奥硝唑注射液杂质的检测方法及含量测定方法

摘要

本发明属于药物分析领域，具体涉及奥硝唑注射液杂质的检测方法及含量测定方法。本发明为了提供一种操作简便，迅速、精确的检测方法，用于检测奥硝唑注射液中的杂质2-甲基-5-硝基咪唑和最大杂质，该最大杂质为奥硝唑失去1分子水的降解产物：1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑)，采用液相色谱检测上述杂质，关键在于控制HPLC检测条件：流动相为乙腈-水(或甲醇-水)体积比为：15-25∶75-85，杂质2-甲基-5-硝基咪唑及最大杂质检测波长为305-315nm。通过控制关键检测参数实现简便，迅速、精确检测的目的，本发明方法操作简便；测定结果准确可靠；专属性更强；主峰保留时间在11-14分钟，检测时间较短；为检测杂质、控制产品质量提供了一种全新的选择。

权利要求

1.奥硝唑注射液杂质的检测方法，其特征在于：杂质为1-（3-氯-丙烯基）-2-甲基-5-硝基咪唑采用高效液相色谱检测，检测条件如下：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：乙腈-水体积比为15-25:75-85；或甲醇-水体积比为15-25:75-85；

流速：0.8-1.2ml/min；

柱温：30-40℃；

检测波长：305-315nm；

理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500；

实验材料的处理：

（1）供试品溶液的制备：取奥硝唑注射液，加流动相，定容至奥硝唑注射液的50-100倍体积量，摇匀，作为供试品溶液；

（2）对照溶液的制备：

取供试品溶液1ml，用流动相稀释至100ml，摇匀，作为对照溶液。

2.根据权利要求1所述的奥硝唑注射液杂质的检测方法，其特征在于：高效液相色谱的检测条件中流动相乙腈-水体积比为20:80；或流动相甲醇-水体积比为20:80。

3.根据权利要求1所述的奥硝唑注射液杂质的检测方法，其特征在于：高效液相色谱的检测条件中所述的流速为1.0ml/min；柱温为35℃。

4.根据权利要求1所述的奥硝唑注射液杂质的检测方法，其特征在于：供试品溶液的制备中加流动相，定容至奥硝唑注射液的至100倍体积量。

5.根据权利要求1所述的奥硝唑注射液杂质的检测方法，其特征在于：所述检测波长为310nm。

6.奥硝唑注射液杂质的含量测定方法，其特征在于：杂质为1-（3-氯-丙烯基）-2-甲基-5-硝基咪唑采用高效液相色谱测定，检测条件如下：固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：乙腈-水体积比为15-25:75-85；或甲醇-水体积比为15-25:75-85；

流速：0.8-1.2ml/min；

柱温：30-40℃；

检测波长：305-315nm；

理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500；

实验材料的处理：

（1）供试品溶液的制备：取奥硝唑注射液，加流动相，定容至奥硝唑注射液的50-100倍体积量，摇匀，作为供试品溶液；

（2）对照溶液的制备：取供试品溶液1ml，用流动相稀释至100ml，摇匀，作为对照溶液。

7.根据权利要求6所述的奥硝唑注射液杂质的含量测定方法，其特征在于：高效液相色谱的检测条件中流动相乙腈-水体积比为20:80；或流动相甲醇-水体积比为20:80。

8.根据权利要求6所述的奥硝唑注射液杂质的含量测定方法，其特征在于：高效液相色谱的检测条件中所述的流速为1.0ml/min；柱温为35℃。

9.根据权利要求6所述的奥硝唑注射液杂质的含量测定方法，其特征在于：供试品溶液的制备中加流动相，定容至奥硝唑注射液的至100倍体积量。

10.根据权利要求6所述的奥硝唑注射液杂质的含量测定方法，其特征在于：所述检测波长为310nm。

说明书

奥硝唑注射液杂质的检测方法及含量测定方法

技术领域

[0001] 本发明属于药物分析领域，具体涉及奥硝唑注射液杂质的检测方法及含量测定方法。

背景技术

[0002] 奥硝唑(Ornidazole)为第三代硝基咪唑类衍生物，用于治疗厌氧菌和原虫、滴虫感染。其发挥抗微生物作用的机理可能是：通过其分子中的硝基，在无氧环境中还原成氨基或通过自由基的形成，与细胞成分相互作用，从而导致微生物死亡。奥硝唑的血浆消除半衰期为14小时，血浆蛋白结合率小于15％，广泛分布于组织和体液中，包括脑脊液。奥硝唑在肝中代谢，在尿中主要以轭合物和代谢物排泄，小量在粪便中排泄。

[0003] 奥硝唑中目前报道的杂质共有3种，奥硝唑及其杂质结构分别为：

[0004] 奥 硝 唑：1-chloro-3-(2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1-yl)propan-2-ol，1-氯-3-(2-甲基-5-硝基-1H-咪唑-1-基)丙-2-醇，化学式见式I。

[0005] 杂质1：2-methyl-5-nitro-1H-imidazole，2-甲基-5-硝基咪唑，化学式见式II。

[0006] 杂质2：1-(2-methyl-5-nitro-1H-imidazol-1-yl)propan-2-one，1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑，化学式见式III。

[0007] 杂质3：1-(3-chloroallyl)-2-methyl-5-nitro-1H-imidazole，1-丙酮基-2-甲基-5-硝基咪唑，化学式见式IV。

[0008]

[0009] 式I 式II[0010]

[0011] 式III 式IV[0012] 发明人发现奥硝唑注射液中主要杂质为2-甲基-5-硝基咪唑(即杂质1)和1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑(最大杂质，即杂质2)，2-甲基-5-硝基咪唑为合成过程中的中间体，分子式为C4H5N3O2；最大杂质为奥硝唑降解产物，分子式为C7H8ClN3O2。
为了更快速、精确检测注射液中的杂质，发明人提供了一种新的检测方法检测奥硝唑注射液中的杂质2-甲基-5-硝基咪唑和1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑，及其含量测定，以实现简便、快速、精确控制产品质量的目的。

发明内容

[0013] 本发明所解决的技术问题是提供一种操作简便，迅速、精确的检测方法，用于检测奥硝唑注射液中的杂质2-甲基-5-硝基咪唑(杂质1)及其最大杂质1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑(杂质2)。

[0014] 本发明所述杂质1为2-甲基-5-硝基咪唑，分子式为C4H5N3O2；所述杂质2为最大杂质1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑，分子式为C7H8ClN3O2。

[0015] 2-甲基-5-硝基咪唑(杂质1)采用高效液相色谱检测，HPLC检测条件如下：

[0016] 固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

[0017] 流动相：乙腈-水体积比为15-25∶75-85；或甲醇-水体积比为15-25∶75-85；乙腈-水或甲醇-水优选体积比为20∶80；

[0018] 流速：0.8-1.2ml/min(流速优选1.0ml/min)；

[0019] 柱温：30-40℃(柱温优选35℃)；

[0020] 检测波长：305-315nm(310nm为优选值)；

[0021] 理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500；

[0022] 实验材料的处理：

[0023] (1)供试品溶液的制备：取奥硝唑注射液1ml，加流动相定容至奥硝唑注射液的50-100倍体积量(优选100倍)，摇匀，作为供试品溶液。

[0024] (2)对照品溶液的制备：

[0025] 精密称取2-甲基-5-硝基咪唑对照品用甲醇溶解，用流动相稀释制成2.0-3.0μg/ml(优选2.5μg/ml)2-甲基-5-硝基咪唑的溶液，摇匀，作为2-甲基-5-硝基咪唑对照品溶液。

[0026] 检测前，按照HPLC检测条件，精密量取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20％。

[0027] 该检测方法的优点是：操作简便；测定结果准确可靠；专属性更强；主峰保留时间在11-14分钟，检测时间较短。

[0028] 最大杂质采用高效液相色谱检测，HPLC检测条件如下：

[0029] 固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

[0030] 流动相：乙腈-水体积比为15-25∶75-85；或甲醇-水体积比为15-25∶75-85；乙腈-水或甲醇-水优选体积比为20∶80；

[0031] 流速：0.8-1.2ml/min(流速优选1.0ml/min)

[0032] 柱温：30-40℃(柱温优选35℃)；

[0033] 检测波长：305-315nm(310nm为优选值)；

[0034] 理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500；

[0035] 实验材料的处理：

[0036] (1)供试品溶液的制备：取奥硝唑注射液，加流动相，定容至奥硝唑注射液的50-100倍体积量(优选100倍量)，摇匀，作为供试品溶液；

[0037] (2)对照溶液的制备：

[0038] 取供试品溶液1ml，然后用流动相稀释至100ml，摇匀，作为对照溶液。

[0039] 检测前，按照HPLC检测条件，精密量取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20％。

[0040] 该检测方法的优点是：操作简便；测定结果准确可靠；专属性更强；主峰保留时间在11-14分钟，检测时间较短。

[0041] 在上述检测方法的基础上，本发明还提供了一种奥硝唑注射液杂质2-甲基-5-硝基咪唑和最大杂质的含量测定方法，可快速、简便、准确的确定奥硝唑注射液中杂质含量，实现控制产品质量的目的。

[0042] (1)供试品溶液的制备：取奥硝唑注射液，加流动相，定容至奥硝唑注射液的50-100倍体积量(优选100倍量)，摇匀，作为供试品溶液；

[0043] (2)2-甲基-5-硝基咪唑对照品溶液的制备：

[0044] 2-甲基-5-硝基咪唑对照品用甲醇溶解后，再用流动相稀释，制成每2.0-3.0μg/ml(优选2.5μg/ml)2-甲基-5-硝基咪唑的溶液，摇匀，作为2-甲基-5-硝基咪唑对照品溶液。

[0045] (3)最大杂质对照溶液的制备：

[0046] 取供试品溶液1ml，然后用流动相稀释至100ml，摇匀，作为对照溶液。

[0047] 测定杂质1(2-甲基-5-硝基咪唑)含量采用高效液相色谱测定，HPLC检测条件如下：

[0048] 固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

[0049] 流动相：乙腈-水体积比为15-25∶75-85；或甲醇-水体积比为15-25∶75-85；乙腈-水或甲醇-水优选体积比为20∶80；

[0050] 流速：0.8-1.2ml/min(流速优选1.0ml/min)；

[0051] 柱温：30-40℃(柱温优选35℃)；

[0052] 检测波长：305-315nm(310nm为优选值)；

[0053] 理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500。

[0054] 测定杂质2(最大杂质)含量采用高效液相色谱测定，HPLC检测条件如下：

[0055] 固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

[0056] 流动相：乙腈-水体积比为15-25∶75-85；或甲醇-水体积比为15-25∶75-85；乙腈-水，或甲醇-水优选体积比为20∶80；

[0057] 流速：0.8-1.2ml/min(流速优选1.0ml/min)；

[0058] 柱温：30-40℃(柱温优选35℃)；

[0059] 检测波长：305-315nm(310nm为优选值)；

[0060] 理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500。

[0061] 本发明杂质检测方法及含量测定方法的有益效果是操作简便，检测迅速，测定结果准确可靠，专属性更强；为检测杂质、控制产品质量提供了一种全新的选择。

附图说明

[0062] 图1 2-甲基-5-硝基咪唑紫外扫描图。

[0063] 图2 奥硝唑紫外扫描图。

[0064] 图3 2-甲基-5-硝基咪唑线性图

[0065] 图4 奥硝唑最大杂质线性图

具体实施方式

[0066] 以下通过对本发明具体实施方式的描述说明但不限制本发明。

[0067] 现有的检测奥硝唑中杂质的相关技术主要为“奥硝唑”国家药品标准(WS1-(X-454)-2003Z-2010)(以下简称奥硝唑质量标准)中收载的奥硝唑有关物质的测定方法，测定条件规定如下：

[0068] 取供试品适量，加流动相溶解并制成每1ml中含100μg的供试品溶液与每1ml中含0.5μg的对照溶液。另取2-甲基-5-硝基咪唑对照品适量，加流动相溶解并制成每1ml中含0.2μg的对照品溶液。以甲醇-水(20∶80)为流动相，检测波长318nm。取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分峰高达满量程的20％，精密量取供试品溶液、对照溶液与对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，2-甲基-5-硝基咪唑杂质按外标法以峰面积计算，不得过0.2％，其它各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(0.5％)。

[0069] 其中采用的色谱条件为采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(20∶80)为流动相；检测波长为318nm。然而，这种方法对奥硝唑有关物质的测定灵敏度不够，对最大杂质1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑的含量没有明确规定，使得奥硝唑的质量可控性受到影响。

[0070] 一、以下为本发明奥硝唑注射液杂质检测方法及含量测定方法的检测条件筛选实验。

[0071] 1、确定检测波长

[0072] 奥硝唑国家药品标准(WS1-(X-454)-2003Z-2010)中采用以甲醇-水(20∶80)为流动相，检测波长为318nm，测定有关物质，对2-甲基-5-硝基咪唑进行了定位和限度控制，对最大杂质进行了定位，未进行限度控制，而奥硝唑在310nm的波长处有最大吸收，为了有效地控制奥硝唑中的杂质，对杂质的最大吸收波长进行研究，需确定更加合适的检测波长。

[0073] 确定本发明检测方法的检测波长：

[0074] (1)精密称取2-甲基-5-硝基咪唑对照品适量，加甲醇溶解并稀释至每1ml约含10μg的溶液，在200～400nm波长范围内扫描。结果：2-甲基-5-硝基咪唑在310nm处有最大吸收，因此选择2-甲基-5-硝基咪唑检测波长310nm。紫外扫描图见图1。

[0075] 图1中峰谷检测灵敏度：0.0100

[0076]No. 峰波长(nm) 峰值 谷波长(nm) 谷值
1 310.00 0.7571 259.00 0.1603
2 222.00 0.4649 214.00 0.4382
3 213.00 0.4493 211.00 0.4362

[0077] (2)精密称取奥硝唑对照品适量，加甲醇溶解并稀释至每1ml约含10μg的溶液，在200～400nm波长范围内扫描。结果：奥硝唑在310nm处有最大吸收。奥硝唑的最大杂质是奥硝唑的脱水降解产物，其结构属于不稳定化合物，没有单独对照品销售，其母核结构和奥硝唑一致，因此选择最大杂质检测波长310nm。紫外扫描图见图2。

[0078] 图2中峰谷检测灵敏度：0.0100

[0079]No. 峰波长(nm) 峰值 谷波长(nm) 谷值
1 310.00 0.4064 261.00 0.1058
2 227.00 0.1751 219.00 0.1608
3 216.00 0.1733 214.00 0.1624
4 207.00 0.1885 200.00 0.1165

[0080] 结果：2-甲基-5-硝基咪唑在310±2nm处有最大吸收，奥硝唑在310±2nm处有最大吸收。最终选择杂质2-甲基-5-硝基咪唑检测波长为310nm，最大杂质检测波长为310nm。

[0081] (3)在乙腈-水(20∶80)色谱条件下，比较2种不同检测波长310nm和318nm的检测情况，结果见表1。

[0082] 表1两种不同检测波长比较

[0083]检测波长 310nm 318nm
杂质峰个数 10 9
主峰归一化法含量％ 99.7 99.7

[0084] 结果：310nm检测波长下检测出10个杂质峰，318nm检测波长下检测出9个杂质峰。

[0085] 从两种特征杂质的最大吸收波长来看，奥硝唑标准方法中的检测波长不能完全真实的反映出杂质的特征波长。本方法中奥硝唑中两个特征杂质的检测波长均为其最大吸收波长，可以更加准确的测定其真实含量。且该法能检测出奥硝唑注射液中更多的杂质。

[0086] 2、确定流动相

[0087] ①参照奥硝唑注射液质量标准(YBH23992005)，流动相为甲醇-水-冰醋酸(30∶70∶0.2)，检测波长310nm。

[0088] ②参照奥硝唑注射液质量标准(YBH09122003)，流动相为甲醇-水(30∶70)，检测波长342nm。

[0089] ③流动相为甲醇-水-冰醋酸(30∶70∶0.2)，检测波长342nm。

[0090] ④流动相为甲醇-水(30∶80)，检测波长310nm。

[0091] ⑤流动相为甲醇-水-冰醋酸(30∶70∶0.2)，检测波长310nm。

[0092] ⑥流动相为乙腈-水(20∶80)，检测波长310nm。

[0093] ⑦流动相为乙腈-水(15∶85)，检测波长310nm。

[0094] ⑧流动相为乙腈-水(25∶75)，检测波长310nm。

[0095] 取奥硝唑注射液，加流动相，定容至奥硝唑注射液的100倍体积量，摇匀，作为供试品溶液。测定法：分别吸取供试品溶液各20μl注入高效液相色谱仪，色谱条件为固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：1.0ml/min；柱温：35℃。记录色谱图。结果见表2。

[0096] 表2色谱条件选择结果

[0097]

[0098] 通过色谱图及表2显示：各色谱条件的分离度都大于1.5，流动相乙腈-水(15-25∶75-85)主峰分离度好些，各杂质峰之间分离度也较好，检测出的杂质也多，尤其是乙腈-水(20∶80)可检出10个杂质峰，同时保留时间较短，便于快速检测。检测波长310nm较其它波长检测出的杂质多些，且310nm也是奥硝唑的最大吸收波长。因此发明人选择条件乙腈-水(20∶80)作为本品有关物质检测的流动相。

[0099] 检测波长310nm，对流动相乙腈-水(20∶80)和流动相甲醇-水(20∶80)进行比较，色谱条件为固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流速：1.0ml/min；柱温：35℃。结果见表3。

[0100] 表3两种不同色谱条件分离情况比较

[0101]

[0102] 结果：流动相甲醇-水(20∶80)色谱条件下2-甲基-5-硝基咪唑与相邻杂质峰分离度与流动相乙腈-水(20∶80)色谱条件下的分离度无显著差别，但是甲醇-水(20∶80)分离的杂质数较乙腈-水(20∶80)少，且主峰出峰时间较慢。

[0103] 3、确定流速和柱温

[0104] 3.1色谱条件

[0105] 固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

[0106] 流动相：以乙腈-水(20∶80)；

[0107] 检测波长：310nm；

[0108] 理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500。

[0109] 3.2考察柱温和流速

[0110] 考察柱温在30-40℃，流速在0.8-1.2ml/min的影响，其他色谱条件见3.1，供试品溶液及对照品溶液制备方法见本发明检测方法最优选择。柱温和流速的影响结果见表4。

[0111] 表4柱温和流速对检测方法的影响

[0112]

[0113] 柱温在30-40℃，流速在0.8-1.2ml/min范围对杂质测定无影响。

[0114] 综合1-3的筛选结果，确定本发明检测方法及含量测定方法中的色谱条件为：

[0115] 杂质1(2-甲基-5-硝基咪唑)的HPLC检测条件如下：

[0116] 固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

[0117] 流动相：乙腈-水(15-25∶75-85)或甲醇-水(15-25∶75-85)，优选乙腈-水(20∶80)；

[0118] 流速：0.8-1.2ml/min(流速优选1.0ml/min)；

[0119] 柱温：30-40℃(柱温优选35℃)；

[0120] 检测波长：305-315nm，优选310nm；

[0121] 理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500。

[0122] 杂质2(最大杂质：1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑)的HPLC检测条件如下：

[0123] 固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

[0124] 流动相：乙腈-水(15-25∶75-85)或甲醇-水(15-25∶75-85)，优选乙腈-水(20∶80)；

[0125] 流速：0.8-1.2ml/min(流速优选1.0ml/min)；

[0126] 柱温：30-40℃(柱温优选35℃)；

[0127] 检测波长：305-315nm，优选310nm；

[0128] 理论板数按奥硝唑峰计算应不低于2500。

[0129] 二、以下为本发明检测方法和含量测定方法的色谱条件确定后，验证其测定效果的实验。

[0130] 1、与现有方法对比

[0131] 将本发明检测方法与奥硝唑国家药品标准(WS1-(X-454)-2003Z-2010)记载的方法针对同一批次的奥硝唑原料及注射液进行杂质对比检测，结果见下表5。

[0132] 表5杂质对比检测

[0133]

[0134] 奥硝唑标准记载的方法原料仅能检出2个杂质峰，注射液仅能检出9个杂质峰；本发明检测方法原料可以检出3个杂质峰，注射液可以检出10个杂质峰。上述结果说明本发明检测方法对奥硝唑原料及注射液中杂质的分布及检测更具有准确性；而且也说明测定波长对奥硝唑中的杂质检测起到关键作用。

[0135] 2、本发明检测方法的专属性研究

[0136] 破坏前样品：取奥硝唑注射液1.0ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为破坏前供试品溶液。

[0137] 酸破坏：精密吸取奥硝唑注射液1.0ml，加1.0mol/L的盐酸1ml，60℃加热1h，放冷，加1.0mol/L的氢氧化钠1ml中和，并加流动相稀释至100ml，摇匀，作为酸破坏供试品溶液。

[0138] 碱破坏：精密吸取奥硝唑注射液1.0ml，加1.0mol/L的氢氧化钠1ml，60℃加热1h，放冷，加1.0mol/L的盐酸1ml中和，并加流动相稀释至100ml，摇匀，作为碱破坏供试品溶液。

[0139] 光破坏：精密吸取奥硝唑注射液1.0ml，加流动相稀释至100ml，摇匀，于紫外光下照射过夜，作为光破坏供试品溶液。

[0140] 高温破坏：精密吸取奥硝唑注射液1.0ml，加流动相稀释至100ml，摇匀，置电炉上加热沸腾10min，放冷，作为高温破坏供试品溶液。

[0141] 氧破坏：精密吸取奥硝唑注射液1.0ml，加双氧水1ml，60℃加热1h，放冷，加流动相稀释至100ml，摇匀，作为氧破坏供试品溶液。

[0142] 取上述各破坏供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，在310nm检测奥硝唑及其杂质，结果见表6。注：以上所述流动相均为：乙腈-水(20∶80)；检测条件均为本发明检测方法的优选条件。

[0143] 表6破坏性试验结果1

[0144]破坏样 杂质峰个数 主峰归一化法含量％ 主峰与前峰分离度 主峰与后峰分离度
氧破坏 7 98.99 4.4 \
高温破坏 15 97.26 3.4 5.3
光破坏 8 99.53 2.9 \
碱破坏 12 71.30 4.7 \
酸破坏 7 94.22 4.5 \

[0145] 结果显示：

[0146] 高温破坏试验在本发明色谱条件中产生的杂质峰最多，且峰与峰之间均达到了基线分离，说明该色谱条件是可行的。其它破坏试验产生的杂质相对较少。在该检测条件下，保留时间约4.0min，相对主峰保留时间约0.5倍的杂质峰峰面积升高最为明显，是奥硝唑原料或奥硝唑注射液应重点考察的杂质。

[0147] 为了进一步比较本发明检测方法与奥硝唑标准方法2种不同色谱条件的分离情况，继续考察2种色谱条件下破坏性试验样品的分离情况。

[0148] 未破坏样品：精密量取奥硝唑注射液1.0ml，加流动相稀释至100ml，摇匀，作为未破坏供试品溶液。

[0149] 高温破坏样品：取未破坏样品100℃煮沸1小时，放冷，作为高温破坏样品。

[0150] 氧破坏样品：精密吸取奥硝唑注射液1.0ml，加30％双氧水0.5ml，室温静置1小时，加流动相稀释至100ml，摇匀，作为氧破坏样品。

[0151] 分别吸取上述样品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表7。

[0152] 表7破坏性试验结果2

[0153]

[0154] 结果：流动相甲醇-水(20∶80)色谱条件下2-甲基-5-硝基咪唑与相邻杂质峰分离度和主峰与杂质峰的分离度均能符合规定。流动相乙腈-水(20∶80)色谱条件下2-甲基-5-硝基咪唑与相邻杂质峰分离度和主峰与杂质峰的分离度也均能符合规定。但是流动相甲醇-水(20∶80)分离的杂质数较流动相乙腈-水(20∶80)少，且主峰出峰时间较慢。

[0155] 综合以上结果说明流动相乙腈-水(20∶80)在310nm波长处检测杂质更加趋于合理，由于是在杂质的最大特征波长处检测，可以准确的检测出奥硝唑注射液中微量的2-甲基-5-硝基咪唑和最大杂质，测定结果更加可行，精确度更高，检测方法专属性更强。

[0156] 3、检测杂质2-甲基-5-硝基咪唑

[0157] 3.1 2-甲基-5-硝基咪唑检测限试验

[0158] 精密称取2-甲基-5-硝基咪唑对照品适量，加甲醇溶解并稀释至每1ml约含1.0mg的溶液作为贮备液，精密量取贮备液适量逐步稀释测定，直到2-甲基-5-硝基咪唑的主峰信号约为检测器噪声水平的3倍为止，得2-甲基-5-硝基咪唑最低检测限为0.128ng；
2-甲基-5-硝基咪唑的主峰信号约为检测器噪声水平的10倍为止，得2-甲基-5-硝基咪唑最低定量限为0.384ng。

[0159] 3.2 2-甲基-5-硝基咪唑线性试验

[0160] 精密称取2-甲基-5-硝基咪唑对照品适量，加甲醇溶解并稀释成每1ml约含9.6μg的储备液，分别精密量取储备液0.1ml、0.5ml、1.0ml、2.5ml、5.0ml加甲醇稀释至
10ml，摇匀。分别吸取各线性溶液和储备液各20μl，注入液相色谱仪。

[0161] 以对照品进样量(X)和对照品峰面积(Y)进行线性回归，得2-甲基-5-硝基咪唑3 2
线性回归方程：Y＝1.40×10X+3.67×10，r＝1.0000。结果进样量在1.92ng～192ng范围内2-甲基-5-硝基咪唑进样量与峰面积线性关系良好。试验结果见表8，线性图见图3。

[0162] 表8线性试验结果

[0163]

[0164] 3.3 2-甲基-5-硝基咪唑精密度试验

[0165] 精密称取2-甲基-5-硝基咪唑对照品适量，加甲醇溶解并制成每1ml约含2.5μg的溶液，精密吸取20μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD值。结果见表9。

[0166] 表9精密度试验结果

[0167]编号 1# 2# 3# 4# 5# 6# RSD(％)
峰面积 67494 67205 67236 66746 67052 66684 0.46

[0168] 结果表明，精密度较好，RSD为0.46％。

[0169] 3.4 2-甲基-5-硝基咪唑稳定性试验

[0170] 精密称取2-甲基-5-硝基咪唑对照品适量，加甲醇溶解并制成每1ml约含2.5μg的溶液，分别于0h、2h、4h、6h、24h精密吸取20μl，注入液相色谱议，考察其稳定性，计算RSD值。结果见表10。

[0171] 表10稳定性试验结果

[0172]时间(h) 0h 2h 4h 6h 24h RSD(％)
峰面积 67494 66675 66463 66502 66706 0.63

[0173] 结果表明：结果表明2-甲基-5-硝基咪唑样品溶液稳定，室温放置24h峰面积无明显变化。

[0174] 3.5 2-甲基-5-硝基咪唑重复性试验

[0175] 精密称取奥硝唑原料适量，加流动相溶解稀释至0.5mg/ml，共制备6份，测定2-甲基-5-硝基咪唑含量，结果见表11。

[0176] 表11重复性试验结果

[0177])
％(DSR 68.0
％
量
含 7
均平 1.0

7
#6 1.0

7
#5 1.0

7
#4 1.0

7
#3 1.0
7
#2 1.0
71
#1 .0
％
量
含
唑
咪
基
硝
-
5-
基
号 甲-
编 2

[0178] 结果表明，重复性较好，RSD为0.86％。

[0179] 3.6 2-甲基-5-硝基咪唑准确度试验

[0180] 精密称取重复性试验项下的奥硝唑原料适量，共3份，置100ml量瓶中，分别加入2-甲基-5-硝基咪唑对照品溶液(0.325mg/ml)0.8ml、1ml、1.2ml，再加流动相稀释至刻度，摇匀，照“2-甲基-5-硝基咪唑含量测定项下”测定，每个浓度测定3次，计算回收率、RSD值，结果见表12。

[0181] 表12回收率试验结果

[0182]

[0183] 结果表明：回收率试验结果较好，RSD为1.58％。

[0184] 3.7 2-甲基-5-硝基咪唑含量测定

[0185] 精密量取本品1ml，加流动相稀释至100ml，摇匀，作为供试品溶液；另取2-甲基-5-硝基咪唑对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，并用流动相稀释制成每1ml约含2.5μg的溶液，摇匀，作为2-甲基-5-硝基咪唑对照品溶液。照含量测定项下的色谱条件，取供试品溶液、2-甲基-5-硝基咪唑对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有与2-甲基-5-硝基咪唑保留时间一致的色谱峰，分别按外标法、归一化法、主成分自身对照法计算杂质B的含量。结果见表13。

[0186] 表13 2-甲基-5-硝基含量测定结果

[0187]

[0188] 结果表明：奥硝唑注射液中2-甲基-5-硝基咪唑含量较少，外标法与归一化法、主成分自身对照法略有差别，为了准确的反应奥硝唑原料及注射液的质量以及严格的控制杂质2-甲基-5-硝基咪唑，宜采用外标法(杂质对照品法)进行检测。

[0189] 4、检测最大杂质

[0190] 最大杂质1-(3-氯-丙烯基)-2-甲基-5-硝基咪唑是奥硝唑的脱水降解产物，在结构上属于不稳定化合物，目前市场上没有其对照品销售，因其母核和奥硝唑一致，因此参照奥硝唑的最大吸收波长，选择最大杂质的检测波长为310nm。

[0191] 4.1最大杂质线性试验

[0192] 精密量取奥硝唑注射液1.0ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液贮备液。分别精密量取线性溶液贮备液1ml、2ml、3ml、4ml置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为各线性溶液。分别吸取各线性溶液20μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见表14。以峰面积为纵坐标(Y)，浓度倍数为横坐标(X)，进行线性回归，3 2
得回归方程Y＝3.13×10X+3.06×10，r＝1.0000，奥硝唑最大杂质的峰面积与浓度倍数呈良好的线性关系。

[0193] 表14杂质线性试验结果

[0194]

[0195] 4.2最大杂质精密度试验

[0196] 精密量取奥硝唑注射液1.0ml，加流动相稀释至100ml，摇匀，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录最大杂质峰面积，计算RSD值。结果见表15。

[0197] 表15杂质精密度试验结果

[0198]编号 1# 2# 3# 4# 5# 6# RSD％
峰面积 31258 31317 31566 31519 31772 31830 0.73

[0199] 结果表明，精密度较好，RSD为0.73％。

[0200] 4.3最大杂质稳定性试验

[0201] 取精密度试验项下的供试品溶液，分别于0h、2h、4h、6h、8h精密吸取20μl，注入液相色谱议，记录杂质峰面积，考察供试品溶液杂质稳定性，计算RSD值，结果见表16。

[0202] 表16杂质稳定性试验结果

[0203]时间(h) 0 2 4 6 8 RSD％
峰面积 31258 31830 31611 31716 31629 0.68

[0204] 结果表明：供试品溶液在8h内稳定性较好，RSD为0.68％。

[0205] 4.4最大杂质含量测定

[0206] 精密量取本品1ml，加流动相稀释至100ml，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，加流动相稀释至100ml，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10～20％。再取供试品溶液及对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中单个杂质峰面积不得大于对照溶液中奥硝唑峰面积的0.4倍(0.4％)。测定结果见表17。

[0207] 表17含量测定结果

[0208]

[0209] 5样品杂质检查实例

[0210] 测定法

[0211] 精密量取奥硝唑注射液1ml，加流动相稀释至100ml，摇匀，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1ml，加流动相稀释至100ml，摇匀，作为对照溶液。另取2-甲基-5-硝基咪唑对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，并用流动相稀释制成每1ml约含2.5μg的溶液，摇匀，作为2-甲基-5-硝基咪唑对照品溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液20μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10～20％。再取供试品溶液、2-甲基-5-硝基咪唑对照品溶液及对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有与2-甲基-5-硝基咪唑保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过奥硝唑标示量的0.1％；其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液中奥硝唑峰面积的0.4倍(0.4％)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液中奥硝唑峰面积(1.0％)。

[0212] 照以上方法检测3个批次由“成都百裕科技制药有限公司”生产的奥硝唑注射液与市售品(商品名：普司立)，测定结果见表18。

[0213] 表18三批中试样品结果

[0214]

[0215] 综上，本发明检测方法测定奥硝唑中的2-甲基-5-硝基咪唑和最大杂质，测定结果更加准确可靠，专属性更强，主峰保留时间在11-14分钟，检测时间较短。