4、0.8、1.0、1.2 、1.6mmol/L，37℃诱导培养4 h，取菌液。

[0145] 将采取的菌液处理并进行SDS-PAGE电泳。电泳结果如图8所示，IPTG诱导时间为5h时，目的蛋白表达量最大；IPTG终浓度为0.4 mmol/L时，目的蛋白表达量最大。然后大量表达融合蛋白，收集细菌裂解液，利用亲和层析技术，与GST标签蛋白纯化树脂结合，经多次洗脱纯化，获得分子量为45KD的GST-ZjGPX融合蛋白，第一条带，可见GST融合蛋白与GST标签蛋白纯化树脂有很高的亲和效率。见图8，图中M:蛋白Marker；1：纯化的GST-ZjGPX 融合蛋白；2：对照GST蛋白表达；3-8：不同时间诱导GST-ZjGPX 融合蛋白表达，诱导时间分别是1h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h；9-14：不同浓度诱导GST-ZjGPX融合蛋白表达，IPTG至终浓度分别为0.1、0.4、0.8、1.0、1.2 、1.6mmol/L。

[0146] 实施例4：ZjGPX基因植物表达载体的构建

[0147] 1.实验材料

[0148] 1.1 载体及菌株

[0149] 植物表达载体PEZR(K)-LNY（含黄色荧光蛋白（YFP）标记基因）、大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株、含ZjGPX基因的重组质粒pSPORT1-ZjGPX均由山西省农业科学院生物技术研究中心园艺作物研究室保存。

[0150] 1.2 酶与试剂盒

[0151] DNA回收试剂盒TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0、限制性内切酶BamH Ⅰ、SmaⅠ、EcoR Ⅰ、HindⅢ、T4DNA连接酶（DNA Ligation Kit Ver.2.0）、DNA Marker等均购自大连TaKaRa（宝生物）工程有限公司。

[0152] 1.3常用试剂及培养基

[0153] 1、卡那青霉素（100 mg/mL）

[0154] 2、 酚∶氯仿∶异戊醇（V∶V∶V，25∶24∶1）

[0155] 3、葡萄糖溶液（1 M）

[0156] 4、EDTA（0.5M，pH8.0 ）

[0157] 5、10×TBE电泳缓冲液：硼酸 55.2g/L

[0158] Tris 108g/L

[0159] EDTA(0.5M，pH8.0) 40mL

[0160] 6、10% SDS（pH7.2）

[0161] 7、NaOH（2 M）

[0162] 8、Tris-HCl（1 M，pH8.0）

[0163] 9、醋酸钠（3M，pH5.2）

[0164] 10、TE溶液（10mM Tris-Hcl，1mM EDTA，pH8.0）

[0165] 11、LB培养基：(固体培养基加琼脂0.15g/L)

[0166] 蛋白胨 0.1g/L

[0167] 酵母提取物 0.05g/L

[0168] NaCl 0.05g/L

[0169] 2.实验方法

[0170] 2.1 大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株感受态细胞的制作

[0171] 用CaCl2法制备大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株感受态细胞，具体方法见精编分子生物学实验指南。

[0172] 2.2 PCR引物的设计与合成

[0173] 根据枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因cDNA编码的序列，设计带有EcoRⅠ和Sma Ⅰ酶切位点的特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

[0174] 上游引物为GY1：5'—ACGAATTCTCATGACTAGCCAGC—3'， 包含EcoR Ⅰ限制性酶切位点（即有下划线部分），三个保护碱基ACG及此蛋白的起始密码子ATG。

[0175] 下游引物为GY2：5'—ATCCCGGGTTGAGATTCCCAAGA—3'，包含该Sma Ⅰ限制性酶切位点（即下划线部分），两个保护性碱基AT及谷胱甘肽过氧化物酶的终止密码子TGA。

[0176] 2.3 载体PEZR(K)-LNY和pSPORT1-ZjGPX 的制备及目的基因ZjGPX 的扩增[0177] 2.3.1 质粒PEZR(K)-LNY和pSPORT1-ZjGPX 的制备

[0178] pSPORT1-ZjGPX质粒的DH5α菌液用2mL的LB液体培养基加1μl氨苄青霉素（100 mg/mL）接菌后37℃过夜培养所得。含PEZR(K)-LNY质粒的DH5α菌液则用2mL的LB液体培养基加1μl卡那青霉素（100 mg/mL）接菌后37℃过夜培养所得。

[0179] 碱裂解法快速提取质粒PEZR(K)-LNY和pSPORT1-ZjGPX的具体步骤见精编分子生物学实验指南。

[0180] 最后将干燥的质粒溶于20 μl TE中，-20℃保存备用。

[0181] 2.3.2 目的基因ZjGPX 的扩增

[0182] 以克隆载体pSPORT1（携带目的片段）为模板，用设计的特异性引物进行PCR扩增。先利用梯度PCR技术设置不同的温度，找出最佳退火温度为52℃。

[0183] PCR反应体系：10×PCR buffer 5µl（含Mg2+离子），dNTP 1µl，上下游引物各1µl（20pmol/L），rTaq聚合酶0.3µl，模板DNA 1µl（2.3µg/µl），灭菌超纯水40.7µl，总体积50µl。扩增条件为：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸2 min，共40个循环，最后72℃延伸5 min。

[0184] 2.4 目的基因ZjGPX 和载体PEZR(K)-LNY的EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ酶切

[0185] 目的基因ZjGPX的PCR产物两端及载体PEZR(K)-LNY的多克隆位点都具有EcoRⅠ和SmaⅠ限制性内切酶点，利用EcoRⅠ和SmaⅠ分别酶切目的基因ZjGPX的PCR产物和载体PEZR(K)-LNY，使它们具有相同的粘性末端，为连接做好准备。

[0186] 目的基因ZjGPX 的PCR产物的酶切反应体系如下：

[0187]

[0188] 注：PCR产物的体积依据其浓度而定，最少酶切1～2µg目的基因片段。最后加超纯水至总体积为50µl。

[0189] 载体PEZR(K)-LNY的酶切反应体系如下：

[0190]

[0191] 酶切后分别取5 ml双酶切产物，1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分析，确认片段大小都与预期相吻合。

[0192] 2.5 酶切产物的纯化

[0193] 按照DNA纯化试剂盒说明操作，纯化双酶切后的目的基因及载体。

[0194] 目的基因ZjGPX片段和载体PEZR(K)-LNY经EcoRⅠ和Sma Ⅰ双酶切后，按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0的说明书进行纯化操作。

[0195] 2.6 酶切产物的连接

[0196] 用T4 DNA连接酶将纯化后的PEZR(K)-LNY载体与ZjGPX基因片段进行连接。将质粒载体PEZR(K)-LNY的DNA片段与目的基因ZjGPX 的DNA片段混合制备成体积为5μl左右的DNA溶液（载体DNA和插入DNA的摩尔数比一般为：0.03pmol：0.1～0.3pmol），向上述DNA溶液中加入等体积的DNA Ligation Kit中的SolutionⅠ，充分混匀。连接反应体系总体积为10 μl，充分混匀后，16℃反应过夜。

[0197] 2.7 连接产物的转化

[0198] 将100µl的新鲜或保存于-70℃的大肠杆菌感受态细胞DH5α加入到上面的连接产物中，轻轻混匀，冰上放置30 min。放入预加温到42℃的循环水浴中热休克90 s，快速将EP管转移到冰浴中，使细胞冷却3～5min。加400 μl的LB培养基，将EP管转移到37℃的摇床上，温浴40 min使细菌复苏，复苏期应温和的摇动细胞（转速低于225转/min）。将适当体积的已转化感受态细胞转移到LB平板（含氨苄青霉素），涂匀。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃静置培养过夜。

[0199] 2.8 PCR鉴定

[0200] 待转化菌在含有卡那霉素抗性的LB平板上长出军落后，用无菌牙签挑取转化单菌落至50μl超纯水中，沸水浴5min使菌裂解。取1µl作为模板进行PCR阳性鉴定，反应2+
体系为：10×PCR buffer 1.5µl（含Mg ），dNTP0.2µl，上下游引物各0.5µl（20pmol/L），rTaq聚合酶0.1µl，模板DNA 1µl（2.3µg/µl），灭菌超纯水加11.2µl至总体积为15µl.扩增条件同前。将PCR鉴定为阳性的转化菌划线培养。

[0201] 2.9 重组表达载体的酶切鉴定

[0202] 将PCR鉴定为阳性的转化菌用碱裂法提取质粒DNA，用限制性内切酶对重组质粒进行Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切鉴定，电泳观察结果，并将阳性菌株送往往华大基因公司测序，验证重组质粒读码框的正确性。

[0203] Hind Ⅲ和BamH Ⅰ的酶切体系如下：

[0204]

[0205] 3. ZjGPX基因植物表达载体构建的结果与分析

[0206] 3.1 ZjGPX cDNA的扩增

[0207] 利用设计的特异性上下游引物进行PCR扩增后，产物在1.0%琼脂糖中电泳，经EB染色后在紫外灯下观测到一条约510bp的条带，如图9所示，图中，M1：DL15000Marker；1：PCR目的基因酶切产物，与所设计的扩增目的片段大小相符，说明已成功克隆到ZjGPX 基因。

[0208] 3.2 目的基因片段和载体片段的制备

[0209] 用EcoRⅠ和SmaⅠ双酶切ZjGPX基因的PCR产物和PEZR(K)-LNY表达载体，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图10所示，图中，M：DL15000Marker；1：目的基因酶切产物；2：PEZR(K)-LNY酶切产物，PCR产物大小约为510bp，PEZR(K)-LNY载体片段分别约为11.7Kb，与预期结果相符。分别按试剂盒说明纯化目的片段与载体片段，用于连接。

[0210] 3.3 重组质粒的鉴定

[0211] 将连接产物转化大肠杆菌DH5α，从含有卡那霉素的培养基上挑取阳性单菌落进行PCR鉴定。提取阳性克隆的质粒DNA，用Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切，产生1个条带，其大小约为11.7Kb (如图11所示，图中，M：DL15000 Marker；1-10：阳性质粒)，表明载体中已经带有ZjGPX基因的目的片断。另外，测序结果也表明，重组质粒的外源插入片段的序列正确。上述结果证实，ZjGPX 基因已经成功构建到植物表达载体PEZR(K)-LNY上，并将该载体命名为PEZR(K)-LNY-ZjGPX。

[0212] 实施例5：农杆菌介导ZjGPX基因转化拟南芥

[0213] 1.材料、试剂与仪器

[0214] 1.1 植物材料

[0215] 野生型拟南芥种子来源于山西省农业科学院生物技术研究中心园艺作物研究室，培养基质购自山西省农科园艺作物研究所。

[0216] 1.2 载体和菌株

[0217] 植物表达载体PEZR(K)-LNY-ZjGPX、根癌农杆菌LBA4404均由山西省农业生物技术研究中心园艺作物研究室保存。

[0218] 1.3 试剂及仪器设备

[0219] 卡纳霉素购自上海生工生物工程服务有限公司；YEB、1/2 MS培养基中所用试剂均购自天津天大化工。

[0220] 人工气候培养箱（SANYO,MLR-350）、索尼数码相机（索尼（中国）有限公司DSC-T500）。

[0221] 1.4 培养基及试剂配方

[0222] 1.4.1 YEB培养基：

[0223] 蛋白胨0.05g/L，酵母膏0.01 g/L，蔗糖0.05g/L，硫酸镁0.005g/L。

[0224] 注：固体培养基需加终浓度为1.0%的琼脂粉。

[0225] 1.4.2 1/2MS培养基：

[0226] 按配制MS培养基配制1/2MS培养基，大量元素、微量元素、有机元素、铁盐的量各减半，蔗糖30g/L，琼脂粉6g/L。

[0227] 2.实验方法

[0228] 2.1 拟南芥的培养

[0229] 将拟南芥种子先在95%乙醇浸泡30～60s；再转入2.65%次氯酸钠灭菌5min，其间上下颠倒洗，5000rpm离心2min；灭菌水洗三次；然后将种子悬浮于0.1%的琼脂粉溶胶中；用枪头吸上悬浮液将种子点播于1/2MS固体培养基上，封口；4℃黑暗春化2d后，将拟南芥种子在22℃，16 h／8 h光周期条件下进行培养；当拟南芥长出2片真叶时，移栽到营养基质中继续培养。

[0230] 2.2 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制作

[0231] 制备根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的具体步骤见精编分子生物学实验指南。

[0232] 2.3 工程菌PEZR(K)-LNY-ZjGPX-L的构建及筛选

[0233] 通过冻融法将构建成功的重组质粒PEZR(K)-LNY-ZjGPX 转入农杆菌LBA4404，提取阳性克隆的质粒DNA，并通过PCR检测重组质粒是否转入农杆菌。

[0234] 从28℃培养的转化有重组质粒PEZR(K)-LNY-ZjGPX 的筛选平板上随机挑选生长良好的若干单菌落，各取二分之一菌落至50µl超纯水中，沸水浴5min使菌裂解，取1µl作为模板进行PCR鉴定。将鉴定出的阳性工程菌重新划线保存一份，备用。

[0235] 2.4 工程菌PEZR(K)-LNY-ZjGPX-L的培养

[0236] 挑选鉴定正确的阳性克隆于10mLYEB液体培养基(含终浓度为50 μg/mL的卡纳抗生素)过夜培养后，6000 rpm离心5min收集菌体，用培养基悬浮菌体至OD600值为0.8左右，用于转化拟南芥植株。

[0237] 2.5 农杆菌侵染拟南芥

[0238] 拟南芥植株形成花蕾时，即可被用于农杆菌转化。将含有农杆菌的转化介质倒入烧杯中，将拟南芥植株的花蕾部分浸入转化介质3～5S，浸染过的植株放到塑料盘中，用薄膜覆盖，暗处放置12h。然后揭开薄膜，正常条件下继续培养转化过的拟南芥植株。当拟南芥的角果枯黄，欲开裂时，收获种子，此为T0代种子。

[0239] 2.6 转ZjGPX 基因拟南芥的筛选

[0240] 将消毒的转基因拟南芥植株T0代种子播种于1/2MS培养基(含终浓度为50 μg/mL的卡纳霉素)，4℃黑暗春化2d后置于22℃,16h/8h光周期下培养。转化成功的拟南芥种子长出来的幼苗生长正常，未转化成功的幼苗叶子发黄，生长缓慢。当生长正常的拟南芥长出2片真叶时，移栽到培养基质中继续培养至角果枯黄、欲裂开，收取T1代种子。将T1代种子的拟南芥播种于1/2MS培养基，4℃黑暗春化2d后在22℃，16 h／8 h光周期下培养。生长正常的拟南芥长出2片真叶时，移栽到营养基质中继续培养。

[0241] 2.6 转ZjGPX 基因拟南芥的胁迫处理

[0242] 2.6.1 转ZjGPX 基因拟南芥种子的耐盐性实验

[0243] 将转ZjGPX 基因拟南芥的T2代种子和野生型（WT）拟南芥种子用乙醇和次氯酸钠灭菌，均分别播种在0mM（对照CK）、50mM、100mM、200mM、300mM浓度NaCl的1/2MS培养基上。每一个浓度的培养基分别播种不同转ZjGPX 基因拟南芥的T2代和野生型拟南芥种子约20颗种子，播种后先在4℃冰箱内黑暗春化2d，然后再放入21℃，16 h／8 h光周期条件的培养箱内进行培养。观察其种子萌发和生长状况并记录拍照。

[0244] 2.6.2 转ZjGPX 基因拟南芥植株的耐盐、耐旱性实验

[0245] 将转ZjGPX 基因拟南芥的T2代种子和野生型（WT）拟南芥种子用乙醇和次氯酸钠灭菌，分别播种1/2MS培养基上。播种后先在4℃冰箱内黑暗春化2d，然后再放入21℃，16 h／8 h光周期条件的培养箱内进行培养。当拟南芥植株长出2片真叶时，移栽到营养基质中继续在相同条件下培养，移入基质3周后开始进行耐盐、耐旱胁迫处理。

[0246] 盐胁迫方法：NaCl水溶液浓度为400mM，每次每棵浇3mL的盐水，隔两天浇一次，共浇了三次，15天后观察并拍照。

[0247] 干旱胁迫方法：不浇水，15天后观察并拍照。

[0248] 3.实验结果

[0249] 3.1 转基因拟南芥植株的获得

[0250] 按2.5的方法侵染拟南芥后，将消毒的转基因拟南芥的T0代种子播种于1/2MS筛选培养基（含终浓度为50 μg/mL的卡那抗生素），4℃黑暗春化2d后在22℃，16h／8h光周期下培养。从图12可知，转化成功的拟南芥种子长出来的幼苗生长正常，未转化成功的幼苗叶子发黄，生长缓慢，共筛选出17株拟南芥，生长正常的拟南芥长出2片真叶时，移栽到营养基质中继续培养。长大后的T0代拟南芥植株，长的比野生拟南芥植株要壮，如图13所示。

[0251] 将消毒的转基因拟南芥植株的T1代种子播种于1/2 MS培养基，4℃黑暗春化2d后在22℃，16 h／8 h光周期下培养。生长正常的拟南芥长出2片真叶时，移栽到营养基质中继续培养。结果如图14所示，图中M：DL5000Marker；1-10：T1代拟南芥不同株系。10个株系都均为转ZjGPX 基因株系。

[0252] 3.3 转ZjGPX 基因拟南芥的抗性鉴定

[0253] 3.3.1 转ZjGPX 基因拟南芥种子的耐盐性鉴定

[0254] 观察种子的萌发情况发现，播种后9天，50mM，100mM NaCl的培养基上种子萌发并生长出绿色叶片；而200mM，300mM NaCl培养基上种子仅有萌出白色小芽，均没有发出绿色叶片发芽，如图15所示。播种15天后观察植株的生长情况，发现部分转基因拟南芥的幼苗生长势和根系明显好于野生拟南芥，但是200mM，300mM NaCl处理依然没有种苗生长，如图16所示。

[0255] 3.3.2 转ZjGPX基因拟南芥种子的耐盐、耐旱性鉴定

[0256] 如图17所示：NaCl胁迫15天后的植株，可见野生型拟南芥植株叶片已失水萎焉，有了枯萎的迹象；而转ZjGPX株系1和株系2植株的叶片和植株仍然表现正常。证明转ZjGPX 基因的拟南芥耐盐性明显提高。

[0257] 如图18所示干旱胁迫后的植株，15天后发现干旱处理的野生拟南芥植株表现出叶片干枯、死亡；而转基因株系的植株生长基本正常，株系1的耐旱性比株系2强，证明转ZjGPX 基因的拟南芥耐旱性明显提高，并且株系间的耐旱性存在差异。

[0258] 实施例6：ZjGPX在枣树体内的表达

[0259] 1.材料、试剂及仪器

[0260] 1.1植物材料

[0261] 辣椒枣（Ziziphus jujuba Mill lajiaozao）组培苗由山西省农业科学院生物技术研究中心植物细胞与胚胎研究室提供。

[0262] 1.2培养基及主要试剂配方

[0263] 继代培养基成分：MS培养基 + 6-BA（6-苄氨基嘌呤）:0.5mg/L+琼脂:6g/L，PH:5.8-6.0

[0264] 1.3 试剂及仪器

[0265] 饱和酚、总RNA提取过程中所用到的试剂均购自上海生工生物工程有限公司。反转录试剂盒，荧光定量PCR试剂盒及荧光定量过程中所用的PCR管均购自大连TaKaRa（宝生物）工程有限公司。

[0266] 反转录试剂盒(PrimeScript® RT Master Mix)反转录成cDNA；以cDNA为模TM板，利用荧光定量试剂盒（SYBR® Premix Ex Taq Ⅱ）进行相对定量分析，计算相对表达量-（△△CT）
△△CT值，以2 表示表达量。

[0267] 荧光定量PCR仪（ABI-7300）

[0268] 2. 实验方法

[0269] 2.1 样品的处理

[0270] 组培苗繁殖的整个过程均在超净台进行，每次操作前都需将所用的物品和器皿进行彻底消毒或在酒精灯上灼烧。

[0271] 继代培养时每一株均要选取有生长点且长势好的组培苗，然后用彻底消毒的剪刀截取距生长点1-2cm的组培苗头部，并迅速将剪下的小组培苗放入已灭菌的继代培养基中，整个过程要在酒精灯附近操作，若大批量繁殖组培苗，建议每30分钟更换所用的所有物品或将所用物品在酒精灯上灼烧，从而避免交叉污染。

[0272] 若所有组培苗均已更换培养基，则要将全部含有小组培苗的新培养基放入组织培养室，使其可以正常生长，生长过程要不定期进行观察，以便及时发现污染的组培苗。通常情况每1~2个月继代培养一次。

[0273] 培养条件为：温度25±1℃；光照周期12h/天；光照强度2000-3000μmol.m-2.s-1。

[0274] 2.2 材料的准备及采集

[0275] 选取30-40天长势较一致、健壮的“辣椒枣”组织培养苗浸入一定浓度的NaCl溶液和PEG-6000溶液（模拟干旱）中胁迫处理，每个处理6株。

[0276] 处理浓度为：NaCl：50mM、100mM、200mM、300mM

[0277] PEG-6000：0.5MPa、0.8MPa、1.2MPa

[0278] 然后分别在不同的时间取样，取样时间为：

[0279] NaCl：15min、30min、45min、1h、3h、7h、24h、48h；

[0280] PEG-6000：15min、30min、45min、1h、3h、6h、24h、48h。

[0281] 将所取样品的叶和茎段分开，分别放入10mL离心管中，液氮速冻后保存于-80℃冰箱，用于总RNA的提取。

[0282] 2.3 植物总RNA的抽提和质量检测

[0283] 2.3.1 植物材料RNA的提取

[0284] CTAB法提取辣椒组培苗叶片的总RNA，用于定量表达分析。

[0285] 2.3.2 RNA质量检测

[0286] 总RNA质量检测用蛋白核酸分光光度计检测其纯度和浓度，同时用甲醛变性胶电泳法来检验总RNA是否降解。

[0287] （1）甲醛变性胶电泳

[0288] RNA甲醛变性电泳液：

[0289] 1×MOPS 500～600 ml：用DEPC处理过的水稀释20×MOPS 20倍。

[0290] 1％琼脂糖变性胶配制方法如下：

[0291] 水（经DEPC处理） 44mL

[0292] 甲醛 3.0mL

[0293] 20×MOPS 3.0mL

[0294] 琼脂糖 0.6g

[0295] 加热溶解后再加水至总体积为60ml，使溶液冷却。

[0296] 注：制胶时先将水、MOPS、琼脂糖融化，室温放置至冷却到60℃，再加入甲醛，混匀并置通风橱中15分钟后倒入制胶器中。

[0297] （2）总RNA变性Buffer制备方法:

[0298]

[0299] 总RNA样品与变性Buffer的体积比为1：3，混匀后在65℃水浴中温浴10min，置于冰水混合物上5分钟使之冷却；点样，电泳，经摇床慢摇EB染色40min，S.D.W洗三次，每次15min，紫外照相检测。

[0300] 2.4 RNA的反转录及荧光定量PCR

[0301] 2.4.1 RNA的反转录

[0302] 按试剂盒PrimeScript® RT Master Mix说明将检测合格的总RNA进行反转录，反转录体系如下：

[0303] 5×Prime Script® Buffer 4µl

[0304] Total RNA 1µg

[0305] S.D.W up to 20µl

[0306] 反转录的反应程序为：37℃ 15min（反转录反应），85℃ 5sec（反转录酶的失活反应）。

[0307] 2.4.2荧光定量引物设计与合成

[0308] 本研究室孙海峰等研究表明枣树ZjH3基因可作为内参基因对ZjGPX 基因进行mRNA表达水平的检测。由序列号EU916201获得ZjH3 基因序列，根据所得序列设计内参基因ZjH3 的特异性引物，根据ZjGPX 基因保守区设置用于荧光定量PCR的特异性引物，并委托华大基因合成。

[0309] 内参基因ZjH3 的引物为：

[0310] H1：5′—GAGGAAGCAACTGGCAACTAAGG—3′；

[0311] H2：5′—ACCAGCCTCTGGAATGGAAGTTTG—3′。

[0312] 目的基因ZjGPX 的引物序列为：

[0313] WP9：5′—CATGGGTTGGAGATACTGGC—3′

[0314] WP10：5′—TTGGAGCAGCACTTTCACC—3′

[0315] 2.4.3荧光定量PCR分析

[0316] 以反转录产物cDNA为模板，分别以WP9和WP10；H1和H2为引物，用荧光定量PCR仪检测各种胁迫处理后枣树谷胱甘肽过氧化物酶基因的表达情况。反应体系为：10×PCR buffer 1.5µl（含Mg离子），dNTP 0.2µl，上下游引物各0.5µl（20pmol/µl），rTaq聚合酶0.1µl，模板cDNA 1µl，灭菌超纯水加11.2µl至总体积为15µl。

[0317] 2.4.4 实时荧光定量

[0318] 将反转录的cDNA稀释为100ng/µl，取1µl作为荧光定量PCR模板，用ZjH3作为内参基因，实时定量RT-PCR反应所用试剂盒为SYBR Green I（TaKaRa）。在实时荧光定量PCR仪上进行相对定量分析。20µl反应体系中加入：上下游各引物0.4µl（20pmol/µl），cDNA1µl，rTaq 10µl，Rox 0.4µl，用水加至20µl；每一个样品均做3个重复，PCR的反应程序设-ΔΔCt
置参照荧光定量试剂盒说明书。反应结束后，整理实验结果，按照公式X=2 进行目的基因的相对定量。

[0319] 3.实验结果

[0320] 3.1 组培苗胁迫处理后形态学观察结果

[0321] 将正常生长且长势较一致的辣椒组培苗进行NaCl和PEG-6000（模拟干旱）处理，处理至24h时300mM NaCl和1.2MPa PEG-6000溶液处理过的枣组培苗叶片开始变蔫；处理至48h时，300mM NaCl处理的枣组培苗叶片变白，有死亡迹象，1.2MPa PEG-6000溶液处理的组培苗叶片全部变白，即死亡。

[0322] 3.2 总RNA的质量检测结果

[0323] 3.2.1 RNA的OD值

[0324] 将所提取到的总RNA按1：49与RNA-free water配好后，用分光光度计检测结果表明，所提材料的总RNA的OD260均在500ng/µl以上，260/280和260/230均在1.9以上，表明所提总RNA的浓度和纯度都合格符合要求，可以用于进行下一步检测。

[0325] 3.2.2 甲醛变性胶电泳

[0326] 将所提RNA样品处理后，进行甲醛变性胶电泳，凝胶成像分析仪下观察电泳结果，如图19所示，可以看到较分明的两条带，且前后两条带亮度比接近2:1，表明所提RNA可用于反转录。

[0327] 3.3 定量PCR检测结果：

[0328] 如图20所示，NaCl胁迫枣组培苗后的荧光定量PCR分析结果，表明ZjGPX 在收到NaCl胁迫24h时表达量最高，而后随着胁迫时间的延长表达量下降，48h时已降至与处理开始时的量；不同浓度之间随着浓度的升高表大量增加，而300mM处理表达量最低，这时植株的形态学观察结果也表明叶片萎蔫。说明ZjGPX基因受NaCl胁迫一定时间后上调，当植株萎蔫时表达量下降，因此ZjGPX 与枣苗的耐盐性有关。

[0329] 如图21所示，PEG-6000胁迫辣椒枣组培苗后的荧光定量PCR分析结果。ZjGPX 在受到PEG-6000胁迫时，处理初期30-45min降至最低，1h开始上升，7h时表达最高，而后随着胁迫时间的延长表达量下降，48h时0.8MPa和1.2MPa处理已经没有表达，0.5MPa处理表达量也几乎降为零，此时植株已经变白有死亡迹象。说明ZjGPX 基因受模拟干旱胁迫后上调与枣苗的耐旱性有关，当植株受干旱致死时表达下降至零。