本发明涉及的是一种病原体高通量检测基因芯片及其应用。芯片包括（1）病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的174条寡核苷酸探针组合；（2）寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列。基因芯片包含基因探针174条，包括鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢杆菌、霍乱弧菌等8类病原体种类特异性基因探针32条；白喉毒素、志贺毒素、葡萄球菌肠毒素和霍乱毒素等7类毒素基因探针25条；超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、常用基因工程载体耐药基因等17大类耐药基因探针117条。基因芯片可用于多种病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的检测。
病原体高通量检测基因芯片及其应用
技术领域
[0001] 本发明病原体高通量检测基因芯片及其应用涉及的是一种多种病原体和耐药基因的高通量检测基因芯片及应用。基因芯片包含各种基因探针174条，包括鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢杆菌、土拉弗朗西斯菌、志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、霍乱弧菌共8类病原体种类特异性基因探针32条；白喉毒素、志贺毒素、肉毒毒素、篦麻毒素、破伤风毒素、葡萄球菌肠毒素和霍乱毒素共7类毒素基因探针25条；超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因等17大类耐药基因探针117条。可用于多种病原体种类特异基因、毒素基因及耐药基因的检测。本发明涉及的技术领域是医学检验和基因芯片技术。
[0002] 背景技术
[0003] 在各种可导致人类疾病的病原微生物中，病原细菌引起的传染病不仅在发病率方面居首位，同时也是造成人类死亡的重要原因。据报道，在任何时刻，估计世界各地有超过140万人患医院感染，且漏报率很高，给临床治疗造成很大困难，也构成了严重的公共卫生问题，给人民生命财产安全造成巨大的损失。随着不同病原体的药物的合成与大量使用，基因工程技术的进步使各种人造耐药菌成为可能。且随着环境污染日趋严重，一些以前从未见过的疾病，又给人类带来了新的威胁。快速、准确、灵敏、特异地对病原体作出诊断，是有效预防感染性疾病发生和控制其迅速传播的前提和关键。
[0004] 目前，大多数卫生医疗机构使用的涉及培养、分离等的传统检验方法检测周期长，操作繁琐，在临床上难以及早进行病原学诊断和耐药性测定，无法满足临床救治危重感染者的需要。比如细菌的培养，根据不同的病原菌类型需要从18h到数天不等，对于个别细菌（如结核分枝杆菌）需要更长的时间，甚至需要专门的实验室生长条件。PCR、分子杂交技术和免疫测定等方法虽然能够节省检测的时间，有较好的特异性和灵敏度，但每次只能检测一种或少量的几种病原菌，要对众多样本进行检测需要做大量的工作，甚至难以实现。
[0005] 基因芯片技术（Gene chip）于上世纪90年代发展起来，是将多种寡核苷酸分子固定于固相载体上形成DNA微阵列，将样品核酸用同位素和荧光等方法标记，与芯片探针杂交检测样本内的多种特异DNA序列，通过计算机系统分析，迅速得到获得样品中大量基因序列特征或基因表达特征信息。基因芯片为感染性疾病的临床诊断提供了有力的工具，与传统检测方法相比有多种优点：能同时进行高通量分析；无需机体免疫应答反应，能早期检测诊断；对检测样品需要量少，效率高；可用于大规模的病原体分类鉴定，毒素因子及耐药性检测等。因此，基因芯片在医学领域中已有了广泛的应用。
[0006] 多种病原微生物的基因组序列已被阐明，各种各样的微生物基因被克隆、测序，为建立病原体高通量检测基因芯片奠定了基础。研制病原体高通量检测基因芯片，能快速鉴定病原体的种类，致病性及抗药性，为临床正确选用药物提供依据，对预防和控制病原菌感染和传播有重大意义。
发明内容
[0007] 本发明目的是针对上述不足，提供一种病原体高通量检测基因芯片及其应用，制备一种能同时高通量检测多种病原体种类特异基因、毒素基因及耐药基因的基因芯片，可对多种病原体进行高通量快速检测。该基因芯片包含各种基因探针174条，其中鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢杆菌、土拉弗朗西斯菌、志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、霍乱弧菌共8类病原体种类特异性基因探针32条；白喉毒素、志贺毒素、肉毒毒素、篦麻毒素、破伤风毒素、葡萄球菌肠毒素和霍乱毒素7类毒素基因探针25条；超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因等17大类耐药基因探针117条。上述探针是参照NCBI数据库提供的各类已发表病原微生物基因序列，依据基因探针设计原则筛选获得。该基因芯片可用于多种病原体检测、鉴定、合理用药、感染病监测及流行病学调查。
[0008] 病原体高通量检测基因芯片及其应用是采取以下技术方案实现：
[0009] 病原体高通量检测基因芯片包括（1）病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的寡核苷酸探针共174条，和质量控制探针2条；（2）寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列；
[0010] 所述的寡核苷酸探针是指化学合成的多种基因序列的高度保守区的互补寡聚核苷酸，长度为十到五十个碱基；
[0011] 所述的病原体高通量检测基因芯片是指能检测病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的寡核苷酸阵列，8类病原体种类特异性基因包括鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢杆菌、土拉弗朗西斯菌、 志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、霍乱弧菌；7类毒素基因白喉毒素、志贺毒素、肉毒毒素、篦麻毒素、破伤风毒素、葡萄球菌肠毒素和霍乱毒素；17大类耐药基因包括超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因；
[0012] 所述的质量控制探针至少包括两种探针，即阳性对照和阴性对照；阴性对照用于检测杂交信号错误或污染，阳性对照用于检测是否正常杂交的和准确定位；
[0013] 所述的手臂分子指具有双活性基团的长链有机化合物；
[0014] 所述寡核苷酸固定为寡聚核苷酸的末端有一特定基团，固化在载体材料基质表面时与表面修饰的手臂分子的末端基团形成共价键；
[0015] 所述的174条基因探针，其中探针的任何组合，用于基因芯片等的制备，固相载体材料包括但不仅限于玻片、金属片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纤维膜、尼龙膜等。
[0016] 所述的病原体高通量检测基因芯片，用于病原体检测、鉴定、合理用药、感染病监测及流行病学调查。
[0017] 这些探针的固相载体材料包括多种方法处理的玻片、金属片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纤维膜、尼龙膜和其它高分子聚合物制成的膜及片等。
[0018] 这些固相载体表面以具有双活性基团的长链有机化合物进行修饰，常用的有：戊二醛、三羟甲基氨基硅烷（APTES）、N,N-二乙氧基氨基丙基三乙氧基硅烷、多聚赖氨酸，可采用其中的一种或其中的两种的组合。
[0019] 病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的174条基因探针选择及设计原则：
[0020] 根据NCBI数据库中各类已发表病原微生物基因序列，选择探针长度在40～50nt，5’末端进行氨基化修饰并附加10个碱基T。其它参数如退火温度Tm和GC%含量等按照设计原则进行严格控制。每种探针均经两种以上生物学软件筛选，再以人工选定和调整，Blast验证，最终选择具有各类病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因代表性的序列作为检测探针。探针设计的原则如下：
[0021] （1）高度的特异性和敏感性
[0022] 筛选出的探针应该位于基因序列的高保守区，以保证探针的特异性和敏感性；同时，筛选的探针应该于人基因组序列、其他细菌和微生物、相关动物的基因组序列、环境中常见植物基因序列尽可能同源性低，以避免假阳性结果。寻找和筛选出高度特异性探针是至关重要的。
[0023] （2）病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因探针的Tm值尽可能一致[0024] 因为在一张芯片是同时进行多条探针的杂交反应，在一定温度下，此时各探针Tm值至关重要，如果Tm值不一致，差距过大，杂交后的荧光信号强弱会受到相当的影响。一般Tm值相差小于三度比较适宜。
[0025] （3）各种探针有近似的碱基长度
[0026] 芯片探针的长度，对检测的敏感性和特异性有一定的影响。各探针碱基长度一致，在一定程度上可消除杂交后芯片扫描仪扫描焦距定位所带来的差异，我们设计的探针碱基数目在40～50nt。
[0027] （4）筛选的探针尽可能避免二级结构
[0028] 探针应该最好没有发夹结构，自身二聚体，错配等。否则容易形成错误结果。
[0029] （5）避免选取G、C富集区域的序列做探针
[0030] （6）病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因探针的互补序列之间不形成二聚体和错配
[0031] 探针筛选的方法：
[0032] 登陆美国生物技术中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）主页，从NCBI数据库中检索了病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的序列，比较同一类别基因序列有无存在变异情况，根据上述探针设计原则，用Primer Primers5.0，Oligo6.0等生物学软件在基因的碱基对齐图上找出所有可能的探针，结合Clustal W等同源性分析软件找处特定基因靶基因DNA序列的高度保守区，选择核酸序列的Blast，进行数据库类似检索（同时检索GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库），筛选的探针于已知人类基因组序列，其它常见细菌和微生物、相关动物的基因组序列、环境中常见植物基因序列尽可能同源性低，碱基数40～50nt左右，Tm值平均83～84℃之间，G+C含量约为50%，根据Blast结果，再结合需求和经验，手工对筛出的探针进行微调和整修。然后对得到的病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因探针用RNA Structure软件进行分析，以排除不同探针互补序列间形成影响和干扰杂交的二级结构。阳性内参照探针采用的是与病原体微生物基因无同源性的植物基因序列片段。在后面实际的芯片杂交检测中，根据总体的需要和检测的结果，调整了部分使用的探针。
[0033] 设计筛选的病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的174条基因探针[0034] 所述的检测病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的174条寡核苷酸基因探针如下:
[0035] 病原体微生物的种类检测鉴定选择两组探针，一组检测特异性结构基因保守序列，另一组检测关键性毒素基因。每组探针正、负链探针各一条。
[0036] 鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌根据鼻疽假单胞菌和类鼻疽假单胞菌的基因序列选择结构保守序列16S rDNA和毒素基因flagellin C设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0037] 16S rDNA正链探针5'-NH2-T(10)GGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGG
[0038] 16S rDNA负链探针5'-NH2-T(10)TTGCGGTTAGACTAGCCACTTCTGGTAAAACCCACTCCCATG
[0039] flagellin C基因正链探针5'-NH2-T(10) TCAACAGCAACATTAACTCGTTGGTCGCTCAACAGAACCTCA
[0040] flagellin C基因负链探针5'-NH2-T(10) TGTAGTTCGTCTGCGAAGCGATACGGTTCACTTCCGAGATC
[0041] 布鲁氏菌选择有1430个碱基的结构基因16S ribosomal特异序列和布鲁氏菌热休克蛋白31KD基因设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0042] 16S ribosomal正链探针5'-NH2-T(10) CGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAAT
[0043] 16S ribosomal负链探针5'-NH2-T(10) CGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTC
[0044] 31KD基因正链探针5'-NH2-T(10) CGTAAGGATGCAAACATCAAATCGGTCGCAGACCTGAAAG[0045] 31KD基因负链探针5'-NH2-T(10) AGAACCTTGGTGATGTTATAGATGAGGTCGTCCGGCTGCTTG
[0046] 沙门氏菌的hilA基因编码侵袭基因正调节蛋白，是inv基因的正转录调节蛋白。沙门氏菌的侵袭蛋白(invasion protein,inv)与沙门氏菌的致病性密切相关，它是由invA,invB.invC.invD和invE等一组基因编码，其中invA为沙门氏菌的主要毒素因子，序列保守，选择这两种基因设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0047] hilA基因正链探针5'-NH2-T(10) GCCGCAACCTACGACTCATACATTGGCGATACTTCCTTTTCA
[0048] hilA基因负链探针5'-NH2-T(10) CCTCCTCCAACTGACCAGCCATGAAAAGATTCCAGCCATAAT
[0049] invA基因正链探针5'-NH2-T(10) TTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCA
[0050] invA基因负链探针5'-NH2-T(10) CCCCTCTTCATGCGTTACCCAGAAATACTGACTGCTACCTTGC
[0051] 鼠疫耶尔森菌的3a是一段特异的染色体序列，相关实验提示这段序列可作为鼠疫PCR检测的良好靶序列，探针设计参照Radnedge等报道的3a序列设计。另选择质粒上的毒素因子荚膜蛋白基因cafl设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0052] 3a序列正链探针5'-NH2-T(10) TTGTATGGCACGGACAGAAACTTAGCAGTGAGGACTGGAAGC[0053] 3a序列负链探针5'-NH2-T(10) ATATTACCGCCATGAAATGGACAATGATGCCCACCTAACCCT[0054] cafl基因正链探针5'-NH2-T(10) GGTACGCTTACTCTTGGCGGCTATAAAACAGGAACCACTAGCACA
[0055] cafl基因负链探针5'-NH2-T(10) GCATCAGTGTATTTACCTGCTGCAAGTTTACCGCCTTTGGAACC
[0056] 炭疽芽孢杆菌的毒素除决定于染色体基因外，还与毒素质粒(pXO1 )和荚膜质粒(pXO2)这两个编码质粒的致病因子有关。pXO1由三个部分组成：水肿因子(EF)、保护性抗原(PA)和致死因子(LF)。pXO2含CapB，CapC和CapA，编码荚膜蛋白，为正常毒素所必须。根据pXO1的水肿因子(EF)和pXO2设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0057] EF基因正链探针5'-NH2-T(10) GTGGCTACAAAGGGATTGAATGTTCATGGAAAGAGTTCGGATTG
[0058] EF基因负链探针5'-NH2-T(10) TCTGCTGACGTAGGGATGGTATTTATTTTGGCTTTTGTAATCGGATCA
[0059] pXO2基因正链探针5'-NH2-T(10) AACTTAGAAGGCTGGTCAACAAGTGAAATTATGTCTCGTATGCGTCCA
[0060] pXO2基因负链探针5'-NH2-T(10) GAAGTACATGCGGATGGTGTCCCACAATAATATCTGCCCCTG
[0061] 土拉弗朗西斯菌探针根据Francisella 23kDa结构蛋白和外膜蛋白FopA基因设计，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0062] Francisella 23kDa基因正链探针5'-NH2-T(10) TGGTCTTACAACATCTCAAGGAAGCTTGCCAGTATGTTGCGC
[0063] Francisella 23kDa基因负链探针5'-NH2-T(10)TGAATGGTCTCGCCACTTGTTACCTGTTGTCTTGTTATCATCTCACTC
[0064] FopA基因正链探针5'-NH2-T(10) CAACAGGTGCTTGGGATGTGGGTGGTGGTCTTAAGTTTGAACTAT
[0065] FopA基因负链探针5'-NH2-T(10) GCACCAATCATGTTAGTACCCGCTCTGCCATTAGCACCAGAAATAT
[0066] 志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌（EIEC），以质粒和基因组中都存在的序列-侵袭性质粒相关抗原(invasion plasmid antigen，ipa)的片段H为模板，存在多拷贝，易于检测。志贺氏菌中侵袭性相关基因ipaBCD是重要组成成分之一，为志贺菌侵入上皮细胞所必需的，ipaB－ipaC形成复合物，针对ipaC设计探针。每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0067] ipaH基因正链探针5'-NH2-T(10) GCCCGCAGATTTACTTCTCCATGAGTGACGGACAACAGAATAC
[0068] ipaH基因负链探针5'-NH2-T(10) GCATGGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTATCTCATCCACAAAAT
[0069] ipaC基因正链探针5'-NH2-T(10) CAAGTAGGTATAACGGGTATCGGTGCCAAAAAAACGCATTCAGG
[0070] ipaC基因负链探针5'-NH2-T(10) CAATGACAATTGAGAGCCCAATTTAGTTTCTGCAGTGCGGAGA
[0071] 编码霍乱弧菌外膜蛋白的基因(ompW)被认为是霍乱弧菌的标志基因，编码霍乱毒素A亚单位（CtxA基因）是霍乱肠毒素的活性部分。根据这两个基因设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0072] ompW基因正链探针5'-NH2-T(10) CGCTTGGCTATATGTTTACTGACAACATCAGTTTTGAAGTCCTCGCTC
[0073] ompW基因负链探针5'-NH2-T(10) CGTTAGCAGCAAGTCCCCATGAGTCGTCCAGTTTTAAATCACTC
[0074] CtxA基因正链探针5'-NH2-T(10) GATATTGCTCCAGCAGCAGATGGTTATGGATTGGCAGGTTTC
[0075] CtxA基因负链探针5'-NH2-T(10) GAAACATATCCATCATCGTGCCTAACAAATCCCGTCTGAGTTCCT
[0076] 七种毒素序列检测选择毒素的生物活性部分的探针。
[0077] 白喉毒素免疫毒素的细胞毒性源自DT的酶活性区和跨膜转运区，即N端389个氨基酸。其前193个氨基酸为白喉毒素(Diphtheria toxin , DT)A片段(DTA) 是白喉毒素的酶活性区，也是DT 类免疫毒素的关键结构域，根据其设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0078] DTA基因正链探针5'-NH2-T(10) TCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAA
[0079] DTA基因负链探针5'-NH2-T(10) AGTTAGCCCCAGCGAATACAGGATTGGTCCCAGTAACGGTTT
[0080] 在引起细菌性痢疾的志贺菌属中，以Ⅰ型痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae type I)引起的腹泻最为严重，主要原因是它能产生一种高水平的外毒素一志贺毒素(Shiga Toxin, ShT)。ShT具有肠毒性、细胞毒性和神经毒性等3种生物活性，根据其设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0081] ShT基因正链探针5'-NH2-T(10) GATTTAATGTCGCATAGTGGAACCTCACTGACGCAGTCTGTGG
[0082] ShT基因负链探针5'-NH2-T(10) CCATGATAGTCAGGCAGGACACTACTCAACCTTCCCCAGTTCAAT
[0083] 肉毒毒素是已知最剧烈的毒物，有嗜神经毒性，可以分为A、B、C1、C2、D、E、F、G、H八个型，各型毒素药理作用相同，但抗原性不同，只能被同型的抗毒素中和。选择了4个基因设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共8条：
[0084] 1、Clostridium botulinum neurotoxin BoNT gene
[0085] BoNT基因正链探针5'-NH2-T(10) TTGAGGAGTCACTTGAAGTTGATACAAATCCTCTTTTAGGTGCAGGCA
[0086] BoNT基因负链探针5'-NH2-T(10) GAGTAGAGCCATAACCATTTCGCGTAAGATTCAAAACTTCATGTCCA
[0087] 2、the gene of botulinum type B toxin.
[0088] B型基因正链探针5'-NH2-T(10) TGGAGGGCAAGATCCCAGCATCATAAGTCCTTCTACGGATAAA
[0089] B型基因负链探针5'-NH2-T(10) GCTCCTGCAATCTCAAAAGCATTTTCAAAATTTCCTTTAGCTGTTTCA
[0090] 3、Clostridium botulinum bont/E gene for botulinum neurotoxin type [0091] E型基因正链探针5'-NH2-T(10) AGCAATGGATGTTTTTGGAACTTTATTTCTGAAGAACATGGATGGCAA
[0092] E型基因负链探针5'-NH2-T(10) TCCATTTTTTAATGAAGTAGGCGGATGAAAATCTTGGGGGGTTGT
[0093] 4、Clostridium botulinum neurotoxin type F gene
[0094] F型基因正链探针5'-NH2-T(10) TGCACTGCATGGATTATACGGGGCTAGGGGAGTTACTTATGAAGA
[0095] F型基因负链探针5'-NH2-T(10) CGTTCTTTAATGAAGCCGGTGGATCAAAATCACTAGGATTCGTTCC
[0096] 篦麻毒素Ricin是一种从蓖麻种子的胚乳中提取的糖蛋白，由A、B两条肽组成的异二聚体。A链(RTA)分子量为30(或32)KDa，是一种糖苷酶；B链(RTB)的分子量为32 KDa。Ricin属核糖体失活蛋白，是一种细胞毒素，必须进入细胞才能发挥毒性。根据A链设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0097] RTA基因正链探针：5'-NH2-T(10) ACGAGAATTAGGTACAACCGGAGATCTGCACCAGATCCTAGCG
[0098] RTA基因负链探针：5'-NH2-T(10) TGATTGTCAGGATGAAAGAAATATGCGCTATTTCCAGCACGGTAG
[0099] 破伤风毒素（Tetanus toxin）是一种强烈的神经毒素，由破伤风梭菌(Clostridium Tetani )产生，可被蛋白酶切成两条轻链)和一条重链。重链有与受体结合的功能而无毒性作用。毒素由一个75kb大质粒上一段核昔酸编码，编码基因长约4kb，为一大的开放读码框架，该基因分为A、B、C 3个片段，A片段编码毒性蛋白，B片段编码穿膜蛋白，C片段编码结合蛋白。基因工程做疫苗一般克隆的是无神经毒性的C片段，针对发挥毒性作用的轻链281－1651序列设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0100] 正链探针：5'-NH2-T(10) ATCCAATAAGTGCTGAAGAACTATTCACTTTTGGCGGACAGGATGC[0101] 负链探针：5'-NH2-T(10) TGTCCCAAATTCATACCTTTCCGGCACTATCCAAATACGATCTGTT[0102] 产肠毒素性葡萄球菌具有多种毒素致病因子，其中最主要的是它所产生的A，B，C1，C2，C3，D和E七型热稳定性肠毒素(staphy-lococcal enterotoxin，SE)，可引起人畜发生食物中毒，也能成为生物战毒剂的毒素。选择了4个基因设计探针，每个基因选取正负链探针各一条或通用探针，共9条：
[0103] 1、SEC1、SEC2、SEC3，以SEC2序列为参考
[0104] SEC2基因正链探针5'-NH2-T(10) TTTTGGTATGATATGATGCCTGCACCAGGCGATAAGTTTGACC
[0105] SEC2基因负链探针5'-NH2-T(10) TGTAAGTTCCCATTATCAAAGTGGTTTCCTTCATGTTTTGTTATTCCTCCA
[0106] 2、SEB
[0107] SEB基因正链探针5'-NH2-T(10) ACCAGATGAGTTGCACAAATCGAGTAAATTCACTGGTTTGATGGAA
[0108] SEB基因负链探针5'-NH2-T(10) TCCTGGTGCAGGCATCATGTCATACCAAAAGCTATTCTCATTTTCT
[0109] 3、SED
[0110] SED基因正链探针5'-NH2-T(10) AAAATGTTACCGTACAAGAATTAGATGCACAAGCAAGGCGCTATTTGC
[0111] SED基因负链探针5'-NH2-T(10) TGGAGTGACACCTCCATATGTACAAGCAGTCCTATCTATTTCACCACCAT
[0112] 4、SEA和SEE
[0113] SEA基因正链探针5'-NH2-T(10) TATGGTGCTTATTATGGTTATCAATGTGCGGGTGGTACACCAAACA
[0114] SEE基因正链探针5'-NH2-T(10) TCATAACTTACCGTGGACCCTTCAGAAGAATGAAACACAATCAAGCC
[0115] SEA，SEE基因通用负链探针5'-NH2-T(10) TTCGCTTTTCTCGCTACCATTTACAAGTGGACTTGTTGTCAACGT
[0116] 霍乱毒素见微生物霍乱弧菌检测部分。
[0117] 耐药基因数目、分类复杂，部分序列变异而成为亚类的多见。因此在充分的同源性比较及分析的基础上，尽可能采取通用探针检测。在用通用性探针覆盖更多的耐药基因的情况下，同时重点对主要的，危害大的，易造成流行和对多药耐药而难以控制的，能做成生物战剂的一系列耐药基因进行全面检测。
[0118] 整合酶类基因探针选自Ⅰ类整合酶基因（IntI1）和Ⅱ类整合酶基因（IntI2），每个基因选取正负链探针各一条,共4条探针：
[0119] intI1基因正链探针5'-NH2-T(10)CCAGTGGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAACTGTAATGCAAGTAGC-3'
[0120] intI1基因负链探针5'-NH2-T(10)CTCTACGACGATGATTTACACGCATGTGCTGAAAGTTGGCG-3'
[0121] intI2基因正链探针5'-NH2-T(10)GGGCATTTAAAGCGATTTTCTGCGTGTTTATGGCTACATGTCTG-3'
[0122] intI2基因负链探针5'-NH2-T(10)ATGCTTGCGTTTGCGGGTTAAAGATTTTGATTTTGATAATGGCTG-3'
[0123] 四环素家族耐药基因探针选择tetM基因,设计正负链探针各一条，Tet(M)是研究得最多的核糖体保护蛋白，具有核糖体依赖的GTP水解酶活性，共2条探针：
[0124] tetM基因正链探针5'-NH2-T(10)AGTGGGAAAATACGAAGGTGAACATCATAGACACGCCAGGACA-3'
[0125] tetM基因负链探针5'-NH2-T(10)AAGCGGATCACTATCTGAGATTTCCAAAAGGGCATCAAGCAA-3'
[0126] 氨基糖甙类药物耐药基因探针，选取了易于传播并且危害较大的氨基糖甙类修饰酶基因有aac(3)-I、aac(3)-II、aac(3)-III、aac(3)-IV、aac (6')-I、aac(6')-II、aphA6， ant(3')-I和ant(2'')-I共9种，每个基因选取正负链探针各一条, 共18条探针：
[0127] aac(3)-I基因正链探针5'-NH2-T(10)GGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATC-3'
[0128] aac(3)-I基因负链探针5'-NH2-T(10)GAAAAGATCAAGAGCAGCCCTCATGGATTTGACTTGGTCAGG-3'
[0129] aac(3)-II基因正链探针5'-NH2-T(10)GTCGAAACTATAGCAAATGCTTACGTGAAGCTCGGTCGCCAT-3'
[0130] aac(3)-II基因负链探针5'-NH2-T(10)AATCGAGAATGCCGTTTGAATCGTATTCTGATGCCGTTTTCC-3'
[0131] aac(3)-III基因正链探针5'-NH2-T(10)TGGCTAAACTGGTGGCAATAGAAGGATACGTGCTGATGCTTG-3'
[0132] aac(3)-III基因负链探针5'-NH2-T(10)CTATCCGTATGACGCTGAGTCACCGAACCGTGATTCAAGC-3'
[0133] aac(3)-IV基因正链探针5'-NH2-T(10)CTCAAGGAGAAGAGCCTTCAGAAGGAAGGTCCAGTCGGTCAT-3'
[0134] aac(3)-IV基因负链探针5'-NH2-T(10)GTACCAACTTGCCATCCTGAAGAATGGTGCAGTGTCTCGG-3'
[0135] aac (6')-Ib基因正链探针5'-NH2-T(10)ACTTGCTGACGTACAGGAACAGTACTTGCCAAGCGTTTTAGCG-3'
[0136] aac (6')-Ib基因负链探针5'-NH2-T(10)ACTGGTCTATTCCGCGTACTCCTGGATCGGTTTCTTCTTCCC-3'
[0137] aac (6')-II基因正链探针5'-NH2-T(10)GGTGGGAAGATGAAACTGATCCAGGAGTGCGAGGAATAGACC-3'
[0138] aac (6')-II基因负链探针5'-NH2-T(10)GTAGTGTTCCAGCACTTCATCAAGAGTCGGTCGCTCTTCGTC-3'
[0139] aphA6基因正链探针5'-NH2-T(10)TTGCCCAATATTATTCAACAATTTATCGGAAACAGCGTTTTAGAGCCA-3'
[0140] aphA6基因负链探针5'-NH2-T(10)CGATTAAAAGAATAAACATCCGATGGCGACTGACCAATTTTATTTGGC-3'
[0141] ant( 3')-I基因正链探针5'-NH2-T(10)TTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATG-3'
[0142] ant( 3')-I基因负链探针5'-NH2-T(10)ACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAG-3'
[0143] ant(2'')-I基因正链探针5'-NH2-T(10)TACAAAGCACATAGAGTCCTACAGGCTCGCATGCACCTCACTC-3'
[0144] ant(2'')-I基因负链探针5'-NH2-T(10)CATCGGCATAGTAAAAGTAATCCCAGATGATCGCCTCCCAGC-3'
[0145] 耐消毒剂qacA/B家族基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0146] qacA/B基因正链探针5'-NH2-T(10)GATTTAGCTCATGTAGCTGAAGAATCTGTAGTGGGCGCTGTCGAA-3'
[0147] qacA/B基因负链探针5'-NH2-T(10)TGCCATGAAAATTGCTCAAGTAAAGCTCCTCCGATAATTGGTCC-3'
[0148] 红霉素耐药相关基因探针，已发现Erm基因家族有20余种基因亚型，以ErmA，ErmB和ErmC三型为主，每个基因选取正负链探针各一条，共6条探针：
[0149] ErmA基因正链探针5'-NH2-T(10)GATCCCCTACGGCATCACCTCCGCCATCGTCGACTGGT-3'
[0150] ErmA基因负链探针5'-NH2-T(10)ACCCGTCGAGGAGCTGGAACAGCGTGATCCACTGGTCG-3'
[0151] ErmB基因正链探针5'-NH2-T(10)TTGAAAGCCATGCGTCTGACATCTATCTGATTGTTGAAGAAGGATTC-3'
[0152] ErmB基因负链探针5'-NH2-T(10)GCAAGAGCAACCCTAGTGTTCGGTGAATATCCAAGGTACGCTT-3'
[0153] ErmC基因正链探针5'-NH2-T(10)CGTGGAATACGGGTTTGCTAAAAGATTATTAAATACAAAACGCTCATTG
[0154] GC-3'
[0155] ErmC基因负链探针5'-NH2-T(10)GGGTAAAATGCCCTTTTCCTGAGCCGATTTCAAAGATATTATCATGTTC-3'
[0156] 大环内酯类外排（mefA）基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0157] mefA基因正链探针5'-NH2-T(10)TACCCCAGCACTCAATGCGGTTACACCACTTTTAGTACCAGAAGAA-3'
[0158] mefA基因负链探针5'-NH2-T(10)TGCAATCACAGCACCCAATACGTCGATGGCAATAATAGCATTTAA-3'
[0159] 耐万古霉素耐药基因探针，选用了由不同的耐药基因簇编码的VanA、VanB、VanC1、VanC2、VanD，VanE6种表型，每个基因选取正负链探针各一条，共12条探针：
[0160] VanA基因正链探针5'-NH2-T(10)AAAATCTTAATTGAGCAGGCTGTTTTGGGCTGTGAGGTCGGT-3'
[0161] VanA基因负链探针5'-NH2-T(10)TACAAATCGCTGAGCTTTGAATATCGCAGCCTACAAAGGGGA-3'
[0162] VanB基因正链探针5'-NH2-T(10)ACGGAAGAACTTAACGCTGCGATAGAAGCGGCAGGACAATAT-3'
[0163] VanB基因负链探针5'-NH2-T(10)CCGTATCAATGTTCGCAGCAATTTCTATTGCGGATTTTACCGA-3'
[0164] VanC1基因正链探针5'-NH2-T(10)CTTGAACTAATGAACCTGCCTTATGTTGGTTGCCATGTCGCTG-3'
[0165] VanC1基因负链探针5'-NH2-T(10)CACAGTAGAACCGTAAGCAAAAGCAGTCGTTAATGCAGATTGGAGC-3'
[0166] VanC2基因正链探针5'-NH2-T(10)AAATCAATACTATGCCGGGCTTTACGAGTCACTCCCGCTATCC-3'
[0167] VanC2基因负链探针5'-NH2-T(10)CGTCTACTAATGAAATGGCGTCACAAGCACCGACAGTCAAAGA-3'
[0168] VanD基因正链探针5'-NH2-T(10)AGGAACATGATGTTTCAGTGAAATCTGCGATGGAGGTTGCA-3'
[0169] VanD基因负链探针5'-NH2-T(10)ATGCGTGGATAACGGCTATAGGAAGTAAATCCAGGCATGGTGTTC-3'
[0170] VanE基因正链探针5'-NH2-T(10)CATGGAGGTTATGGTGAGAATGGTGCTATGCAGGGAGTATTTGAG-3'
[0171] VanE基因负链探针5'-NH2-T(10)TGTCGTTCCTTCAAATAGATACCAATGACCTTCTTCGGTGATCCCTA-3'
[0172] 多药耐药外排泵基因探针，选择包括AcrAB- TolC，OprM和Sme DEF外排泵基因，每个基因选取正负链探针各一条，共6条探针：
[0173] AcrAB-TolC基因正链探针5'-NH2-T(10)GCAGAAGTTCGTCCTCAAGTTAGCGGGATTATCCTGAAGCGT-3'
[0174] AcrAB-TolC基因负链探针5'-NH2-T(10)TTCAGCAGGATTTTGCCGAACTCTTCAGTAGAGGTCAGACGC-3'
[0175] OprM基因正链探针5'-NH2-T(10)CCAAAAGAGGGCGGGATAGGCTAGAGCCCCTATAGCACTAGG-3'
[0176] OprM基因负链探针5'-NH2-T(10)GTAGCTGCGCTGGGTCAGGTCGAAACTCTTCTGGTAGGTG-3'
[0177] Sme DEF基因正链探针5'-NH2-T(10)AGTACCGATGGAAGTGATCCCCATGAAAAGTGCATCCCTGTT-3'
[0178] Sme DEF基因负链探针5'-NH2-T(10)GTTGGACGAGCTGTTGGAGGAGAAGTAGATCAGGCCATCAAG-3'
[0179] 耐莫匹罗星（ileS）基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0180] ileS基因正链探针5'-NH2-T(10)GAGCCGATTCTTTAAGATGGGCCTTAATTTCGGATAGTGCTCCA-3'
[0181] ileS基因负链探针5'-NH2-T(10)TTTCTGGTTATCAAAAGGATAATGATGCTGAGCAAACGGCATAGAGC-3'
[0182] 磺胺类耐药基因探针，选择了dfrA和dfrD两型，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0183] dfrA基因正链探针5'-NH2-T(10)GGAAACCATTGCCAAATAGACGTAACGTCGTTCTCACTAACCAAGCT-3'
[0184] dfrA基因负链探针5'-NH2-T(10)CGTCCCATTACAAGTGTATTCCCAGTGGTCAGTTGTTTAACATGCTTT-3'
[0185] dfrD基因正链探针5'-NH2-T(10)TTGTTGCGATGGATAAGAAAAGAGTAATCGGCAAGGATAACGACATTC-3'
[0186] dfrD基因负链探针5'-NH2-T(10)CCCTTCCGATTGATTGAAGGTTCTTTCTACCTAATATGATTGCATGTCCT-3'
[0187] 泰洛星（tlrB）耐药基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0188] tlrB基因正链探针5'-NH2-T(10)CTACGGTCATGCGGAAGAACGTCGTGCGATATCTGCGCTGTC-3'
[0189] tlrB基因负链探针5'-NH2-T(10)AGCTTCGTCGGGCGTCTGAGCAGATTCACATAGCCCTGCC-3'
[0190] 氟喹诺酮类（norA）药物耐药基因探针，norA基因介导的耐药在金葡菌中相当常见，设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0191] norA基因正链探针5'-NH2-T(10)TCCTCACAAAGCAACTACTGATGGATTCCACCAATATCAACCTGAA-3'
[0192] norA基因负链探针5'-NH2-T(10)TCGTCCAATAACCGTTTGCAAGCACTAACATAACGAGAACAATGG-3'
[0193] β内酰胺酶类（BLA）耐药基因探针，划分为超广谱β内酰胺酶、头胞菌素酶、碳青霉烯酶、金黄色葡萄球菌（MRSA）金标准mecA基因。
[0194] 其中超广谱β内酰胺酶（ESBLs）耐药基因，按不同编码基因同源性分为TEM型、SHV型、CTX-M型（由于各亚型间CDS核酸基因序列差异较大，根据其序列的同源性分3组），PER型和VEB型，每个基因选取正负链探针各一条，共14条探针：
[0195] TEM基因正链探针5'-NH2-T(10)TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAA-3'
[0196] TEM基因负链探针5'-NH2-T(10)GCGTCAACACGGGATAATACCGCACCACATAGCAGAACTTTAA-3'
[0197] SHV基因正链探针5'-NH2-T(10)TAACAAAGCAGAGCGCATCGTGGTGATTTATCTGCGGGATA-3'
[0198] SHV基因负链探针5'-NH2-T(10)AGTAGTCCACCAGATCCTGCTGGCGATAGTGGATCTTTCGC-3'
[0199] CTX-M1基因正链探针5'-NH2-T(10)ATGAGACGTTTCGTCTGGATCGCACTGAACCTACGCTGAATA-3'
[0200] CTX-M1基因负链探针5'-NH2-T(10)CCGCCATAACTTTACTGGTACTGCACATTGGAAAGCGTTCATC-3'
[0201] CTX-M2基因正链探针5'-NH2-T(10)AAGAAGAGCGACCTGGTTAACTACAATCCCATTGCGGAGAAACA-3'
[0202] CTX-M2基因负链探针5'-NH2-T(10)CCCAGATGGGCAATCAGCTTATTCATGGCAGTATTGTCGCTAT-3'
[0203] CTX-M3基因正链探针5'-NH2-T(10)GCGGTGCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAATC-3'
[0204] CTX-M3基因负链探针5'-NH2-T(10)CGTGAGCAATCAGCTTATTCATCGCCACGTTATCGCTGTACT-3'
[0205] PER基因正链探针5'-NH2-T(10)CGGCCACTAATGATTTAGGTATCATTCTGTTGCCTGATGGACG-3'
[0206] PER基因负链探针5'-NH2-T(10)GCACTGGAACACTAAACTCGTCTCCCTGATACGCTTTCATTATCGG-3'
[0207] VEB基因正链探针5'-NH2-T(10)AGATTACCCCTCAAGACCTTTTGCCTAAAACGTGGAGTCCGATTAAA-3'
[0208] VEB基因负链探针5'-NH2-T(10)TTTGATATTGGGTATTCCAATCCTTGTGCATTTGTTCTTCGTTTGCT-3'
[0209] 头孢菌素酶（AmpC）耐药基因探针分为6组，几乎涵盖了所有的质粒AmpC基因序列，设计正负链探针各六条，共12条探针：
[0210] AmpC基因正链探针第一条5'-NH2-T(10)AGCATCCAGCCGCTGCTCAAGGAGCACAGGATC-3'
[0211] AmpC基因负链探针第一条5'-NH2-T(10)GCCTGCTTCGGCACATTGACATAGGTGTGGTGCAT-3'
[0212] AmpC基因正链探针第二条5'-NH2-T(10)CCAGAACTGACAGGCAAAAAGTGGCAGGGTATCCGC-3'
[0213] AmpC基因负链探针第二条5'-NH2-T(10)GTTTTCTCCTGAACGTGGCTGGCATCCATGTTGGC-3'
[0214] AmpC基因正链探针第三条5'-NH2-T(10)CTTTCACAGGTGTGCTGGGTGCGGTTTCTGTGGC-3'
[0215] AmpC基因负链探针第三条5'-NH2-T(10)GTACGCATACTGGCTTTGCGCACTTTCCGGCACAGTAATAAA-3'
[0216] AmpC基因正链探针第四条5'-NH2-T(10)TATGGGTTAGCGGCAAAACAGCCTCAGCAGCCGGTTA-3'
[0217] AmpC基因负链探针第四条5'-NH2-T(10)AGACTTTTCGCCGCAATCATCCCTAGCAAACCAGTACCGATA-3'
[0218] AmpC基因正链探针第五条5'-NH2-T(10)CGCTTTTATCAAAACTGGCAGCCGCAGTGGAAGCC-3'
[0219] AmpC基因负链探针第五条5'-NH2-T(10)CGAGCTGCTTTTCAGGAATAAATGCCACGTAGCTGCCAAAC-3'
[0220] AmpC基因正链探针第六条5'-NH2-T(10)CATGGCGAACTATGCCTACGGCTATTCGAAGGAAGATAAGCC-3'
[0221] AmpC基因负链探针第六条5'-NH2-T(10)AACCCCATAGTTGAAATAGTGGGCCTTGCCATCTTTCAGCAC-3'
[0222] 碳青霉烯酶耐药基因探针，选取了常见的基因型IMP1型及通用型、OXA23型、OXA24型，VIM型和GES2型，每个基因选取正负链探针各一条，共11条探针：
[0223] IMP基因通用正链探针5'-NH2-T(10)CACTCCATTTACGGCTAAAGATACTGAAAAGTTAGTCACTTGGTTTG
[0224] TGG-3'
[0225] IMP1基因正链探针5'-NH2-T(10)CATTTTCATAGCGACAGCACGGGCGGAATAGAGTGGCTTAAT-3'
[0226] IMP1基因负链探针5'-NH2-T(10)CCGCCTGCTCTAATGTAAGTTTCAAGAGTGATGCGTCTCCAAC-3'
[0227] OXA23基因正链探针5'-NH2-T(10)TTAAAATGTTGAATGCCCTGATCGGATTGGAGAACCAGAAAGC-3'
[0228] OXA23基因负链探针5'-NH2-T(10)TGATGAATCACCTGATTATGTCCTTGAACAATCTGACTCGGGGTTT-3'
[0229] OXA24基因正链探针5'-NH2-T(10)AATGGGTGTTACTCCACAGGTAGGTTGGTTGACTGGTTGGGT-3'
[0230] OXA24基因负链探针5'-NH2-T(10)GCTGACAATGCCATTGCCTCACCTAAAGTCATATCTTTCTCCCAC-3'
[0231] VIM基因正链探针5'-NH2-T(10)GTGATGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTG-3'
[0232] VIM基因负链探针5'-NH2-T(10)GTTGCGATATGCGACCAAACACCATCAGCAATCTGGTAAAGC-3'
[0233] GES2基因正链探针5'-NH2-T(10)CTGCGGTGCAGCTTAGCGACAATGGGGCTACTAACCTCTTAC-3'
[0234] GES2基因负链探针5'-NH2-T(10)CCGCCATAGAGGACTTTAGCCACAGTACGTGCCATAGCAATAGG-3'
[0235] MRSA金标准mecA基因探针，选取正负链探针各一条，共2条探针：
[0236] mecA基因正链探针5'-NH2-T(10)GAACTCAAAATGAAACAAGGAGAAACTGGCAGACAAATTGGGTGG-3'
[0237] mecA基因负链探针5'-NH2-T(10)TGGTCTTTCTGCATTCCTGGAATAATGACGCTATGATCCCAATCTAACT-3'
[0238] 常用基因工程载体耐药基因探针，包括氯霉素酰基转移酶（Cat）基因、博莱霉素（ Zeocin ）基因、杀稻瘟菌素（Bsr）基因、嘌呤霉素（Puromycin）基因、卡那霉素（Kana）基因，氨苄霉素（Amp）基因和四环素（Tet）基因，每个基因选取正负链探针至少各一条，共16条探针：
[0239] Cat基因正链探针5'-NH2-T(10)CCTTGCAGCTTCATCATGCTGTATGTGATGGTTACCATGCTTC-3'
[0240] Cat基因负链探针5'-NH2-T(10)CCAAGGAATCATTGAAATCGGTAGGGTGTTTTCAGGTATCGGTTT-3'
[0241] Zeocin基因正链探针5'-NH2-T(10)GAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTT-3'
[0242] Zeocin基因负链探针5'-NH2-T(10)TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTG-3'
[0243] Bsr基因正链探针5'-NH2-T(10)CCATTCATCTCAATGAGCACAAAGCAGTCAGGAGCATAGTCAGA-3'
[0244] Bsr基因负链探针5'-NH2-T(10)AGGTCGCCACTGAGAAGATCACCATGCTCTATGAGGACAACA-3'
[0245] Puromycin基因正链探针5'-NH2-T(10)GCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCT-3'
[0246] Puromycin基因负链探针5'-NH2-T(10)GGTGACGGTGAAGCCGAGCCGCTCGTAGAAGGGGAGGTT-3'
[0247] Kana基因正链探针5'-NH2-T(10)GAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAG-3'
[0248] Kana基因负链探针5'-NH2-T(10)CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTAT-3'
[0249] Tet基因正链探针5'-NH2-T(10)CACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGG-3'[0250] Tet基因负链探针5'-NH2-T(10)CGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGA-3'
[0251] Amp基因正链探针第一条5'-NH2-T(10)CACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGA-3'
[0252] Amp基因负链探针第一条5'-NH2-T(10)CGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTA-3'
[0253] Amp基因正链探针第二条5'-NH2-T(10)GCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCC-3'
[0254] Amp基因负链探针第二条5'-NH2-T(10)CGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT-3'
[0255] 本发明病原体高通量检测基因芯片，其特征在于所述的病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因检测芯片，所述的174条基因探针，其中探针的任何组合，用于基因芯片等的制备。
[0256] 所述的固相载体材料选用但不仅限于玻片、金属片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纤维膜、尼龙膜等中的一种或多种。
[0257] 本发明病原体高通量检测基因芯片，其特征在于所述的病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因检测芯片，用于多种病原体检测、鉴定、合理用药、感染病监测及流行病学调查。
[0258] 本发明病原体高通量检测基因芯片的制作：
[0259] 选择载玻片为芯片的载体，玻片购自Fisher Scientific公司，用铬酸洗液浸泡过夜，然后用双蒸水清洗，在浸入25%的氨水中过夜，用双蒸水清洗。晾干后浸入含有氨丙基三甲氧基硅烷的95%乙醇（pH4.5）中20min，再用95%乙醇超声清洗，换蒸馏水超声清洗，115℃烘干。将已硅烷化的玻片浸泡在5%的戊二醛溶液中50min，超声10min，水洗两次，晾干备用。
[0260] 筛选出的基因探针由商业公司进行化学合成。将合成的探针在96孔板中用TM3×SSC溶解，用Calligrapher MiniArrayer点样仪MCP360点样针，按设计的方案点样。
将病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的174条探针，1条空白对照探针，1条阳性内参探针设计形成一个点样阵列，每条探针重复4次，在阵列的右侧和下侧对应检测探针分别点上阳性内参探针，阳性参照同时起到定位作用，空白对照监控芯片本底信噪比。点样完毕，37℃水化2h，4℃保存备用。
[0261] 为了封闭玻片上未与寡核苷酸结合的醛基，按照以下程序对玻片进行处理：0.2％SDS洗两次，每次5min；双蒸水洗两次，每次5min；将玻片放入封闭（还原）液中20min。0.2％SDS洗三次，每次1min；双蒸水洗两次，每次1min；玻片自然干燥，即可投入使用。
[0262] 样本核酸的提取及标记：
[0263] 我们收集样本，测试并比较优化了被检样本的处理方法，建立了快速抽提高质量的各类病原菌的全基因组DNA的标准操作程序。相同的样本尽量采取相同的处理方法。对于提取的细菌DNA用全基因组扩增技术扩增，随机引物法荧光标记，用6mer的随机引物与变性双链DNA随机互补结合(退火)，以提供3’羟基端。接着在无5’→3，外切酶活性的Klenow片段的作用下，在引物的3’羟基末端逐个加上含有Cy3标记的核苷酸，逐步形成标记的DNA。
[0264] 基因芯片的检测及分析：
[0265] 将荧光标记的目标DNA与含阳参的杂交液1：1充分混匀，98℃变性5min冰浴。取出点在探针阵列区域，盖上大小合适的经硅烷化的盖玻片，将芯片放入杂交盒，盒内有适当的2×SSC以保持湿度，42℃杂交4小时。取出芯片，依次用42℃预热的杂交洗液 、 、 （0.2×SSC）各洗5min，最后用ddH2O洗2min，自然晾干，以上过程均要求避光。用 LuxScanTM10K Version3.0微阵列芯片扫描仪扫描及图像分析。
[0266] 实验结果分析：
[0267] 实验结果表明，制备的病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因检测芯片未见有特异性的交叉反应，并能够区分不同的病原体及内在生物特征。对多份样品进行检测，均现实了较好的特异性和敏感性。全基因组扩增技术是一种简单的等温扩增技术，不需要使用热循环器，它能高度忠实的复制整个基因组DNA，扩增出10~100 kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因组序列，为芯片标记杂交提供足够的核酸量，实际上该技术是用基因芯片对细菌的全部基因组进行扫描检测。Klenow fragment随机引物标记法则以其3'→5'外切酶活性保证了其合成DNA时的准确性。
[0268] 本发明与现有技术相比具有的优点：
[0269] （1）高特异性：芯片检测的特异性是经过双重筛选的；
[0270] （2）高通量：对多个基因的高通量平行检测，可同时确定病原体种类、致病基因和耐药基因；
[0271] （3）检测时间短，耗样量少，反应体积小；
[0272] （4）可根据实际需要任意组合探针；
[0273] （5）易于自动化及检测。
附图说明
[0274] 以下将结合附图对本发明作进一步说明：
[0275] 图1是本发明整个芯片制作和检测过程。
[0276] 图2是本发明病原体高通量检测基因芯片探针点样阵列示意图。
[0277] 图3是本发明重组抗性基因芯片灵敏度检测结果，其中A、B、C和D所对应的细菌4 3 2 2
浓度分别为10 个菌/ml、10 个菌/ml、5×10 个菌/ml和10 个菌/ml。
[0278] 图4是本发明病原体高通量检测基因芯片对四种微生物的检测结果，其中A、B、C和D所对应的是霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌和葡萄球菌。
[0279] 图5是本发明本发明病原体高通量检测基因芯片对五种抗药性基因耐药菌株的检测结果，其中1、2、3和4所对应的是含卡那霉素抗性基因质粒的大肠杆菌DH5α、含氯霉素抗性基因质粒的大肠杆菌DH5α、含博莱霉素抗性基因质粒的大肠杆菌DH5α和含四环素抗性基因质粒的大肠杆菌DH5α。
具体实施方式
[0280] 参照附图1～5，本发明病原体高通量检测基因芯片包括（1）病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的174条寡核苷酸探针组合和质量控制探针；（2）寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列；
[0281] 所述的寡核苷酸探针是指化学合成的多种耐药基因序列的高度保守区的互补寡聚核苷酸，长度为十到五十个碱基；
[0282] 所述的病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因检测芯片是指能检测病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的寡核苷酸阵列，8类病原体种类特异性基因包括鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌、布鲁氏菌、沙门氏菌、鼠疫耶尔森菌、炭疽芽孢杆菌、土拉弗朗西斯菌、 志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌（EIEC）、霍乱弧菌；7类毒素基因白喉毒素、志贺毒素、肉毒毒素、篦麻毒素、破伤风毒素、葡萄球菌肠毒素和霍乱毒素；17大类耐药基因包括超广谱β内酰胺酶、头孢菌素酶、碳青霉烯酶、整合酶类基因、四环素家族耐药基因、氨基糖甙类药物耐药基因、耐消毒剂基因、红霉素耐药相关基因、大环内酯类外排基因、耐万古霉素耐药基因、多药耐药外排泵基因、耐莫匹罗星基因、磺胺类耐药基因、泰洛星耐药基因、氟喹诺酮类药物耐药基因、氯霉素酰基转移酶、常用基因工程载体耐药基因；
[0283] 所述的质量控制探针至少包括两种探针，即阳性对照和阴性对照；阴性对照用于检测杂交信号错误或污染，阳性对照用于检测是否正常杂交的和准确定位；
[0284] 所述的手臂分子指具有双活性基团的长链有机化合物；
[0285] 所述寡核苷酸固定为寡聚核苷酸的末端有一特定基团，固化在载体材料基质表面时与表面修饰的手臂分子的末端基团形成共价键；
[0286] 所述的检测病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的174条寡核苷酸基因探针如下:
[0287] 病原体微生物的种类检测鉴定选择两组探针（每组正、负链），一组检测特异性结构基因保守序列，另一组检测关键性毒素基因。
[0288] 鼻疽伯克霍尔德氏菌和类鼻疽伯克霍尔德氏菌根据鼻疽假单胞菌和类鼻疽假单胞菌的基因序列选择结构保守序列16S rDNA和毒素基因flagellin C设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0289] 16S rDNA正链探针5'-NH2-T(10)GGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGG
[0290] 16S rDNA负链探针5'-NH2-T(10)TTGCGGTTAGACTAGCCACTTCTGGTAAAACCCACTCCCATG
[0291] flagellin C基因正链探针5'-NH2-T(10) TCAACAGCAACATTAACTCGTTGGTCGCTCAACAGAACCTCA
[0292] flagellin C基因负链探针5'-NH2-T(10) TGTAGTTCGTCTGCGAAGCGATACGGTTCACTTCCGAGATC
[0293] 布鲁氏菌选择有1430个碱基的结构基因16S ribosomal特异序列和布鲁氏菌热休克蛋白31KD基因设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0294] 16S ribosomal正链探针5'-NH2-T(10) CGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAAT
[0295] 16S ribosomal负链探针5'-NH2-T(10) CGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTC
[0296] 31KD基因正链探针5'-NH2-T(10) CGTAAGGATGCAAACATCAAATCGGTCGCAGACCTGAAAG[0297] 31KD基因负链探针5'-NH2-T(10) AGAACCTTGGTGATGTTATAGATGAGGTCGTCCGGCTGCTTG
[0298] 沙门氏菌的hilA基因编码侵袭基因正调节蛋白，是inv基因的正转录调节蛋白。沙门氏菌的侵袭蛋白(invasion protein,inv)与沙门氏菌的致病性密切相关，它是由invA,invB.invC.invD和invE等一组基因编码，其中invA为沙门氏菌的主要毒素因子，序列保守，选择这两种基因设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0299] hilA基因正链探针5'-NH2-T(10) GCCGCAACCTACGACTCATACATTGGCGATACTTCCTTTTCA
[0300] hilA基因负链探针5'-NH2-T(10) CCTCCTCCAACTGACCAGCCATGAAAAGATTCCAGCCATAAT
[0301] invA基因正链探针5'-NH2-T(10) TTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCA
[0302] invA基因负链探针5'-NH2-T(10) CCCCTCTTCATGCGTTACCCAGAAATACTGACTGCTACCTTGC
[0303] 鼠疫耶尔森菌的3a是一段特异的染色体序列，相关实验提示这段序列可作为鼠疫PCR检测的良好靶序列，探针设计参照Radnedge等报道的3a序列设计。另选择质粒上的毒素因子荚膜蛋白基因cafl设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0304] 3a序列正链探针5'-NH2-T(10) TTGTATGGCACGGACAGAAACTTAGCAGTGAGGACTGGAAGC[0305] 3a序列负链探针5'-NH2-T(10) ATATTACCGCCATGAAATGGACAATGATGCCCACCTAACCCT[0306] cafl基因正链探针5'-NH2-T(10) GGTACGCTTACTCTTGGCGGCTATAAAACAGGAACCACTAGCACA
[0307] cafl基因负链探针5'-NH2-T(10) GCATCAGTGTATTTACCTGCTGCAAGTTTACCGCCTTTGGAACC
[0308] 炭疽芽孢杆菌的毒素除决定于染色体基因外，还与毒素质粒(pXO1 )和荚膜质粒(pXO2)这两个编码质粒的致病因子有关。pXO1由三个部分组成：水肿因子(EF)、保护性抗原(PA)和致死因子(LF)。pXO2含CapB，CapC和CapA，编码荚膜蛋白，为正常毒素所必须。根据pXO1的水肿因子(EF)和pXO2设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0309] EF基因正链探针5'-NH2-T(10) GTGGCTACAAAGGGATTGAATGTTCATGGAAAGAGTTCGGATTG
[0310] EF基因负链探针5'-NH2-T(10) TCTGCTGACGTAGGGATGGTATTTATTTTGGCTTTTGTAATCGGATCA
[0311] pXO2基因正链探针5'-NH2-T(10) AACTTAGAAGGCTGGTCAACAAGTGAAATTATGTCTCGTATGCGTCCA
[0312] pXO2基因负链探针5'-NH2-T(10) GAAGTACATGCGGATGGTGTCCCACAATAATATCTGCCCCTG
[0313] 土拉弗朗西斯菌探针根据Francisella 23kDa结构蛋白和外膜蛋白FopA基因设计，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0314] Francisella 23kDa基因正链探针5'-NH2-T(10) TGGTCTTACAACATCTCAAGGAAGCTTGCCAGTATGTTGCGC
[0315] Francisella 23kDa基因负链探针5'-NH2-T(10)TGAATGGTCTCGCCACTTGTTACCTGTTGTCTTGTTATCATCTCACTC
[0316] FopA基因正链探针5'-NH2-T(10) CAACAGGTGCTTGGGATGTGGGTGGTGGTCTTAAGTTTGAACTAT
[0317] FopA基因负链探针5'-NH2-T(10) GCACCAATCATGTTAGTACCCGCTCTGCCATTAGCACCAGAAATAT
[0318] 志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌（EIEC），以质粒和基因组中都存在的序列-侵袭性质粒相关抗原(invasion plasmid antigen，ipa)的片段H为模板，存在多拷贝，易于检测。志贺氏菌中侵袭性相关基因ipaBCD是重要组成成分之一，为志贺菌侵入上皮细胞所必需的，ipaB－ipaC形成复合物，针对ipaC设计探针。每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0319] ipaH基因正链探针5'-NH2-T(10) GCCCGCAGATTTACTTCTCCATGAGTGACGGACAACAGAATAC
[0320] ipaH基因负链探针5'-NH2-T(10) GCATGGTCTGGAAGGCCAGGTAGACTTCTATCTCATCCACAAAAT
[0321] ipaC基因正链探针5'-NH2-T(10) CAAGTAGGTATAACGGGTATCGGTGCCAAAAAAACGCATTCAGG
[0322] ipaC基因负链探针5'-NH2-T(10) CAATGACAATTGAGAGCCCAATTTAGTTTCTGCAGTGCGGAGA
[0323] 编码霍乱弧菌外膜蛋白的基因(ompW)被认为是霍乱弧菌的标志基因，编码霍乱毒素A亚单位（CtxA基因）是霍乱肠毒素的活性部分。根据这两个基因设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0324] ompW基因正链探针5'-NH2-T(10) CGCTTGGCTATATGTTTACTGACAACATCAGTTTTGAAGTCCTCGCTC
[0325] ompW基因负链探针5'-NH2-T(10) CGTTAGCAGCAAGTCCCCATGAGTCGTCCAGTTTTAAATCACTC
[0326] CtxA基因正链探针5'-NH2-T(10) GATATTGCTCCAGCAGCAGATGGTTATGGATTGGCAGGTTTC
[0327] CtxA基因负链探针5'-NH2-T(10) GAAACATATCCATCATCGTGCCTAACAAATCCCGTCTGAGTTCCT
[0328] 七种毒素序列检测选择毒素的生物活性部分的探针。
[0329] 白喉毒素免疫毒素的细胞毒性源自DT的酶活性区和跨膜转运区，即N端389个氨基酸。其前193个氨基酸为白喉毒素(Diphtheria toxin , DT)A片段(DTA) 是白喉毒素的酶活性区，也是DT 类免疫毒素的关键结构域，根据其设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0330] DTA基因正链探针5'-NH2-T(10) TCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAA
[0331] DTA基因负链探针5'-NH2-T(10) AGTTAGCCCCAGCGAATACAGGATTGGTCCCAGTAACGGTTT
[0332] 在引起细菌性痢疾的志贺菌属中，以Ⅰ型痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae type I)引起的腹泻最为严重，主要原因是它能产生一种高水平的外毒素一志贺毒素(Shiga Toxin, ShT)。ShT具有肠毒性、细胞毒性和神经毒性等3种生物活性，根据其设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0333] ShT基因正链探针5'-NH2-T(10) GATTTAATGTCGCATAGTGGAACCTCACTGACGCAGTCTGTGG
[0334] ShT基因负链探针5'-NH2-T(10) CCATGATAGTCAGGCAGGACACTACTCAACCTTCCCCAGTTCAAT
[0335] 肉毒毒素是已知最剧烈的毒物，有嗜神经毒性，可以分为A、B、C1、C2、D、E、F、G、H八个型，各型毒素药理作用相同，但抗原性不同，只能被同型的抗毒素中和。选择了4个基因设计探针，每个基因选取正负链探针各一条，共8条：
[0336] 1、Clostridium botulinum neurotoxin BoNT gene
[0337] BoNT基因正链探针5'-NH2-T(10) TTGAGGAGTCACTTGAAGTTGATACAAATCCTCTTTTAGGTGCAGGCA
[0338] BoNT基因负链探针5'-NH2-T(10) GAGTAGAGCCATAACCATTTCGCGTAAGATTCAAAACTTCATGTCCA
[0339] 2、the gene of botulinum type B toxin.
[0340] B型基因正链探针5'-NH2-T(10) TGGAGGGCAAGATCCCAGCATCATAAGTCCTTCTACGGATAAA
[0341] B型基因负链探针5'-NH2-T(10) GCTCCTGCAATCTCAAAAGCATTTTCAAAATTTCCTTTAGCTGTTTCA
[0342] 3、Clostridium botulinum bont/E gene for botulinum neurotoxin type [0343] E型基因正链探针5'-NH2-T(10) AGCAATGGATGTTTTTGGAACTTTATTTCTGAAGAACATGGATGGCAA
[0344] E型基因负链探针5'-NH2-T(10) TCCATTTTTTAATGAAGTAGGCGGATGAAAATCTTGGGGGGTTGT
[0345] 4、Clostridium botulinum neurotoxin type F gene
[0346] F型基因正链探针5'-NH2-T(10) TGCACTGCATGGATTATACGGGGCTAGGGGAGTTACTTATGAAGA
[0347] F型基因负链探针5'-NH2-T(10) CGTTCTTTAATGAAGCCGGTGGATCAAAATCACTAGGATTCGTTCC
[0348] 篦麻毒素Ricin是一种从蓖麻种子的胚乳中提取的糖蛋白，由A、B两条肽组成的异二聚体。A链(RTA)分子量为30(或32)KDa，是一种糖苷酶；B链(RTB)的分子量为32 KDa。Ricin属核糖体失活蛋白，是一种细胞毒素，必须进入细胞才能发挥毒性。根据A链设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0349] RTA基因正链探针：5'-NH2-T(10) ACGAGAATTAGGTACAACCGGAGATCTGCACCAGATCCTAGCG
[0350] RTA基因负链探针：5'-NH2-T(10) TGATTGTCAGGATGAAAGAAATATGCGCTATTTCCAGCACGGTAG
[0351] 破伤风毒素（Tetanus toxin）是一种强烈的神经毒素，由破伤风梭菌(Clostridium Tetani )产生，可被蛋白酶切成两条轻链)和一条重链。重链有与受体结合的功能而无毒性作用。毒素由一个75kb大质粒上一段核昔酸编码，编码基因长约4kb，为一大的开放读码框架，该基因分为A、B、C 3个片段，A片段编码毒性蛋白，B片段编码穿膜蛋白，C片段编码结合蛋白。基因工程做疫苗一般克隆的是无神经毒性的C片段，针对发挥毒性作用的轻链281－1651序列设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0352] 正链探针：5'-NH2-T(10) ATCCAATAAGTGCTGAAGAACTATTCACTTTTGGCGGACAGGATGC[0353] 负链探针：5'-NH2-T(10) TGTCCCAAATTCATACCTTTCCGGCACTATCCAAATACGATCTGTT[0354] 产肠毒素性葡萄球菌具有多种毒素致病因子，其中最主要的是它所产生的A，B，C1，C2，C3，D和E七型热稳定性肠毒素(staphy-lococcal enterotoxin，SE)，可引起人畜发生食物中毒，也能成为生物战毒剂的毒素。选择了4个基因设计探针，每个基因选取正负链探针各一条或通用探针，共9条：
[0355] 1、SEC1、SEC2、SEC3，以SEC2序列为参考
[0356] SEC2基因正链探针5'-NH2-T(10) TTTTGGTATGATATGATGCCTGCACCAGGCGATAAGTTTGACC
[0357] SEC2基因负链探针5'-NH2-T(10) TGTAAGTTCCCATTATCAAAGTGGTTTCCTTCATGTTTTGTTATTCCTCCA
[0358] 2、SEB
[0359] SEB基因正链探针5'-NH2-T(10) ACCAGATGAGTTGCACAAATCGAGTAAATTCACTGGTTTGATGGAA
[0360] SEB基因负链探针5'-NH2-T(10) TCCTGGTGCAGGCATCATGTCATACCAAAAGCTATTCTCATTTTCT
[0361] 3、SED
[0362] SED基因正链探针5'-NH2-T(10) AAAATGTTACCGTACAAGAATTAGATGCACAAGCAAGGCGCTATTTGC
[0363] SED基因负链探针5'-NH2-T(10) TGGAGTGACACCTCCATATGTACAAGCAGTCCTATCTATTTCACCACCAT
[0364] 4、SEA和SEE
[0365] SEA基因正链探针5'-NH2-T(10) TATGGTGCTTATTATGGTTATCAATGTGCGGGTGGTACACCAAACA
[0366] SEE基因正链探针5'-NH2-T(10) TCATAACTTACCGTGGACCCTTCAGAAGAATGAAACACAATCAAGCC
[0367] SEA，SEE基因通用负链探针5'-NH2-T(10) TTCGCTTTTCTCGCTACCATTTACAAGTGGACTTGTTGTCAACGT
[0368] 霍乱毒素见微生物霍乱弧菌检测部分。
[0369] 耐药基因数目、分类复杂，部分序列变异而成为亚类的多见。因此在充分的同源性比较及分析的基础上，尽可能采取通用探针检测。在用通用性探针覆盖更多的耐药基因的情况下，同时重点对主要的，危害大的，易造成流行和对多药耐药而难以控制的，能做成生物战剂的一系列耐药基因进行全面检测。
[0370] 整合酶类基因探针选自Ⅰ类整合酶基因（IntI1）和Ⅱ类整合酶基因（IntI2），每个基因选取正负链探针各一条,共4条探针：
[0371] intI1基因正链探针5'-NH2-T(10)CCAGTGGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAACTGTAATGCAAGTAGC-3'
[0372] intI1基因负链探针5'-NH2-T(10)CTCTACGACGATGATTTACACGCATGTGCTGAAAGTTGGCG-3'
[0373] intI2基因正链探针5'-NH2-T(10)GGGCATTTAAAGCGATTTTCTGCGTGTTTATGGCTACATGTCTG-3'
[0374] intI2基因负链探针5'-NH2-T(10)ATGCTTGCGTTTGCGGGTTAAAGATTTTGATTTTGATAATGGCTG-3'
[0375] 四环素家族耐药基因探针选择tetM基因,设计正负链探针各一条，Tet(M)是研究得最多的核糖体保护蛋白，具有核糖体依赖的GTP水解酶活性，共2条探针：
[0376] tetM基因正链探针5'-NH2-T(10)AGTGGGAAAATACGAAGGTGAACATCATAGACACGCCAGGACA-3'
[0377] tetM基因负链探针5'-NH2-T(10)AAGCGGATCACTATCTGAGATTTCCAAAAGGGCATCAAGCAA-3'
[0378] 氨基糖甙类药物耐药基因探针，选取了易于传播并且危害较大的氨基糖甙类修饰酶基因有aac(3)-I、aac(3)-II、aac(3)-III、aac(3)-IV、aac (6')-I、aac(6')-II、aphA6， ant(3')-I和ant(2'')-I共9种，每个基因选取正负链探针各一条, 共18条探针：
[0379] aac(3)-I基因正链探针5'-NH2-T(10)GGTGCTTATGTGATCTACGTGCAAGCAGATTACGGTGACGATC-3'
[0380] aac(3)-I基因负链探针5'-NH2-T(10)GAAAAGATCAAGAGCAGCCCTCATGGATTTGACTTGGTCAGG-3'
[0381] aac(3)-II基因正链探针5'-NH2-T(10)GTCGAAACTATAGCAAATGCTTACGTGAAGCTCGGTCGCCAT-3'
[0382] aac(3)-II基因负链探针5'-NH2-T(10)AATCGAGAATGCCGTTTGAATCGTATTCTGATGCCGTTTTCC-3'
[0383] aac(3)-III基因正链探针5'-NH2-T(10)TGGCTAAACTGGTGGCAATAGAAGGATACGTGCTGATGCTTG-3'
[0384] aac(3)-III基因负链探针5'-NH2-T(10)CTATCCGTATGACGCTGAGTCACCGAACCGTGATTCAAGC-3'
[0385] aac(3)-IV基因正链探针5'-NH2-T(10)CTCAAGGAGAAGAGCCTTCAGAAGGAAGGTCCAGTCGGTCAT-3'
[0386] aac(3)-IV基因负链探针5'-NH2-T(10)GTACCAACTTGCCATCCTGAAGAATGGTGCAGTGTCTCGG-3'
[0387] aac (6')-Ib基因正链探针5'-NH2-T(10)ACTTGCTGACGTACAGGAACAGTACTTGCCAAGCGTTTTAGCG-3'
[0388] aac (6')-Ib基因负链探针5'-NH2-T(10)ACTGGTCTATTCCGCGTACTCCTGGATCGGTTTCTTCTTCCC-3'
[0389] aac (6')-II基因正链探针5'-NH2-T(10)GGTGGGAAGATGAAACTGATCCAGGAGTGCGAGGAATAGACC-3'
[0390] aac (6')-II基因负链探针5'-NH2-T(10)GTAGTGTTCCAGCACTTCATCAAGAGTCGGTCGCTCTTCGTC-3'
[0391] aphA6基因正链探针5'-NH2-T(10)TTGCCCAATATTATTCAACAATTTATCGGAAACAGCGTTTTAGAGCCA-3'
[0392] aphA6基因负链探针5'-NH2-T(10)CGATTAAAAGAATAAACATCCGATGGCGACTGACCAATTTTATTTGGC-3'
[0393] ant( 3')-I基因正链探针5'-NH2-T(10)TTGATCCGGTTCCTGAACAGGATCTATTTGAGGCGCTAAATG-3'
[0394] ant( 3')-I基因负链探针5'-NH2-T(10)ACGGAATGATGTCGTCGTGCACAACAATGGTGACTTCTACAG-3'
[0395] ant(2'')-I基因正链探针5'-NH2-T(10)TACAAAGCACATAGAGTCCTACAGGCTCGCATGCACCTCACTC-3'
[0396] ant(2'')-I基因负链探针5'-NH2-T(10)CATCGGCATAGTAAAAGTAATCCCAGATGATCGCCTCCCAGC-3'
[0397] 耐消毒剂qacA/B家族基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0398] qacA/B基因正链探针5'-NH2-T(10)GATTTAGCTCATGTAGCTGAAGAATCTGTAGTGGGCGCTGTCGAA-3'
[0399] qacA/B基因负链探针5'-NH2-T(10)TGCCATGAAAATTGCTCAAGTAAAGCTCCTCCGATAATTGGTCC-3'
[0400] 红霉素耐药相关基因探针，已发现Erm基因家族有20余种基因亚型，以ErmA，ErmB和ErmC三型为主，每个基因选取正负链探针各一条，共6条探针：
[0401] ErmA基因正链探针5'-NH2-T(10)GATCCCCTACGGCATCACCTCCGCCATCGTCGACTGGT-3'
[0402] ErmA基因负链探针5'-NH2-T(10)ACCCGTCGAGGAGCTGGAACAGCGTGATCCACTGGTCG-3'
[0403] ErmB基因正链探针5'-NH2-T(10)TTGAAAGCCATGCGTCTGACATCTATCTGATTGTTGAAGAAGGATTC-3'
[0404] ErmB基因负链探针5'-NH2-T(10)GCAAGAGCAACCCTAGTGTTCGGTGAATATCCAAGGTACGCTT-3'
[0405] ErmC基因正链探针5'-NH2-T(10)CGTGGAATACGGGTTTGCTAAAAGATTATTAAATACAAAACGCTCATTG
[0406] GC-3'
[0407] ErmC基因负链探针5'-NH2-T(10)GGGTAAAATGCCCTTTTCCTGAGCCGATTTCAAAGATATTATCATGTTC-3'
[0408] 大环内酯类外排（mefA）基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0409] mefA基因正链探针5'-NH2-T(10)TACCCCAGCACTCAATGCGGTTACACCACTTTTAGTACCAGAAGAA-3'
[0410] mefA基因负链探针5'-NH2-T(10)TGCAATCACAGCACCCAATACGTCGATGGCAATAATAGCATTTAA-3'
[0411] 耐万古霉素耐药基因探针，选用了由不同的耐药基因簇编码的VanA、VanB、VanC1、VanC2、VanD，VanE6种表型，每个基因选取正负链探针各一条，共12条探针：
[0412] VanA基因正链探针5'-NH2-T(10)AAAATCTTAATTGAGCAGGCTGTTTTGGGCTGTGAGGTCGGT-3'
[0413] VanA基因负链探针5'-NH2-T(10)TACAAATCGCTGAGCTTTGAATATCGCAGCCTACAAAGGGGA-3'
[0414] VanB基因正链探针5'-NH2-T(10)ACGGAAGAACTTAACGCTGCGATAGAAGCGGCAGGACAATAT-3'
[0415] VanB基因负链探针5'-NH2-T(10)CCGTATCAATGTTCGCAGCAATTTCTATTGCGGATTTTACCGA-3'
[0416] VanC1基因正链探针5'-NH2-T(10)CTTGAACTAATGAACCTGCCTTATGTTGGTTGCCATGTCGCTG-3'
[0417] VanC1基因负链探针5'-NH2-T(10)CACAGTAGAACCGTAAGCAAAAGCAGTCGTTAATGCAGATTGGAGC-3'
[0418] VanC2基因正链探针5'-NH2-T(10)AAATCAATACTATGCCGGGCTTTACGAGTCACTCCCGCTATCC-3'
[0419] VanC2基因负链探针5'-NH2-T(10)CGTCTACTAATGAAATGGCGTCACAAGCACCGACAGTCAAAGA-3'
[0420] VanD基因正链探针5'-NH2-T(10)AGGAACATGATGTTTCAGTGAAATCTGCGATGGAGGTTGCA-3'
[0421] VanD基因负链探针5'-NH2-T(10)ATGCGTGGATAACGGCTATAGGAAGTAAATCCAGGCATGGTGTTC-3'
[0422] VanE基因正链探针5'-NH2-T(10)CATGGAGGTTATGGTGAGAATGGTGCTATGCAGGGAGTATTTGAG-3'
[0423] VanE基因负链探针5'-NH2-T(10)TGTCGTTCCTTCAAATAGATACCAATGACCTTCTTCGGTGATCCCTA-3'
[0424] 多药耐药外排泵基因探针，选择包括AcrAB- TolC，OprM和Sme DEF外排泵基因，每个基因选取正负链探针各一条，共6条探针：
[0425] AcrAB-TolC基因正链探针5'-NH2-T(10)GCAGAAGTTCGTCCTCAAGTTAGCGGGATTATCCTGAAGCGT-3'
[0426] AcrAB-TolC基因负链探针5'-NH2-T(10)TTCAGCAGGATTTTGCCGAACTCTTCAGTAGAGGTCAGACGC-3'
[0427] OprM基因正链探针5'-NH2-T(10)CCAAAAGAGGGCGGGATAGGCTAGAGCCCCTATAGCACTAGG-3'
[0428] OprM基因负链探针5'-NH2-T(10)GTAGCTGCGCTGGGTCAGGTCGAAACTCTTCTGGTAGGTG-3'
[0429] Sme DEF基因正链探针5'-NH2-T(10)AGTACCGATGGAAGTGATCCCCATGAAAAGTGCATCCCTGTT-3'
[0430] Sme DEF基因负链探针5'-NH2-T(10)GTTGGACGAGCTGTTGGAGGAGAAGTAGATCAGGCCATCAAG-3'
[0431] 耐莫匹罗星（ileS）基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0432] ileS基因正链探针5'-NH2-T(10)GAGCCGATTCTTTAAGATGGGCCTTAATTTCGGATAGTGCTCCA-3'
[0433] ileS基因负链探针5'-NH2-T(10)TTTCTGGTTATCAAAAGGATAATGATGCTGAGCAAACGGCATAGAGC-3'
[0434] 磺胺类耐药基因探针，选择了dfrA和dfrD两型，每个基因选取正负链探针各一条，共4条探针：
[0435] dfrA基因正链探针5'-NH2-T(10)GGAAACCATTGCCAAATAGACGTAACGTCGTTCTCACTAACCAAGCT-3'
[0436] dfrA基因负链探针5'-NH2-T(10)CGTCCCATTACAAGTGTATTCCCAGTGGTCAGTTGTTTAACATGCTTT-3'
[0437] dfrD基因正链探针5'-NH2-T(10)TTGTTGCGATGGATAAGAAAAGAGTAATCGGCAAGGATAACGACATTC-3'
[0438] dfrD基因负链探针5'-NH2-T(10)CCCTTCCGATTGATTGAAGGTTCTTTCTACCTAATATGATTGCATGTCCT-3'
[0439] 泰洛星（tlrB）耐药基因探针，设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0440] tlrB基因正链探针5'-NH2-T(10)CTACGGTCATGCGGAAGAACGTCGTGCGATATCTGCGCTGTC-3'
[0441] tlrB基因负链探针5'-NH2-T(10)AGCTTCGTCGGGCGTCTGAGCAGATTCACATAGCCCTGCC-3'
[0442] 氟喹诺酮类（norA）药物耐药基因探针，norA基因介导的耐药在金葡菌中相当常见，设计正负链探针各一条，共2条探针：
[0443] norA基因正链探针5'-NH2-T(10)TCCTCACAAAGCAACTACTGATGGATTCCACCAATATCAACCTGAA-3'
[0444] norA基因负链探针5'-NH2-T(10)TCGTCCAATAACCGTTTGCAAGCACTAACATAACGAGAACAATGG-3'
[0445] β内酰胺酶类（BLA）耐药基因探针，划分为超广谱β内酰胺酶、头胞菌素酶、碳青霉烯酶、金黄色葡萄球菌（MRSA）金标准mecA基因。
[0446] 其中超广谱β内酰胺酶（ESBLs）耐药基因，按不同编码基因同源性分为TEM型、SHV型、CTX-M型（由于各亚型间CDS核酸基因序列差异较大，根据其序列的同源性分3组），PER型和VEB型，每个基因选取正负链探针各一条，共14条探针：
[0447] TEM基因正链探针5'-NH2-T(10)TTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAA-3'
[0448] TEM基因负链探针5'-NH2-T(10)GCGTCAACACGGGATAATACCGCACCACATAGCAGAACTTTAA-3'
[0449] SHV基因正链探针5'-NH2-T(10)TAACAAAGCAGAGCGCATCGTGGTGATTTATCTGCGGGATA-3'
[0450] SHV基因负链探针5'-NH2-T(10)AGTAGTCCACCAGATCCTGCTGGCGATAGTGGATCTTTCGC-3'
[0451] CTX-M1基因正链探针5'-NH2-T(10)ATGAGACGTTTCGTCTGGATCGCACTGAACCTACGCTGAATA-3'
[0452] CTX-M1基因负链探针5'-NH2-T(10)CCGCCATAACTTTACTGGTACTGCACATTGGAAAGCGTTCATC-3'
[0453] CTX-M2基因正链探针5'-NH2-T(10)AAGAAGAGCGACCTGGTTAACTACAATCCCATTGCGGAGAAACA-3'
[0454] CTX-M2基因负链探针5'-NH2-T(10)CCCAGATGGGCAATCAGCTTATTCATGGCAGTATTGTCGCTAT-3'
[0455] CTX-M3基因正链探针5'-NH2-T(10)GCGGTGCTGAAGAAAAGTGAAAGCGAACCGAATCTGTTAAATC-3'
[0456] CTX-M3基因负链探针5'-NH2-T(10)CGTGAGCAATCAGCTTATTCATCGCCACGTTATCGCTGTACT-3'
[0457] PER基因正链探针5'-NH2-T(10)CGGCCACTAATGATTTAGGTATCATTCTGTTGCCTGATGGACG-3'
[0458] PER基因负链探针5'-NH2-T(10)GCACTGGAACACTAAACTCGTCTCCCTGATACGCTTTCATTATCGG-3'
[0459] VEB基因正链探针5'-NH2-T(10)AGATTACCCCTCAAGACCTTTTGCCTAAAACGTGGAGTCCGATTAAA-3'
[0460] VEB基因负链探针5'-NH2-T(10)TTTGATATTGGGTATTCCAATCCTTGTGCATTTGTTCTTCGTTTGCT-3'
[0461] 头孢菌素酶（AmpC）耐药基因探针分为6组，几乎涵盖了所有的质粒AmpC基因序列，设计正负链探针各六条，共12条探针：
[0462] AmpC基因正链探针第一条5'-NH2-T(10)AGCATCCAGCCGCTGCTCAAGGAGCACAGGATC-3'
[0463] AmpC基因负链探针第一条5'-NH2-T(10)GCCTGCTTCGGCACATTGACATAGGTGTGGTGCAT-3'
[0464] AmpC基因正链探针第二条5'-NH2-T(10)CCAGAACTGACAGGCAAAAAGTGGCAGGGTATCCGC-3'
[0465] AmpC基因负链探针第二条5'-NH2-T(10)GTTTTCTCCTGAACGTGGCTGGCATCCATGTTGGC-3'
[0466] AmpC基因正链探针第三条5'-NH2-T(10)CTTTCACAGGTGTGCTGGGTGCGGTTTCTGTGGC-3'
[0467] AmpC基因负链探针第三条5'-NH2-T(10)GTACGCATACTGGCTTTGCGCACTTTCCGGCACAGTAATAAA-3'
[0468] AmpC基因正链探针第四条5'-NH2-T(10)TATGGGTTAGCGGCAAAACAGCCTCAGCAGCCGGTTA-3'
[0469] AmpC基因负链探针第四条5'-NH2-T(10)AGACTTTTCGCCGCAATCATCCCTAGCAAACCAGTACCGATA-3'
[0470] AmpC基因正链探针第五条5'-NH2-T(10)CGCTTTTATCAAAACTGGCAGCCGCAGTGGAAGCC-3'
[0471] AmpC基因负链探针第五条5'-NH2-T(10)CGAGCTGCTTTTCAGGAATAAATGCCACGTAGCTGCCAAAC-3'
[0472] AmpC基因正链探针第六条5'-NH2-T(10)CATGGCGAACTATGCCTACGGCTATTCGAAGGAAGATAAGCC-3'
[0473] AmpC基因负链探针第六条5'-NH2-T(10)AACCCCATAGTTGAAATAGTGGGCCTTGCCATCTTTCAGCAC-3'
[0474] 碳青霉烯酶耐药基因探针，选取了常见的基因型IMP1型及通用型、OXA23型、OXA24型，VIM型和GES2型，每个基因选取正负链探针各一条，共11条探针：
[0475] IMP基因通用正链探针5'-NH2-T(10)CACTCCATTTACGGCTAAAGATACTGAAAAGTTAGTCACTTGGTTTG
[0476] TGG-3'
[0477] IMP1基因正链探针5'-NH2-T(10)CATTTTCATAGCGACAGCACGGGCGGAATAGAGTGGCTTAAT-3'
[0478] IMP1基因负链探针5'-NH2-T(10)CCGCCTGCTCTAATGTAAGTTTCAAGAGTGATGCGTCTCCAAC-3'
[0479] OXA23基因正链探针5'-NH2-T(10)TTAAAATGTTGAATGCCCTGATCGGATTGGAGAACCAGAAAGC-3'
[0480] OXA23基因负链探针5'-NH2-T(10)TGATGAATCACCTGATTATGTCCTTGAACAATCTGACTCGGGGTTT-3'
[0481] OXA24基因正链探针5'-NH2-T(10)AATGGGTGTTACTCCACAGGTAGGTTGGTTGACTGGTTGGGT-3'
[0482] OXA24基因负链探针5'-NH2-T(10)GCTGACAATGCCATTGCCTCACCTAAAGTCATATCTTTCTCCCAC-3'
[0483] VIM基因正链探针5'-NH2-T(10)GTGATGGTGATGAGTTGCTTTTGATTGATACAGCGTGGGGTG-3'
[0484] VIM基因负链探针5'-NH2-T(10)GTTGCGATATGCGACCAAACACCATCAGCAATCTGGTAAAGC-3'
[0485] GES2基因正链探针5'-NH2-T(10)CTGCGGTGCAGCTTAGCGACAATGGGGCTACTAACCTCTTAC-3'
[0486] GES2基因负链探针5'-NH2-T(10)CCGCCATAGAGGACTTTAGCCACAGTACGTGCCATAGCAATAGG-3'
[0487] MRSA金标准mecA基因探针，选取正负链探针各一条，共2条探针：
[0488] mecA基因正链探针5'-NH2-T(10)GAACTCAAAATGAAACAAGGAGAAACTGGCAGACAAATTGGGTGG-3'
[0489] mecA基因负链探针5'-NH2-T(10)TGGTCTTTCTGCATTCCTGGAATAATGACGCTATGATCCCAATCTAACT-3'
[0490] 常用基因工程载体耐药基因探针，包括氯霉素酰基转移酶（Cat）基因、博莱霉素（ Zeocin ）基因、杀稻瘟菌素（Bsr）基因、嘌呤霉素（Puromycin）基因、卡那霉素（Kana）基因，氨苄霉素（Amp）基因和四环素（Tet）基因，每个基因选取正负链探针至少各一条，共16条探针：
[0491] Cat基因正链探针5'-NH2-T(10)CCTTGCAGCTTCATCATGCTGTATGTGATGGTTACCATGCTTC-3'
[0492] Cat基因负链探针5'-NH2-T(10)CCAAGGAATCATTGAAATCGGTAGGGTGTTTTCAGGTATCGGTTT-3'
[0493] Zeocin基因正链探针5'-NH2-T(10)GAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTT-3'
[0494] Zeocin基因负链探针5'-NH2-T(10)TCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTGCACGCAGTTG-3'
[0495] Bsr基因正链探针5'-NH2-T(10)CCATTCATCTCAATGAGCACAAAGCAGTCAGGAGCATAGTCAGA-3'
[0496] Bsr基因负链探针5'-NH2-T(10)AGGTCGCCACTGAGAAGATCACCATGCTCTATGAGGACAACA-3'
[0497] Puromycin基因正链探针5'-NH2-T(10)GCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCT-3'
[0498] Puromycin基因负链探针5'-NH2-T(10)GGTGACGGTGAAGCCGAGCCGCTCGTAGAAGGGGAGGTT-3'
[0499] Kana基因正链探针5'-NH2-T(10)GAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAG-3'
[0500] Kana基因负链探针5'-NH2-T(10)CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTAT-3'
[0501] Tet基因正链探针5'-NH2-T(10)CACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGG-3'[0502] Tet基因负链探针5'-NH2-T(10)CGTAGTCGATAGTGGCTCCAAGTAGCGAAGCGAGCAGGA-3'
[0503] Amp基因正链探针第一条5'-NH2-T(10)CACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGA-3'
[0504] Amp基因负链探针第一条5'-NH2-T(10)CGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTA-3'
[0505] Amp基因正链探针第二条5'-NH2-T(10)GCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCC-3'
[0506] Amp基因负链探针第二条5'-NH2-T(10)CGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT-3'
[0507] 一种检测病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因的检测基因芯片，包括了全基因组DNA的提取和扩增标记；载体如玻片、硅片等；载体表面手臂分子的修饰；寡核苷酸探针（包括检测寡核苷酸探针和质量控制探针）及其固化；检测和分析等。
[0508] 本发明病原体高通量检测基因芯片，其特征在于所述的病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因检测芯片，所述的174条基因探针，其中探针的任何组合，用于基因芯片等的制备。
[0509] 所述的固相载体材料选用但不仅限于玻片、金属片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纤维膜、尼龙膜等中的一种或多种。
[0510] 本发明病原体高通量检测基因芯片，其特征在于所述的病原体种类特异性基因、毒素基因及耐药基因检测芯片，用于多种病原体检测、鉴定、合理用药、感染病监测及流行病学调查。
[0511] 实施例一、 病原体高通量检测基因芯片检测霍乱弧菌
[0512] 霍乱是由O1和O139血清群霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，以发病急、传播快、波及范围广、能引起大流行为特征；O157:H7是新型的属于可产生与志贺氏毒素极相似毒索的肠道致病菌。用合成的基因探针制备基因芯片，检测含霍乱弧菌O157:H7。
[0513] 1. 样本核酸的提取及标记
[0514] 将细菌成倍稀释成并测定其浓度分别为104个菌/ml、103个菌/ml、5×102个菌/2
ml、10 个菌/ml，各取200ul用Bacterial Genomic DNA Extraction kit试剂盒，按说明书要求提取DNA。取0.6ul作为模板用于全基因组扩增及klenow fragment随机引物标记后，反应体系见下：
[0515] 全基因组DNA 2µg
[0516] 随机引物（2nmol/µl） 2µl
[0517] 加ddH2O总体积至10µl，97℃，3min50s后冰浴3min。
[0518] 放置冰上，加入：
[0519] 1M Cy3 dCTP 1.5µl
[0520] 10×dUTPs 2.5µl
[0521] Klenow fragment Buffer 2.5µl
[0522] ddH2O 4.5µl
[0523] 室温放置 2min
[0524] Klenow fragment 4µl
[0525] Total 25µl
[0526] 室温放置5min后，37℃反应2.5h。补加2µl klenow fragment，37℃反应2.5h，65℃反应5min。于-20℃保存。
[0527] 2.芯片的制备
[0528] 选用经硅烷化处理的玻片为芯片载体，用5%戊二醛浸泡50min，ddH2O超声清洗2次，置干燥处备用。
[0529] 将合成的173条探针溶于3×SSC，根据图2阵列进行点样，另设有阳性内参和空白对照探针。点样后，水合作用37℃，2h。使用时，先用0.2％SDS洗两次，每次5min；双蒸水洗两次，每次5min；将玻片放入封闭（还原）液中20min。0.2％SDS洗三次，每次1min；双蒸水洗两次，每次1min；玻片自然干燥待用。
[0530] 3.芯片的杂交检测
[0531] 取10µl标记的目标DNA与10µl杂交液（含阳参）充分混匀，98℃变性5min冰浴，点在探针阵列区域，42℃杂交4h。取出芯片，依次用42℃预热的杂交洗液 、、 各洗5min，最后用ddH2O洗2min，自然晾干（以上过程均要求避光），用 LuxScanTM10K Version3.0微阵列芯片扫描仪扫描及图像分析。整个芯片制作和检测过程见图1。
[0532] 4.检测结果
[0533] 从霍乱弧菌的杂交分析结果中(图3)可以看出，2条霍乱弧菌外膜蛋白基因ompW探针和2条霍乱毒素CtxA基因探针，均产生了较强的荧光信号，与其它探针无交叉信号产生。结果当细菌浓度为102个菌/ml时，2类霍乱弧菌特异探针的检测信号仍然清晰可见，且对照探针无交叉信号，即芯片的检测灵敏度为102个菌/ml。
[0534] 实施例二、 病原体高通量检测基因芯片同时检测四种微生物
[0535] 病原细菌引起的传染病不仅在发病率方面居首位，同时也是造成人类死亡的重要原因。随着新发传染病病原体、重组病原体和未知病原体的不断出现，给人类健康带来重大的威胁。基因芯片相比传统检测方法在感染性疾病检测中有着独特优势，本实验建立了病原体高通量检测基因芯片，优化确定芯片检测条件，对霍乱弧菌、沙门氏菌、志贺氏菌和葡萄球菌部分样本进行了检测。
[0536] 1.芯片的制备
[0537] 选用经硅烷化处理的玻片为芯片载体，用5%戊二醛浸泡50min，ddH2O超声清洗2次，置干燥处备用。
[0538] 合成的173条探针，在96孔板中用3×SSC溶解，浓度为40 pmol/µl。用CalligrapherTM MiniArrayer点样仪MCP360点样针，按设计的方案点（见图2），点样完毕，
37℃水化2h，4℃保存备用。使用时，先用0.2％SDS洗两次，每次5min；双蒸水洗两次，每次5min；将玻片放入封闭（还原）液中20min。0.2％SDS洗三次，每次1min；双蒸水洗两次，每次1min；玻片自然干燥待用。
[0539] 2.核酸提取与标记
[0540] 对各菌株进行增菌培养后，细菌全基因组DNA按照Bacterial Genomic DNA Extraction kit试剂盒和GenomiPhi DNA Amplification Kit试剂盒使用说明中的操作规程进行提取与扩增，琼脂糖凝胶电泳评价DNA的质量和完整性。纯化后的WGA产物50 ul，10×Buffer 6ul，Sau3A I酶 4ul，共60ul体系，37℃酶切4h以上。klenow fragment随机引物标记法将Cy3 dCTP掺入DNA，反应体系：全基因组DNA 2µg，random primer 2µl，加ddH2O至10µl，97℃反应3min50s，冰浴3min。放置冰上，加入Cy3-dCTP 1.5µl，10×dNTPs
2.5µl，Klenow fragment Buffer 2.5µl，Klenow fragment 4µl，加ddH2O至25µl。室温静置
5min，37℃反应2.5h，加入4µl klenow fragment，继续反应2.5h，65℃反应5min。于-20℃保存。
[0541] 3.杂交及芯片检测
[0542] 将荧光标记的目标DNA与杂交液（含阳参）1：1充分混匀，98℃变性5min冰浴。取出点在探针阵列区域，盖上大小合适的经硅烷化的盖玻片，将芯片放入杂交盒（盒内有适当的2×SSC以保持湿度），42℃杂交4小时。取出芯片，依次用42℃预热的杂交洗液 、TM
、 各洗5min，最后用ddH2O洗2min，自然晾干（以上过程均要求避光），用 LuxScan 10K Version3.0微阵列芯片扫描仪扫描及图像分析。整个芯片制作和检测过程见图1。
[0543] 4.检测结果
[0544] 从霍乱弧菌的杂交分析结果（图4）中可以看出，2条霍乱弧菌外膜蛋白基因ompW探针和2条霍乱毒素CtxA基因探针，均产生了较强的荧光信号，与其它探针无交叉信号产生。沙门氏菌的杂交结果（图4）显示，2条沙门氏菌主要侵袭蛋白基因invA探针，2条沙门氏菌侵袭基因正调节蛋白hilA基因探针，均出现阳性信号。志贺氏菌的杂交结果（图4）中，6条特异探针包括2条志贺菌属和侵袭性大肠埃希菌侵袭性质粒相关抗原(invasion plasmid antigen，ipa) 片段H基因探针，2条志贺菌属侵袭性相关基因 ipa C基因探针，2条志贺毒素(Shiga Toxin, ShT) A subunit基因探针均产生了较强的荧光信号，其它探针无交叉信号产生。9条葡萄球菌肠毒素特异探针（2条葡萄球菌肠毒素C1、C2、C3组基因探针，2条葡萄球菌肠毒素SEB基因探针，2条葡萄球菌肠毒素SED基因探针，3条葡萄球菌肠毒素SEA、SEE组）与葡萄球菌杂交结果也均产生了较强的荧光信号，未出现与其它探针产生交叉信号（图4）。说明我们所设计的病原体种类特异性基因探针和毒素基因探针具有较好的特异性，我们所摸索的样品扩增和标记方法，可有效获得待测病原体的基因。
[0545] 实施例三、 病原体高通量检测基因芯片同时检测五种抗药性基因耐药菌株[0546] 近几十年来，随着广谱抗生素在公共卫生及畜牧业的广泛不合理使用，可导致细菌严重耐药，治疗困难，病死率高。快速、准确、高通量检测耐药基因是预防控制感染性疾病的关键所在。我们建立了细菌耐药基因检测芯片，对含卡那霉素抗性基因质粒的大肠杆菌DH5α、含氯霉素抗性基因质粒的大肠杆菌DH5α、含博莱霉素抗性基因质粒的大肠杆菌DH5α和含四环素抗性基因质粒的大肠杆菌DH5α部分样本进行了检测比较。
[0547] 1.细菌全基因组提取与标记
[0548] 对各菌株进行增菌培养后，细菌全基因组DNA按照Bacterial Genomic DNA Extraction kit试剂盒和GenomiPhi DNA Amplification Kit试剂盒使用说明中的操作规程进行提取与扩增，琼脂糖凝胶电泳评价DNA的质量和完整性。纯化后的WGA产物50 ul，10×Buffer 6ul，Sau3A I酶 4ul，共60ul体系，37℃酶切4h以上。klenow fragment随机引物标记法将Cy3 dCTP掺入DNA，反应体系：全基因组DNA 2µg，random primer 2µl，加ddH2O至10µl，97℃反应3min50s，冰浴3min。放置冰上，加入Cy3-dCTP 1.5µl，10×dNTPs
2.5µl，Klenow fragment Buffer 2.5µl，Klenow fragment 4µl，加ddH2O至25µl。室温静置
5min，37℃反应2.5h，加入4µl klenow fragment，继续反应2.5h，65℃反应5min。于-20℃保存。
[0549] 2.芯片的制备
[0550] 选用经硅烷化处理的玻片为芯片载体，用5%戊二醛浸泡50min，ddH2O超声清洗2次，置干燥处备用。
[0551] 合成的117条探针，在96孔板中用3×SSC溶解，浓度为40 pmol/µl。用TM
Calligrapher MiniArrayer点样仪MCP360点样针，按图2设计的方案点样。之后，37℃水化2h，4℃保存备用。使用时，先用0.2％SDS洗两次，每次5min；双蒸水洗两次，每次5min；
将玻片放入封闭液中20min。0.2％SDS洗三次，每次1min；双蒸水洗两次，每次1min；玻片自然干燥待用。
[0552] 3.芯片杂交
[0553] 将荧光标记的目标DNA与含阳参的杂交液1：1充分混匀，98℃变性5min冰浴。取出点在探针阵列区域，42℃杂交4小时。取出芯片，依次用42℃预热的杂交洗液 、 、 各洗5min，最后用ddH2O洗2min，自然晾干，以上过程均要求避光。整个芯片制作和检测过程见图1。
[0554] 4.检测结果
[0555] 用LuxScanTM10K Version 3.0微阵列芯片扫描仪扫描及图像分析细菌耐药芯片，检测结果见图5，结果表明，含氨苄青霉素抗性基因质粒的大肠杆菌TG1检测出Amp基因、含卡那霉素抗性基因质粒的大肠杆菌DH5α检测出Kana基因、含氯霉素抗性基因质粒的大肠杆菌DH5α检测出Cat基因、含博莱霉素抗性基因质粒的大肠杆菌DH5α检测出Zeocine基因、含四环素抗性基因质粒的大肠杆菌DH5α检测到Tet基因，其它探针未出现非特异反应，芯片背景和杂交信号值都比较稳定，结果符合实验设计。
