靶向小胶质细胞的基因-载体复合物及其制备方法和应用转让专利
申请号 : CN201110454805.X
文献号 : CN102533855B
文献日 : 2014-01-15
发明人 : 刘勇 , 杨曌 , 罗海鸥
申请人 : 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院
摘要 :
本发明公开了一种靶向小胶质细胞的基因-载体复合物，由CX3CR1shRNA干扰载体与基因载体通过静电作用结合而成，所述基因载体为H9多肽与壳聚糖的偶联物，该复合物通过H9多肽的导向作用，可成功靶向小胶质细胞表面特异性CX3CR1受体分子，在H9多肽发挥对CX3CR1受体的拮抗作用的同时，CX3CR1shRNA干扰载体可高效地转染入小胶质细胞，干扰CX3CR1的表达，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的神经系统疾病的发生或恶化；本发明还公开了该复合物的制备方法，操作简便，所得产品为大小均一的纳米粒，有利于细胞对该复合物的摄取；本发明的复合物可用于制备小胶质细胞活化抑制剂，在由小胶质细胞介导的神经系统疾病治疗领域有着良好的开发应用前景。
权利要求 :
1.靶向小胶质细胞的基因-载体复合物，其特征在于，由CX3CR1 shRNA干扰载体与基因载体通过静电作用结合而成，所述CX3CR1 shRNA干扰载体中shRNA的正义链如SEQ ID No.2所示，反义链如SEQ ID No.3所示，所述基因载体为H9多肽与壳聚糖的偶联物，所述H9多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的靶向小胶质细胞的基因-载体复合物，其特征在于，所述CX3CR1 shRNA干扰载体以pSilencer 2.1-U6neo载体为基础载体。
3.根据权利要求1所述的靶向小胶质细胞的基因-载体复合物，其特征在于，所述H9多肽与壳聚糖的偶联物是以1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺为偶联剂，将H9多肽的羧基与壳聚糖的氨基偶联。
4.权利要求1所述的靶向小胶质细胞的基因-载体复合物的制备方法，其特征在于，在涡旋条件下，向CX3CR1 shRNA干扰载体的磷酸盐缓冲溶液中滴入基因载体溶液，滴加完毕后继续涡旋20~60分钟，再静置20~60分钟，即得靶向小胶质细胞的基因-载体复合物。
5.根据权利要求4所述的靶向小胶质细胞的基因-载体复合物的制备方法，其特征在于，所述CX3CR1 shRNA干扰载体和基因载体的质量比为1:2。
6.根据权利要求4所述的靶向小胶质细胞的基因-载体复合物的制备方法，其特征在于，所述CX3CR1 shRNA干扰载体的制备方法是先将正义链如SEQ ID No.2所示、反义链如SEQ ID No.3所示的1对shRNA单链寡核苷酸片段退火形成shRNA双链寡核苷酸片段，再将所得shRNA双链寡核苷酸片段与经BamH I和Hind III双酶切处理的pSilencer 2.1-U6neo载体进行连接，即得CX3CR1 shRNA干扰载体。
7.根据权利要求4所述的靶向小胶质细胞的基因-载体复合物的制备方法，其特征在于，所述基因载体的制备方法是将壳聚糖溶于pH为5的四甲基乙二胺缓冲液中，加入1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌均匀，再加入H9多肽，室温搅拌反应8~16小时，透析，干燥，制得H9多肽与壳聚糖的偶联物，即基因载体。
8.权利要求1所述的靶向小胶质细胞的基因-载体复合物在制备小胶质细胞活化抑制剂中的应用。
说明书 :
靶向小胶质细胞的基因-载体复合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种具有细胞靶向性的基因-载体复合物，还涉及该基因-载体复合物的制备方法和应用。
背景技术
[0002] 小胶质细胞作为中枢神经系统中参与免疫反应的主要效应细胞，在炎症反应中发挥重要作用。当有外来病原体入侵或有细胞死亡，小胶质细胞会迅速被激活并将其清除，同时释放炎症因子介导炎症反应。但有研究表明，过度活化的小胶质细胞可能加速某些中枢神经系统疾病的进程，而其释放的细胞毒性因子也会对神经细胞造成进一步的损伤。例如，在阿尔茨海默氏症中发现，与神经炎斑块所在的皮层相同区域存在活跃的小胶质细胞；在帕金森氏症中发现，退行性病变主要存在区域——黑质中存在大量活化的小胶质细胞；在多发性硬化中，早期病变中的轴突损害程度与小胶质细胞的活化程度相对应。目前，由小胶质细胞介导的炎症反应被认为是多种神经系统疾病发生或恶化的机制，活化的小胶质细胞通过释放促炎症因子、细胞毒素等多种机制损害神经元及髓鞘。因此，适当抑制小胶质细胞的活化可能是治疗中枢神经系统疾病的有效途径。
[0003] CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）在中枢神经系统中主要在小胶质细胞上表达，其特异性配体CX3CL1属于CX3C家族的δ类趋化因子，主要由神经元分泌。CX3CL1通过CX3CR1受体可促进小胶质细胞的趋化、增殖、存活，细胞内钙水平的升高以及细胞因子和金属蛋白酶的分泌，这些反应能被抗CX3CR1抗体阻止。因此，如果能够有效干扰CX3CR1受体的表达，则理论上可以抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的神经系统疾病的发生或恶化。
[0004] RNA干扰（RNA interference, RNAi）是大多数真核生物体内一种调控基因表达的方式，主要通过小干扰RNA（Small interfering RNA, siRNA）特异性地沉默靶基因的表达，具有高效性、特异性等优点，已被广泛应用于基因功能、细胞信号转导通路、药物靶点筛选、基因治疗等研究领域。因此，可以利用RNAi技术干扰CX3CR1受体的表达。但RNAi技术也面临一个关键问题，就是如何将siRNA有效地传递进入靶细胞。由于siRNA容易被核酸酶降解且真核细胞不易摄取外源性的裸露核酸，直接用siRNA转染细胞效率低下，因此，必须选择适当的载体包裹siRNA，以免siRNA降解并且能够辅助siRNA转染细胞。壳聚糖是从甲壳类生物的贝壳中提取出来的一种多糖，具有良好的生物相容性和生物可降解性，作为药物载体得到广泛应用。壳聚糖富含正电荷，可通过静电作用与带负电荷的siRNA结合，包裹siRNA形成壳聚糖-siRNA纳米粒，从而保护siRNA免受核酸酶的降解，并提高细胞对siRNA的摄取。研究发现，壳聚糖载体携带的siRNA能够高效的转染细胞，同时延长siRNA在体内的半衰期。但壳聚糖载体与目前大多数的病毒和非病毒基因载体一样，都存在缺乏细胞靶向性的缺陷，从而限制了其在基因治疗中的应用。
[0005] US28是人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）编码的四个七次跨膜趋化因子受体之一，具有广谱趋化因子结合活性，在结构上与人源CX3CR1受体的同源性最高。研究发现，来源于US28受体N末端的诱惑配体多肽H9可以阻断人源CX3CR1受体结合生理性趋化因子形成的趋化作用，但其本身不引起趋化运动，不影响胞内信号转导和细胞自然活性；其能够引起细胞表面受体CX3CR1内化，但内化的受体部分能够再循环到细胞表面，对人源CX3CR1受体的生理功能没有明显影响。
发明内容
[0006] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基因-载体复合物，该复合物可以成功靶向小胶质细胞，干扰CX3CR1受体的表达，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的神经系统疾病的发生或恶化。
[0007] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] 靶向小胶质细胞的基因-载体复合物，由CX3CR1 shRNA干扰载体与基因载体通过静电作用结合而成，所述基因载体为H9多肽与壳聚糖的偶联物。
[0009] 优选的，所述CX3CR1 shRNA干扰载体中含有正义链如SEQ ID No.2所示、反义链如SEQ ID No.3所示的shRNA序列。
[0010] 优选的，所述CX3CR1 shRNA干扰载体是以pSilencer 2.1-U6neo载体为基础载体。
[0011] 优选的，所述H9多肽与壳聚糖的偶联物是用1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺将H9多肽的羧基与壳聚糖的氨基进行偶联。
[0012] 本发明的目的之二在于提供一种所述基因-载体复合物的制备方法，操作简便，产品质量稳定可控。
[0013] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0014] 所述靶向小胶质细胞的基因-载体复合物的制备方法，是在涡旋条件下，向CX3CR1 shRNA干扰载体的磷酸盐缓冲溶液中滴入基因载体溶液，滴加完毕后继续涡旋20~60分钟，再静置20~60分钟，即得靶向小胶质细胞的基因-载体复合物。
[0015] 优选的，所述CX3CR1 shRNA干扰载体和基因载体的质量比为1:2。
[0016] 优选的，所述CX3CR1 shRNA干扰载体的制备方法是先将正义链如SEQ ID No.2所示、反义链如SEQ ID No.3所示的1对shRNA单链寡核苷酸片段退火形成shRNA双链寡核苷酸片段，再将所得shRNA双链寡核苷酸片段与经BamH I和Hind III双酶切处理的pSilencer 2.1-U6neo载体进行连接，即得CX3CR1 shRNA干扰载体。
[0017] 优选的，所述基因载体的制备方法是将壳聚糖溶于pH5的四甲基乙二胺缓冲液中，加入1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌均匀，再加入H9多肽，室温搅拌反应8~16小时，透析，干燥，制得H9多肽与壳聚糖的偶联物即基因载体。
[0018] 本发明的目的之三在于提供所述基因-载体复合物在制药领域中的应用，从而为疾病的临床治疗提供更多、更好的备选药物。
[0019] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0020] 所述靶向小胶质细胞的基因-载体复合物在制备小胶质细胞活化抑制剂中的应用。所述小胶质细胞活化抑制剂可以作为治疗由小胶质细胞介导的神经系统疾病的药物，所述由小胶质细胞介导的神经系统疾病包括但不限于阿尔茨海默氏症、帕金森氏症、多发性硬化等。
[0021] 本发明的有益效果在于：本发明公开了一种靶向小胶质细胞的基因-载体复合物，该复合物通过H9多肽的导向作用，可成功靶向小胶质细胞表面特异性CX3CR1受体分子，在H9多肽发挥对CX3CR1受体的拮抗作用的同时，CX3CR1 shRNA干扰载体可高效地转染入小胶质细胞，干扰CX3CR1的表达，抑制小胶质细胞的活化，进而抑制由小胶质细胞介导的神经系统疾病的发生或恶化；本发明还公开了该复合物的制备方法，操作简便，所得产品为大小均一的纳米粒，有利于细胞对该复合物的摄取；本发明的复合物可用于制备小胶质细胞活化抑制剂，作为治疗由小胶质细胞介导的神经系统疾病的药物，在神经系统疾病治疗领域有着良好的开发应用前景。
附图说明
[0022] 图1为高效液相色谱鉴定合成H9多肽的纯度。
[0023] 图2为质谱鉴定合成H9多肽的分子量。
[0024] 图3为透射电镜鉴定本发明的基因-载体复合物。
[0025] 图4为RT-PCR检测本发明基因-载体复合物转染的小胶质细胞中CX3CR1 mRNA的表达水平，1为空白组，2为对照组，3为实验组。
[0026] 图5为免疫印迹法检测本发明基因-载体复合物转染的小胶质细胞中CX3CR1的表达水平，1为空白组，2为对照组，3为实验组。
[0027] 图6为ELISA检测本发明基因-载体复合物转染的小胶质细胞活化后细胞因子的分泌水平。
[0028] 图7为51Cr释放法检测本发明基因-载体复合物转染的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平。
具体实施方式
[0029] 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0030] 一、靶向小胶质细胞的基因-载体复合物的制备
[0031] 1、H9多肽的合成
[0032] H9多肽的氨基酸序列为VLNAHCALH（SEQ ID No.1）。其合成在ABI 431A型固相多肽合成仪上进行，采用标准芴甲氧羰基（Fmoc）方案。起始选用0.125mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯（HMP）树脂，按照H9多肽的氨基酸序列使肽链从羧基端逐个向氨基端延伸，每种氨基酸的用量为0.5mmol，与树脂的摩尔比为4:1。各种氨基酸的α-氨基为Fmoc保护，其余侧链保护基团分别为：Lys(Boc)、Ser(tBu)、Glu(OtBu)、Arg(Pmc)、His(Trt)、Thr(tBu)和Tyr(tBu)。第一个氨基酸连接到树脂上用4-二甲氨基吡啶（DMAP），氨基酸的活化用1-羟基苯并三唑（HOBt）和二环己基碳二亚胺（DCC），偶联后用体积分数为20%的哌啶水溶液去除Fmoc保护基。多肽合成完毕后，将树脂-多肽复合物在冰浴条件下混合于10mL切割液（由结晶苯酚0.75g、1,2-乙二硫醇即EDT 0.25mL、苯甲硫醚0.5mL、去离子水0.25mL和三氟乙酸即TFA 10mL组成）中，室温搅拌反应2小时，使肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基，用G4玻砂漏斗过滤去除树脂，依次用1mL TFA、5~10mL二氯甲烷反复冲洗反应瓶、树脂和漏斗，合并滤液和洗液，在常温低压下蒸发至1~2mL，加入50mL预冷乙醚沉淀多肽，4℃放置过夜，G6玻砂漏斗过滤，真空抽干，即得多肽粗品，-20℃保存备用。
[0033] 将多肽粗品用二甲基亚砜（DMSO）溶解制成浓度为20mg/mL的溶液，经孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤后，在AKTA explorer 100型中压液相色谱仪（瑞典Amerssham Bioscienc公司）上用SOURCE凝胶柱进行纯化。流动相A由体积分数为10%的乙醇和体积分数为0.1%的TFA组成，流动相B由体积分数为90%的乙醇和体积分数为0.1%的TFA组成。洗脱方式为梯度洗脱：先用流动相A洗脱1.5个柱体积，再用流动相A和流动相B的混合液洗脱8个柱体积（流动相B占混合液的体积分数在8个柱体积内由0%逐渐增加至
80%），再用流动相A和流动相B的混合液洗脱0.5个柱体积（流动相B占混合液的体积分数在0.5个柱体积内由80%逐渐增加至100%）。在主峰处收集多肽溶液，冷冻干燥，即得多肽纯品，用DMSO溶解，-20℃保存备用。
80%），再用流动相A和流动相B的混合液洗脱0.5个柱体积（流动相B占混合液的体积分数在0.5个柱体积内由80%逐渐增加至100%）。在主峰处收集多肽溶液，冷冻干燥，即得多肽纯品，用DMSO溶解，-20℃保存备用。
[0034] 将多肽纯品用Delta 600型高压液相色谱仪鉴定纯度。结果如图1所示，合成多肽的纯度达到90%以上。将多肽纯品用API 2000 LC/MS型电喷雾离子化质谱仪鉴定分子量。结果如图2所示，合成多肽的分子量与H9多肽的理论分子量相符。
[0035] 2、H9多肽-壳聚糖偶联物的制备
[0036] 以1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）为偶联剂进行偶联：将0.5g壳聚糖溶于50mL pH5.0的四甲基乙二胺（TEMED）缓冲液中，加入0.5g EDC.HCl和0.5g NHS，搅拌2小时，再加入摩尔量相当于壳聚糖氨基摩尔量50%的H9多肽，室温搅拌反应12小时，透析，冷冻干燥，即得H9多肽-壳聚糖偶联物。
[0037] 3、CX3CR1 shRNA干扰载体的构建
[0038] 根据 NCBI GenBank上公 开 的 人CX3CR1基 因序 列（NM_015898）和 短 发夹RNA（shRNA）的设计原则，先筛选出针对CX3CR1 mRNA不同剪接子的RNAi作用的公共靶点，再根据该公共靶点，设计并合成1对shRNA单链寡核苷酸片段：正 义 链：5 ＇ -aatgcttcctgcctctgtgttt-3 ＇（SEQ ID No.2）， 反 义 链：
5′-atccagccattcagtcttggtt-3′（SEQ ID No.3）；以及1对阴性对照shRNA单链寡核苷酸片段（与人类基因组序列无任何匹配）：正义链：5′-ttctccgaacgtgtacgttt-3′（SEQ ID No.4），反义链：5′-acgtgacacgttcggagaatt-3′（SEQ ID No.5）。将针对CX3CR1 mRNA的1对shRNA单链寡核苷酸片段分别用双蒸水溶解制成浓度为100μmol/L的溶液，再各取
5μL混合，退火形成shRNA双链寡核苷酸片段。将pSilencer 2.1-U6neo载体（Ambion公司）用BamH I和Hind III双酶切，酶切产物进行质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收纯化酶切后的载体片段。将酶切后的载体片段与shRNA双链寡核苷酸片段进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选氨苄青霉素抗性菌落，扩增培养，将菌液送武汉晶赛生物工程技术有限公司进行测序，重组载体中插入片段序列与设计的shRNA序列一致者即为成功构建的CX3CR1 shRNA干扰载体。按照上述方法，采用作为阴性对照的1对shRNA单链寡核苷酸片段，可以构建获得阴性对照shRNA干扰载体。
5′-atccagccattcagtcttggtt-3′（SEQ ID No.3）；以及1对阴性对照shRNA单链寡核苷酸片段（与人类基因组序列无任何匹配）：正义链：5′-ttctccgaacgtgtacgttt-3′（SEQ ID No.4），反义链：5′-acgtgacacgttcggagaatt-3′（SEQ ID No.5）。将针对CX3CR1 mRNA的1对shRNA单链寡核苷酸片段分别用双蒸水溶解制成浓度为100μmol/L的溶液，再各取
5μL混合，退火形成shRNA双链寡核苷酸片段。将pSilencer 2.1-U6neo载体（Ambion公司）用BamH I和Hind III双酶切，酶切产物进行质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收纯化酶切后的载体片段。将酶切后的载体片段与shRNA双链寡核苷酸片段进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选氨苄青霉素抗性菌落，扩增培养，将菌液送武汉晶赛生物工程技术有限公司进行测序，重组载体中插入片段序列与设计的shRNA序列一致者即为成功构建的CX3CR1 shRNA干扰载体。按照上述方法，采用作为阴性对照的1对shRNA单链寡核苷酸片段，可以构建获得阴性对照shRNA干扰载体。
[0039] 4、基因-载体复合物的制备
[0040] 将成功构建的CX3CR1 shRNA干扰载体用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）溶解制成浓度为500μg/mL的溶液。取该溶液100μL，在涡旋状态下以5μL/min的速度向其中滴入浓度为1000μg/mL的H9多肽-壳聚糖偶联物溶液100μL，滴加完毕后继续涡旋30分钟，再静置30分钟，即得基因-载体复合物。将新鲜制备的基因-载体复合物滴于200目铜网上，吸附3分钟，用吸水纸吸干，晾干30秒，以质量分数为1%的醋酸铀水溶液负染30秒，用吸水纸吸干，晾干30秒，80kV透射电镜观察。结果如图3所示，所得基因-载体复合物呈大小均一的近圆形颗粒，绝大多数颗粒长径小于25nm。
[0041] 按照上述方法，采用成功构建的阴性对照shRNA干扰载体，可以制得阴性对照基因-载体复合物。
[0042] 二、靶向小胶质细胞的基因-载体复合物的活性测试
[0043] 1、基因-载体复合物转染小胶质细胞
[0044] 将小胶质细胞BV-2于6孔板内单层培养至覆盖面积约30%，换入无血清DMEM培养基2ml，并加入基因-载体复合物100μL，培养4小时，再换入完全DMEM培养基2mL，培养48小时，收集细胞，用PBS洗涤并重悬，获得基因-载体复合物转染的小胶质细胞。
[0045] 按照上述方法，采用阴性对照基因-载体复合物，可以获得阴性对照基因-载体复合物转染的小胶质细胞。另外，实验以少突胶质细胞HO作为无关细胞对照，按照上述方法，可以获得基因-载体复合物或阴性对照基因-载体复合物转染的少突胶质细胞HO。
[0046] 2、RT-PCR检测基因-载体复合物转染的小胶质细胞中CX3CR1 mRNA的表达水平[0047] 实验设置2个大组：小胶质细胞组和少突胶质细胞组，每个大组又设置3个小组：空白组（未转染的正常细胞）、对照组（阴性对照基因-载体复合物转染的细胞）和实验组（基因-载体复合物转染的细胞）。取各小组细胞，用TRIzol试剂提取细胞总RNA，将所得总RNA用反转录试剂盒（QIAGEN 公司）反转录为cDNA，再以该cDNA为模板，用上游引物5′-caaacacagcaatccaggca-3′（SEQ ID No.6）和下游引物5′-atcactgggcttcaccacttt-3′（SEQ ID No.7）PCR扩增长359 bp的CX3CR1基因片段，以β-肌动蛋白（β-actin）为内参照。PCR扩增参数为：95℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火40秒，72℃延伸30秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物进行质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照，根据各条带的吸光度，利用GEL-Pro Analyzer软件分析细胞中CX3CR1 mRNA的表达水平。结果如图4所示，本发明的基因-载体复合物可以明显降低小胶质细胞中CX3CR1 mRNA的表达水平，但不能降低少突胶质细胞中CX3CR1 mRNA的表达水平，说明本发明的基因-载体复合物可以特异靶向转染小胶质细胞。
[0048] 3、免疫印迹法检测基因-载体复合物转染的小胶质细胞中CX3CR1的表达水平[0049] 实验设置2个大组：小胶质细胞组和少突胶质细胞组，每个大组又设置3个小组：空白组（未转染的正常细胞）、对照组（阴性对照基因-载体复合物转染的细胞）和实验组（基因-载体复合物转染的细胞）。取各小组细胞，用PBS 洗涤2次，加入400μL细胞裂解液，沸水浴加热5分钟，冰上冷却5分钟，1200g、4℃离心10分钟，取上清液测定总蛋白浓度，再取50μg总蛋白上样，用质量分数为12%的聚丙烯酰胺凝胶于200V恒压下电泳分离50分钟，之后将蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，用抗CX3CR1抗体于4℃孵育过夜，再用辣根过氧化物酶标记的抗体IgG（Abcam公司）室温孵育1小时，再用发光液作用5分钟，置暗盒中曝光5分钟，显影、水洗、定影后观察结果。结果如图5所示，本发明的基因-载体复合物可以明显降低小胶质细胞中CX3CR1的表达水平，但不能降低少突胶质细胞中CX3CR1的表达水平，说明本发明的基因-载体复合物可以特异靶向转染小胶质细胞。
[0050] 4、ELISA检测基因-载体复合物转染的小胶质细胞活化后细胞因子的分泌水平 [0051] 设置空白组（正常小胶质细胞BV-2）、对照组（阴性对照基因-载体复合物转染的5
小胶质细胞）和实验组（基因-载体复合物转染的小胶质细胞）。将各组细胞以4×10/孔种植于24孔板中，向细胞培养液内加入脂多糖（LPS）至终浓度为10μg/mL，刺激0.5小时，之后弃去含LPS的细胞培养液并洗涤细胞2次，再加入DMEM培养基1mL，继续培养24小时，吸取细胞培养液，采用ELISA试剂盒测定其中白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。结果如图6所示，本发明的基因-载体复合物可以明显降低活化的小胶质细胞分泌细胞因子的水平。
小胶质细胞）和实验组（基因-载体复合物转染的小胶质细胞）。将各组细胞以4×10/孔种植于24孔板中，向细胞培养液内加入脂多糖（LPS）至终浓度为10μg/mL，刺激0.5小时，之后弃去含LPS的细胞培养液并洗涤细胞2次，再加入DMEM培养基1mL，继续培养24小时，吸取细胞培养液，采用ELISA试剂盒测定其中白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。结果如图6所示，本发明的基因-载体复合物可以明显降低活化的小胶质细胞分泌细胞因子的水平。
[0052] 5、51Cr释放法检测基因-载体复合物转染的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平
[0053] 设置空白组（正常小胶质细胞BV-2）、对照组（阴性对照基因-载体复合物转染的小胶质细胞）和实验组（基因-载体复合物转染的小胶质细胞）。将少突胶质细胞HO用含有质量分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基体外培养，收集细胞，离心洗涤2次，用6
含有质量分数为10%的胎牛血清的RPMI1640培养基调节细胞密度为1×10/mL，取1mL置
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10mL血清瓶中，加入100μCi Na CrO4，37℃孵育90分钟，充分洗涤细胞除去未结合的 Cr，
5
再用含有质量分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞密度为1×10/mL，作为靶细胞。在96孔U型板中，每孔按效靶比为1:1加入效应细胞（按分组加入相应的小胶质细胞）与靶细胞（少突胶质细胞），每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放组（用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞）和最小释放组（用含有质量分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基替代效应细胞）；将96孔板500r/min离心30秒后，37℃孵育4小时，再1000r/min离心10分钟，各孔取上清100μL，用γ计数器测定每分钟放射活性（cpm值），计算杀伤率，杀伤率大于15%判为特异性杀伤。结果如图7所示，本发明的基因-载体复合物可以明显降低活化的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平，说明本发明的基因-载体复合物可以减少活化的小胶质细胞对神经系统的破坏。
含有质量分数为10%的胎牛血清的RPMI1640培养基调节细胞密度为1×10/mL，取1mL置
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10mL血清瓶中，加入100μCi Na CrO4，37℃孵育90分钟，充分洗涤细胞除去未结合的 Cr，
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再用含有质量分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞密度为1×10/mL，作为靶细胞。在96孔U型板中，每孔按效靶比为1:1加入效应细胞（按分组加入相应的小胶质细胞）与靶细胞（少突胶质细胞），每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放组（用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞）和最小释放组（用含有质量分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基替代效应细胞）；将96孔板500r/min离心30秒后，37℃孵育4小时，再1000r/min离心10分钟，各孔取上清100μL，用γ计数器测定每分钟放射活性（cpm值），计算杀伤率，杀伤率大于15%判为特异性杀伤。结果如图7所示，本发明的基因-载体复合物可以明显降低活化的小胶质细胞对少突胶质细胞的杀伤水平，说明本发明的基因-载体复合物可以减少活化的小胶质细胞对神经系统的破坏。
[0054] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。