本发明涉及一种早期诊断试剂盒和一种预警试剂盒，具体讲，涉及一种移植肾排斥反应早期诊断及预警试剂盒及其使用方法，还涉及一些在移植肾急性排斥反应或移植肾排斥反应预警中的应用的蛋白质。应用液态蛋白质芯片luminex检测技术对142例急性移植肾排斥反应病人和移植肾功能稳定的移植受者共266份血清中的96种细胞因子/趋化因子及其受体的表达水平进行了监测和综合分析，建立了含至少一种联合标志物的移植肾排斥反应预警系统和含至少一种因子联合标志物的移植肾排斥反应早期诊断系统，对急性排斥反应的预测和准确率达到98.6％，内部交叉验证率分别为97.1％和97.2％。
1.一种移植肾排斥反应早期诊断或反应预警试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体，所述抗体选自抗EGF，抗Eotaxin，抗FGF-2，抗Flt-3ligand，抗Fractalkine，抗G-CSF，抗GM-CSF，抗GRO，抗IL-10，抗IL-12(p40)，抗IL-12(p70)，抗IL-13，抗IL-15，抗IL-17，抗IL-3，抗IL-5，抗IL-7，抗IL-8，抗IL-9，抗IP-10，抗MCP-1，抗MCP-3，抗MDC(CCL22)，抗MIP-1α，抗MIP-1β，抗PDGF-AA，抗PDGF-AB/BB，抗RANTES，抗TGF-α，抗TNF-β，抗VEGF，抗sCD40L，抗sIL-2Rα，抗6Ckine，抗BCA-1，抗CTACK，抗ENA-78，抗Eotaxin-2，抗Eotaxin-3，抗I-309，抗IL-16，抗IL-20，抗IL-21，抗IL-23，抗IL-28a，抗IL-33，抗LIF，抗MCP-2，抗MCP-4，抗MIP-1d，抗SCF，抗SDF-1A+β，抗TARC，抗TPO，抗TRAIL，抗TSLP，抗GCP2，抗HCC-1，抗I-TAC，抗IL-11，抗IL-29，抗Lymphotactin，抗M-CSF，抗MIG，抗MIP-3α，抗MIP-3β，抗NAP2，抗sEGFR，抗sIL-1RI(sCD121a)，抗sIL-1RII(sCD121b)，抗sIL-4R(sCD124)，抗sIL-6R(sCD126)，抗 sRAGE，抗 sTNFRI(sTNFRSF1A)，抗 sTNFRII(sTNFRSF1B)，抗 sVEGFR1(sFlt-1)，抗sVEGFR2(sFlk-1)，抗sVEGFR3(sFlt-4)，抗sgp130，抗MIF或抗PAI-1中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的移植肾排斥反应早期诊断或反应预警试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体，所述抗体选自抗EGF，抗Eotaxin，抗FGF-2，抗Flt-3ligand，抗Fractalkine，抗G-CSF，抗GM-CSF，抗GRO，抗IL-10，抗IL-12(p40)，抗IL-12(p70)，抗IL-13，抗IL-15，抗IL-17，抗IL-3，抗IL-5，抗IL-7，抗IL-8，抗IL-9，抗IP-10，抗MCP-1，抗MCP-3，抗MDC(CCL22)，抗MIP-1α，抗MIP-1β，抗PDGF-AA，抗PDGF-AB/BB，抗RANTES，抗TGF-α，抗TNF-β，抗VEGF，抗sCD40L，抗sIL-2Rα，抗6Ckine，抗BCA-1，抗CTACK，抗ENA-78，抗Eotaxin-2，抗Eotaxin-3，抗I-309，抗IL-16，抗IL-20，抗IL-21，抗IL-23，抗IL-28a，抗IL-33，抗LIF，抗MCP-2，抗MCP-4，抗MIP-1d，抗SCF，抗SDF-1A+β，抗TARC，抗TPO，抗TRAIL，抗TSLP，抗GCP2，抗HCC-1，抗I-TAC，抗IL-11，抗IL-29，抗Lymphotactin，抗M-CSF，抗MIG，抗MIP-3α，抗MIP-3β，抗NAP2，抗sEGFR，抗sIL-1RI(sCD121a)，抗sIL-1RII(sCD121b)，抗sIL-4R(sCD124)，抗sIL-6R(sCD126)，抗 sRAGE，抗 sTNFRI(sTNFRSF1A)，抗 sTNFRII(sTNFRSF1B)，抗 sVEGFR1(sFlt-1)，抗sVEGFR2(sFlk-1)，抗sVEGFR3(sFlt-4)，抗sgp130，抗MIF或抗PAI-1中的至少两种。
3.根据权利要求1所述的移植肾排斥反应早期诊断或反应预警试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体，所述抗体选自抗EGF，抗Eotaxin，抗FGF-2，抗Flt-3ligand，抗Fractalkine，抗G-CSF，抗GM-CSF，抗GRO，抗IL-10，抗IL-12(p40)，抗IL-12(p70)，抗IL-13，抗IL-15，抗IL-17，抗IL-3，抗IL-5，抗IL-7，抗IL-8，抗IL-9，抗IP-10，抗MCP-1，抗MCP-3，抗MDC(CCL22)，抗MIP-1α，抗MIP-1β，抗PDGF-AA，抗PDGF-AB/BB，抗RANTES，抗TGF-α，抗TNF-β，抗VEGF，抗sCD40L，抗sIL-2Rα，抗6Ckine，抗BCA-1，抗CTACK，抗ENA-78，抗Eotaxin-2，抗Eotaxin-3，抗I-309，抗IL-16，抗IL-20，抗IL-21，抗IL-23，抗IL-28a，抗IL-33，抗LIF，抗MCP-2，抗MCP-4，抗MIP-1d，抗SCF，抗SDF-1A+β，抗TARC，抗TPO，抗TRAIL，抗TSLP，抗GCP2,抗HCC-1，抗I-TAC，抗IL-11，抗IL-29，抗Lymphotactin，抗M-CSF，抗MIG，抗MIP-3α，抗MIP-3β，抗NAP2，抗sEGFR，抗sIL-1RI(sCD121a)，抗sIL-1RII(sCD121b)，抗sIL-4R(sCD124)，抗 sIL-6R(sCD126)，抗 sRAGE，抗 sTNFRI(sTNFRSF1A)，抗 sTNFRII(sTNFRSF1B)，抗sVEGFR1(sFlt-1)，抗sVEGFR2(sFlk-1)，抗sVEGFR3(sFlt-4)，抗sgp130，抗MIF或抗PAI-1中的至少三种。
4.根据权利要求1所述的移植肾排斥反应早期诊断或反应预警试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体，所述抗体选自抗EGF，抗Eotaxin，抗FGF-2，抗Flt-3ligand，抗Fractalkine，抗G-CSF，抗GM-CSF，抗GRO，抗IL-10，抗IL-12(p40)，抗IL-12(p70)，抗IL-13，抗IL-15，抗IL-17，抗IL-3，抗IL-5，抗IL-7，抗IL-8，抗IL-9，抗IP-10，抗MCP-1，抗MCP-3，抗MDC(CCL22)，抗MIP-1α，抗MIP-1β，抗PDGF-AA，抗PDGF-AB/BB，抗RANTES，抗TGF-α，抗TNF-β，抗VEGF，抗sCD40L，抗sIL-2Rα，抗6Ckine，抗BCA-1，抗CTACK，抗ENA-78，抗Eotaxin-2，抗Eotaxin-3，抗I-309，抗IL-16，抗IL-20，抗IL-21，抗IL-23，抗IL-28a，抗IL-33，抗LIF，抗MCP-2，抗MCP-4，抗MIP-1d，抗SCF，抗SDF-1A+β，抗TARC，抗TPO，抗TRAIL，抗TSLP，抗GCP2，抗HCC-1，抗I-TAC，抗IL-11，抗IL-29，抗Lymphotactin，抗M-CSF，抗MIG，抗MIP-3α，抗MIP-3β，抗NAP2，抗sEGFR，抗sIL-1RI(sCD121a)，抗sIL-1RII(sCD121b)，抗sIL-4R(sCD124)，抗sIL-6R(sCD126)，抗 sRAGE，抗 sTNFRI(sTNFRSF1A)，抗 sTNFRII(sTNFRSF1B)，抗 sVEGFR1(sFlt-1)，抗sVEGFR2(sFlk-1)，抗sVEGFR3(sFlt-4)，抗sgp130，抗MIF或抗PAI-1抗体中的至少4种。
5.根据权利要求1所述的移植肾排斥反应早期诊断或反应预警试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体，所述抗体选自抗EGF，抗Eotaxin，抗FGF-2，抗Flt-3ligand，抗Fractalkine，抗G-CSF，抗GM-CSF，抗GRO，抗IL-10，抗IL-12(p40)，抗IL-12(p70)，抗IL-13，抗IL-15，抗IL-17，抗IL-3，抗IL-5，抗IL-7，抗IL-8，抗IL-9，抗IP-10，抗MCP-1，抗MCP-3，抗MDC(CCL22)，抗MIP-1α，抗MIP-1β，抗PDGF-AA，抗PDGF-AB/BB，抗RANTES，抗TGF-α，抗TNF-β，抗VEGF，抗sCD40L，抗sIL-2Rα，抗6Ckine，抗BCA-1，抗CTACK，抗ENA-78，抗Eotaxin-2，抗Eotaxin-3，抗I-309，抗IL-16，抗IL-20，抗IL-21，抗IL-23，抗IL-28a，抗IL-33，抗LIF，抗MCP-2，抗MCP-4，抗MIP-1d，抗SCF，抗SDF-1A+β，抗TARC，抗TPO，抗TRAIL，抗TSLP，抗GCP2，抗HCC-1，抗I-TAC，抗IL-11，抗IL-29，抗Lymphotactin，抗M-CSF，抗MIG，抗MIP-3α，抗MIP-3β，抗NAP2，抗sEGFR，抗sIL-1RI(sCD121a)，抗sIL-1RII(sCD121b)，抗sIL-4R(sCD124)，抗sIL-6R(sCD126)，抗 sRAGE，抗 sTNFRI(sTNFRSF1A)，抗 sTNFRII(sTNFRSF1B)，抗 sVEGFR1(sFlt-1)，抗sVEGFR2(sFlk-1)，抗sVEGFR3(sFlt-4)，抗sgp130，抗MIF或抗PAI-1中的至少5种。
6.根据权利要求1所述的移植肾排斥反应早期诊断或反应预警试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体，所述抗体选自抗SCF，抗sEGFR，抗sIL-2Rα，抗sRAGE，抗sTNFR1，抗sTNFR2，抗sVEGFR2，抗sVCAM1，抗CCL14α-HCC1，抗sCD40L，抗Eotaxin，抗FGF2，抗Flt3ligand，抗Fracktalkine，抗GCSF，抗GRO，抗IL-1Rα，抗IL-3，抗IL-4，抗IL-6，抗IL-12p70，抗IL-13，抗IP10，抗MIP1α，抗VEGF，抗BCA-1，抗IL-16，抗MIP1d，抗IL-20，抗IL-28A，抗CXCL9MIG，抗CXCL111TAC或抗CCL19MIP3β中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的移植肾排斥反应早期诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体，所述抗体选自抗SCF，抗sEGFR，抗sIL-2Rα，抗sRAGE，抗sTNFR1，抗sTNFR2，抗sVEGFR2，抗sVCAM 1，抗CCL 14α-HCC 1，抗sCD40L，抗Eotaxin，抗FGF2，抗Flt3ligand，抗Fracktalkine,抗GCSF，抗GRO，抗IL-1Rα，抗IL-3，抗IL-4，抗IL-6，抗IL-12p70，抗IL-13，抗IP10，抗MIP1α，抗VEGF，抗BCA-1，抗IL-16，抗MIP1d，抗IL-20，抗IL-28A，抗CXCL9MIG，抗CXCL111TAC或抗CCL19MIP3β中的至少两种。
8.根据权利要求6所述的移植肾排斥反应早期诊断或反应预警试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体，所述抗体选自抗SCF，抗sEGFR，抗sIL-2Rα，抗sRAGE，抗sTNFR1，抗sTNFR2，抗sVEGFR2，抗sVCAM1，抗CCL14α-HCC1，抗sCD40L，抗Eotaxin，抗FGF2，抗Flt3ligand，抗Fracktalkine，抗GCSF，抗GRO，抗IL-1Rα，抗IL-3，抗IL-4，抗IL-6，抗IL-12p70，抗IL-13，抗IP10，抗MIP1α，抗VEGF，抗BCA-1，抗IL-16，抗MIP1d，抗IL-20，抗IL-28A，抗CXCL9MIG，抗CXCL111TAC或抗CCL19MIP3β中的至少3种。
9.根据权利要求6所述的移植肾排斥反应早期诊断或反应预警试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体，所述抗体选自抗SCF，抗sEGFR，抗sIL-2Rα，抗sRAGE，抗sTNFR1，抗sTNFR2，抗sVEGFR2，抗sVCAM1，抗CCL14α-HCC1，抗sCD40L，抗Eotaxin，抗FGF2，抗Flt3ligand，抗Fracktalkine，抗GCSF，抗GRO，抗IL-1Rα，抗IL-3，抗IL-4，抗IL-6，抗IL-12p70，抗IL-13，抗IP10，抗MIP1α，抗VEGF，抗BCA-1，抗IL-16，抗MIP1d，抗IL-20，抗IL-28A，抗CXCL9MIG，抗CXCL111TAC或抗CCL19MIP3β中的至少4种。
10.根据权利要求6所述的移植肾排斥反应早期诊断或反应预警试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体，所述抗体选自抗SCF，抗sEGFR，抗sIL-2Rα，抗sRAGE，抗sTNFR1，抗sTNFR2，抗sVEGFR2，抗sVCAM1，抗CCL14α-HCC1，抗sCD40L，抗Eotaxin，抗FGF2，抗Flt3ligand，抗Fracktalkine，抗GCSF，抗GRO，抗IL-1Rα，抗IL-3，抗IL-4，抗IL-6，抗IL-12p70，抗IL-13，抗IP10，抗MIP1α，抗VEGF，抗BCA-1，抗IL-16，抗MIP1d，抗IL-20，抗IL-28A，抗CXCL9MIG，抗CXCL111TAC或抗CCL19MIP3β中的至少5种。
11.根据权利要求1～10任一权利要求所述的移植肾排斥反应早期诊断或反应预警试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有：
（9）权利要求1所述的检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体；
12.根据权利要求11所述的移植肾排斥反应早期诊断或反应预警试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中：
（1）所述96孔滤膜板和两张封板膜购自Millipore公司，货号MX-PLATE；
（2）所述标准品购自Millipore公司，货号MXH8060,MXH8062,MXH8063,LHSP-8063和HSCR-8032；
（3）所述质控对照购自Millipore公司，货号为：MXH6060,MXH6062,MXH6063,LHSP-606
（4）所述血清基质购自Millipore公司，货号为：MXHSM，LHSP-SM,HSCR-SM；
（5）所述实验液购自Millipore公司，货号L-AB；
（6）所述洗液购自Millipore公司，货号L-WB；
（7）所述藻红蛋白-链霉亲合素标记抗体购自Millipore公司，货号L-SAPE9，L-SAPE
3,L-SAPE10,L-SAPE11,L-SAPE6；
（8）所述珠子稀释液购自Millipore公司，货号LBD；
（9） 检 测 抗 体 购 自 Millipore 公 司，货 号 MXH1060，MXH1062，MXH1063，LHSP-1063,HSCR-1032；
（10）所述预包被抗体的珠子购自Millipore公司，货号MXHPMX39，MXHP2PMX23,HSP，HASP-PAI1，MXH3PMX9，HSCRPMX14。
13.如权利要求1所述试剂盒的使用方法，其特征在于：
（1）采集全血，室温静置，1000rpm离心5～15分钟收取上清，分装后冷冻保存备用；
（2）用实验液或洗涤液预湿实验板，置于振荡器振摇5～20分钟；吸走实验板孔中的液体，吸干实验板底；
（3）相应孔分别加入梯度稀释的标准品、质控对照和样品；
（4）在背景孔、标准品和质控对照孔中加入血清基质；
（6）封板后将实验板振摇4℃孵育过夜或室温下孵育0.5～2h；吸走实验板孔中的液体，吸干实验板底；利用洗液洗涤实验板两次；
（7）每孔加入相应的检测抗体；室温下振摇实验板0.5～2h；
（8）每孔加入藻红蛋白-链霉亲合素标记抗体；室温下振摇实验板孵育20～40min；用洗液洗涤洗扳两次；
14.根据权利要求13所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：
（1）采集全血，室温静置1h后，1000rpm离心10分钟收取上清，分装后-80℃冰箱保存备用2ml；
（2）应用200μl实验液或洗涤液预湿实验板，置于振荡器振摇10～15分钟；应用负压吸引器吸走实验板孔中的液体，纸巾吸干实验板底；
（3）相应孔分别加入25μl梯度稀释的标准品、质控对照和样品；
（4）在背景孔、标准品和质控对照孔中加入血清基质25μl；
（6）封板后将实验板置于振荡器振摇4℃孵育过夜或室温下孵育1h；应用负压吸引器吸走实验板孔中的液体，纸巾吸干实验板底；每孔加入200μl洗液，应用负压吸引器吸走实验板孔中的液体，纸巾吸干实验板底，洗扳两次；
（7）每孔加入25μl检测抗体，室温下振荡器振摇实验板1h；
（8）每孔加入25μl藻红蛋白-链霉亲合素标记抗体，室温下振荡器振摇实验板孵育
30min；每孔加入200μl洗液，应用负压吸引器吸走实验板孔中的液体，纸巾吸干实验板底，洗扳两次；
（9）每孔加入150μl鞘液，流式点阵仪检测，软件分析，得到实验结果。
15.根据权利要求13或14所述的使用方法，其特征在于，在步骤（3）中标准品、质控对照和样品的按照1：4～5的比例逐级稀释。
16.根据权利要求13或14所述的使用方法，其特征在于，在步骤（9）中所述的鞘液购自luminex公司，货号为#40-50000。
17.根据权利要求13或14所述的使用方法，其特征在于，在步骤（9）中所述的流式点阵仪为luminex200，软件为MILLIPLEX Analyst分析。
移植肾排斥反应早期诊断及预警试剂盒
技术领域
[0001] 本发明涉及一种早期诊断试剂盒和一种预警试剂盒，具体讲，涉及一种移植肾排斥反应早期诊断及预警试剂盒及检测方法，还涉及一些在移植肾急性排斥反应或移植肾排斥反应预警中的应用的蛋白质。
背景技术
[0002] 全球因慢性肾功能衰竭而行透析的人数已由1990年的42.6万人增加至2000年的106.5万人，预计到2010年将达到200余万人。这一人数的增长，致使全球透析费用迅速增长，对发达国家、发展中国家均造成了巨大的经济负担。我国约有100万尿毒症患者，每年新增12万人，每年约有50万患者需要肾移植。目前我国已累计开展各种器官移植近10万例，成为世界第二器官移植大国，其中最多的是肾脏移植，累计达8万多例。移植受者和移植物有功能长期存活是器官移植追求的最终目标。随着手术技术的进步、组织配型技术的提高和免疫抑制剂的发展，肾移植术后1年存活率已大大提高，但长期预后仍有待改善。急性排斥反应的反复发作和慢性排斥反应是引起移植物失功的主要原因，长期服用免疫抑制剂所带来的毒副作用，如肾毒性、感染、诱发肿瘤等，亦影响移植物及受者的长期存活。 [0003] 反复发作的急性排斥反应与慢性排斥反应是引起移植物失功的重要原因，但临床上缺乏有效的动态监测与无创诊断手段。移植肾穿刺活检是目前最可靠的诊断方法，但具有创伤性，可引起感染、出血、甚至移植物丢失等，不易被患者接受且不利于动态观察。并且活检取材也有一定的局限性，根据Banff标准，许多临床怀疑移植肾排斥的患者在病理形态上可能并不能符合排斥的诊断标准。
[0004] 因此，迫切需要探索适合我国人群的、可靠的、可满足动态观察需要的移植肾排斥反应无创性诊断方法。该课题的完成将在很大程度上辅助延长患者移植后生存期，提高生存质量，减少国家医疗投入，节省家庭开支，具有极大的临床应用价值和社会、经济效益，并有助于我国移植界具有国际领先水平的自主知识产权成果的产出。
[0005] 移植肾排斥反应的无创诊断技术的研究现状：自20世纪80年代起，移植学界已开始动态观察移植受者各种血清中多种细胞因子水平及变化，探索移植排斥反应的发生机制及其诊断方法。例如IL-6、可溶型IL-6受体(IL-6R)可溶性CD30(sCD30)、肝细胞再生因子(hepatocyte growth factor，HGF)、IL-18、转移生长因子-β(Transforming Growth Factor Beta，TGF-β)、IL-17、颗粒酶B、穿孔素、FasL、粒溶素、CD154、ICOS、CTLA4、PD-1等分子与移植肾排斥反应相关。中国人民解放军第三○九医院器官移植中心在1994年对37例肾移植受者和55名正常人血清IL-6水平的动态测定，结果表明，移植肾急性排异患者血清IL-6水平明显升高，而慢性排异患者IL-6水平无显著变化，提示血清IL-6水平监测是移植肾排斥反应的重要诊断指标之一；随后，又分别对血清免疫细胞抑制性受体(leukocyte-associated Ig-like receptor-1，LAIR-1)，可溶型LAIR-2分子，HLA-G，血小板/T细胞活化抗原1(platelet and T cell activation antigen 1，PTA1，CD226)和同种异体混合淋巴细胞反应中特异性表达的p140等与移植肾排斥反应的相关性进行了研究和报道。然而，尽管众多科研工作者致力于筛选移植排斥特异性的生物标记，但至今尚未筛选出特异性分子应用于排斥反应的无创性诊断和鉴别诊断。目前国际上仍缺乏移植肾排斥反应的无创诊断和预警体系。
[0006] 移植排斥反应是一个非常复杂的过程，细胞免疫和体液免疫机制均参与这个过程，而且，移植物的差异，手术的影响，移植受者个体的差异以及临床上不同免疫抑制方案的应用等众多因素的参与使移植排斥反应的诊断更加复杂和困难。另外，既往研究表明，通过检测单个分子来明确诊断移植排斥反应有很大的难度。早期卵巢上皮癌的血清诊断体系的成功建立，为移植排斥反应的无创诊断提供了新的研究思路。2005年，耶鲁大学的Gil等通过对已知蛋白标记的筛选，成功建立了由Leptin，泌乳刺激素(prolactin)，骨桥蛋白(osteopontin，OPN)和胰岛素样生长因子II(IGF-II)组成的早期卵巢上皮癌的血清诊断体系，将诊断敏感度、特异性、阳性预测值(positive predictive value，PPV)和阴性预测值(negtive predictive value，NPV)分别提高至95％、95％、95％和94％。因此，在鉴定移植排斥特异性标志物的同时，对已知的移植排斥相关的生物标记进行筛选和组合，通过多分子综合分析，建立排斥反应的联合标志物群诊断和预警体系，具有更强的可行性和更高的敏感度。
[0007] Luminex技术是一种多功能的液相芯片分析平台。它整和了有色微球(color-codedmicrosphere or bead)、激光技术、应用流体学、高速数字信号处理器和计算机运算法则，具有极高的检测特异性和灵敏度。微球的颜色是通过两种荧光染料染色得到的，调节两种荧光染料的比例可以获得100种不同颜色的微球，每种颜色的微球可以携带一种生物探针。探针通过羧基结合到微球表面，因此一个反应孔内可以完成100种不同的生物学反应。Luminex技术通过鉴定微球的颜色来确定反应类型，而对反应的定量分析是通过靶物质上的报告分子完成的。它具备多参数高通量分析、节约试剂和标本、操作简单等多种优势。采用Luminex液态芯片系统定量检测候选分子，只需30ul样本即可同时检测多个指标，在4小时内可以完 成分析，灵敏度可以达到3pg/ml。
发明内容
[0008] 本发明的首要发明目的在于提供一种移植肾排斥反应早期诊断试剂盒； [0009] 本发明的第二发明目的在于提供一种移植肾排斥反应预警试剂盒；
[0010] 本发明的第三发明目的在于提供以上试剂盒的使用方法；
[0011] 本发明的第四发明目的在于提供蛋白SCF、sRAGE、CXCL7NAP2、CCL14α-HCC1、sCD40L、GCSF、GRO、IL-1Rα、MCP3、IL-20、MIP1d、IL-28A、IL-29IFNλ1在移植肾急性排斥反应或移植肾排斥反应预警中的应用。
[0012] 为了实现本发明的第一个发明目的，采用的技术方案为：
[0013] 本发明涉及一种移植肾排斥反应早期诊断试剂盒，所述试剂盒包括检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体，所述抗体选自抗EGF，抗Eotaxin，抗FGF-2，抗Flt-3ligand，抗Fractalkine，抗G-CSF，抗GM-CSF，抗GRO，抗IFN-α2，抗IFN-γ，抗IL-10，抗IL-12(p40)，抗IL-12(p70)，抗IL-13，抗IL-15，抗IL-17，抗IL-1ra，抗IL-1α，抗IL-1β，抗IL-2，抗IL-3，抗IL-4，抗IL-5，抗IL-6，抗IL-7，抗IL-8，抗IL-9，抗IP-10，抗MCP-1，抗MCP-3，抗MDC(CCL22)，抗MIP-1α，抗MIP-1β，抗PDGF-AA，抗PDGF-AB/BB，抗RANTES，抗TGF-α，抗TNF-α，抗TNF-β，抗VEGF，抗sCD40L，抗sIL-2Rα，抗6Ckine，抗BCA-1，抗CTACK，抗ENA-78，抗Eotaxin-2，抗Eotaxin-3，抗I-309，抗IL-16，抗IL-20，抗IL-21，抗IL-23，抗IL-28a，抗IL-33，抗LIF，抗MCP-2，抗MCP-4，抗MIP-1d，抗SCF，抗SDF-1A+β，抗TARC，抗TPO，抗TRAIL，抗TSLP，抗GCP2，抗HCC-1，抗I-TAC，抗IL-11，抗IL-29，抗Lymphotactin，抗M-CSF，抗MIG，抗MIP-3α，抗MIP-3β，抗NAP2，抗sCD30(sTNFRSF8)，抗sEGFR，抗sIL-1RI(sCD121a)，抗 sIL-1RII(sCD121b)，抗 sIL-2Rα(sCD25)，抗 sIL-4R(sCD124)，抗 sIL-6R(sCD126)，抗 sRAGE，抗 sTNFRI(sTNFRSF1A)，抗 sTNFRII(sTNFRSF 1B)，抗sVEGFR1(sFlt-1)，抗sVEGFR2(sFlk-1)，抗 sVEGFR3(sFlt-4)，抗sgp 130，抗MIF，抗PAI-1(Total)，抗sFas，抗sFasL，抗sICAM-1或抗sVCAM-1抗体中的至少一种，优选至少两种抗体，更优选至少3种抗体，再优选至少4种抗体，最优选至少5种抗体。
[0014] 本发明该技术方案的第一优选技术方案为：所述试剂盒包括检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体，所述抗体选自抗SCF，抗sEGFR，抗sIL-2Rα，抗sRAGE，抗sTNFR1，抗sTNFR2，抗sVEGFR2，抗sVCAM1，抗sFas，抗CCL14α-HCC1，抗sCD40L，抗Eotaxin，抗FGF2，抗 Flt3ligand，抗Fracktalkine，抗GC SF，抗GRO，抗IFNγ，抗IL-1Rα，抗IL-3，抗IL-4，抗IL-6，抗IL-12p70，抗IL-13，抗IP10，抗MIP1α，抗VEGF，抗BCA-1，抗IL-16，抗MIP1d，抗IL-20，抗IL-28A，抗CXCL9MIG，抗CXCL111TAC或抗CCL19MIP3β中的至少一种抗体，优选至少两种抗体，更优选至少3种，再优选至少4种，最优选至少5种。
[0015] 本发明该技术方案的第三优选技术方案为：所述试剂盒还含有：
[0016] (1)96孔滤膜板和两张封板膜；
[0017] (2)所述试剂盒中蛋白抗体的标准品；
[0018] (3)质控对照；
[0019] (4)血清基质；
[0020] (5)实验液；
[0021] (6)洗液；
[0022] (7)streptavidin-phycoerythrin(藻红蛋白-链霉亲合素)标记抗体； [0023] (8)珠子稀释液；
[0024] (9)权利要求1所述的检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体；
[0025] (10)预包被抗体的珠子。
[0026] 本发明该技术方案的第四优选技术方案为：所述试剂盒中：
[0027] (1)所述96孔滤膜板和两张封板膜购自Millipore公司，货号MX-PLATE； [0028] (2)所述标准品购自Millipore公司，货号MXH8060，MXH8062，MXH8063，LHSP-8063和HSCR-8032；
[0029] (3)所述质控对照购自Millipore公司，货号为：MXH6060，MXH6062，MXH6063，LHSP-6063和HSCR-6032；
[0030] (4)所述血清基质购自Millipore公司，货号为：MXHSM，LHSP-SM，HSCR-SM； [0031] (5)所述实验液购自Millipore公司，货号L-AB；
[0032] (6)所述洗液购自Millipore公司，货号L-WB；
[0033] (7)所述streptavidin-phycoerythrin标记抗体购自Millipore公司，货号L-SAPE9，L-SAPE3，L-SAPE10，L-SAPE11，L-SAPE6；
[0034] (8)所述珠子稀释液购自Millipore公司，货号LBD；
[0035] (9)检测抗体购自Millipore公司，货号MXH1060，MXH1062，MXH1063，LHSP-1063，HSCR-1032；
[0036] (10)所述预包被抗体的珠子购自Millipore公司，货号MXHPMX39，MXHP2PMX23，HSP， HASP-PAI1，MXH3PMX9，HSCRPMX14。
[0037] 为实现本发明的第二发明目的，采用的技术方案为：一种移植肾排斥反应预警试剂盒，所述试剂盒包括检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体，所述抗体选自抗EGF，抗Eotaxin，抗FGF-2，抗Flt-3ligand，抗Fractalkine，抗G-CSF，抗GM-CSF，抗GRO，抗IFN-α2，抗IFN-γ，抗IL-10，抗IL-12(p40)，抗IL-12(p70)，抗IL-13，抗IL-15，抗IL-17，抗IL-1ra，抗IL-1α，抗IL-1β，抗IL-2，抗IL-3，抗IL-4，抗IL-5，抗IL-6，抗IL-7，抗IL-8，抗IL-9，抗IP-10，抗MCP-1，抗MCP-3，抗MDC(CCL22)，抗MIP-1α，抗MIP-1β，抗PDGF-AA，抗PDGF-AB/BB，抗RANTES，抗TGF-α，抗TNF-α，抗TNF-β，抗VEGF，抗sCD40L，抗sIL-2Rα，抗6Ckine，抗BCA-1，抗CTACK，抗ENA-78，抗Eotaxin-2，抗Eotaxin-3，抗I-309，抗IL-16，抗IL-20，抗IL-21，抗IL-23，抗IL-28a，抗IL-33，抗LIF，抗MCP-2，抗MCP-4，抗MIP-1d，抗SCF，抗SDF-1A+β，抗TARC，抗TPO，抗TRAIL，抗TSLP，抗GCP2，抗HCC-1，抗I-TAC，抗IL-11，抗IL-29，抗Lymphotactin，抗M-CSF，抗MIG，抗MIP-3α，抗MIP-3β，抗NAP2，抗sCD30(sTNFRSF8)，抗sEGFR，抗sIL-1RI(sCD121a)，抗sIL-1RII(sCD121b)，抗 sIL-2Rα(sCD25)，抗sIL-4R(sCD124)，抗 sIL-6R(sCD126)，抗 sRAGE，抗 sTNFRI(sTNFRSF1A)，抗 sTNFRII(sTNFRSF1B)，抗 sVEGFR1(sFlt-1)，抗sVEGFR2(sFlk-1)，抗sVEGFR3(sFlt-4)，抗sgp130，抗MIF，抗PAI-1(Total)，抗sFas，抗sFasL，抗sICAM-1或抗sVCAM-1抗体中的至少一种，优选至少两种抗体，更优选至少3种抗体，再优选至少4种抗体，最优选至少5种抗体。
[0038] 本发明该技术方案的第一优选技术方案为：所述试剂盒包括检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体，所述抗体选自抗SCF，抗sEGFR，抗sIL-2Rα，抗sRAGE，抗sTNFR1，抗sTNFR2，抗sVEGFR2，抗sVCAM1，抗sFas，抗CCL14α-HCC1，抗sCD40L，抗Eotaxin，抗FGF2，抗Flt3ligand，抗Fracktalkine，抗GC SF，抗GRO，抗IFNγ，抗IL-1Rα，抗IL-3，抗IL-4，抗IL-6，抗IL-12p70，抗IL-13，抗IP10，抗MIP1α，抗VEGF，抗BCA-1，抗IL-16，抗MIP1d，抗IL-20，抗IL-28A，抗CXCL9MIG，抗CXCL111TAC或抗CCL19MIP3β中的至少一种抗体，优选至少两种抗体，更优选至少3种，再优选至少4种，最优选至少5种。
[0039] 本发明该技术方案的第二优选技术方案为，所述试剂盒还含有：
[0040] (1)96孔滤膜板和两张封板膜；
[0041] (2)所述试剂盒中蛋白抗体的标准品；
[0042] (3)质控对照；
[0043] (4)血清基质；
[0044] (5)实验液；
[0045] (6)洗液；
[0046] (7)streptavidin-phycoerythrin标记抗体；
[0047] (8)珠子稀释液；
[0048] (9)权利要求10所述的检测移植肾排斥反应的蛋白的抗体；
[0049] (10)预包被抗体的珠子。
[0050] 本发明该技术方案的第三优选技术方案为所述试剂盒中：
[0051] (1)所述96孔滤膜板和两张封板膜购自Millipore公司，货号MX-PLATE； [0052] (2)所述标准品购自Millipore公司，货号MXH8060，MXH8062，MXH8063，LHSP-8063和HSCR-8032；
[0053] (3)所述质控对照购自Millipore公司，货号为：MXH6060，MXH6062，MXH6063，LHSP-6063和HSCR-6032；
[0054] (4)所述血清基质购自Millipore公司，货号为：MXHSM，LHSP-SM，HSCR-SM； [0055] (5)所述实验液购自Millipore公司，货号L-AB；
[0056] (6)所述洗液购自Millipore公司，货号L-WB；
[0057] (7)所述streptavidin-phycoerythrin标记抗体购自Millipore公司，货号L-SAPE9，L-SAPE3，L-SAPE10，L-SAPE11，L-SAPE6；
[0058] (8)所述珠子稀释液购自Millipore公司，货号LBD；
[0059] (9)检测抗体购自Millipore公司，货号MXH1060，MXH1062，MXH1063，LHSP-1063，HSCR-1032；
[0060] (10)所述预包被抗体的珠子购自Millipore公司，货号MXHPMX39，MXHP2PMX23，HSP，HASP-PAI1，MXH3PMX9，HSCRPMX14。
[0061] 为了实现本发明的第三个发明目的，采用的技术方案为：
[0062] 本发明的试剂盒的使用方法为：包括以下步骤：
[0063] (1)采集全血，室温静置，1000rpm离心5～15分钟收取上清，分装后冷冻保存备用；
[0064] (2)用实验液或洗涤液预湿实验板，置于振荡器振摇5～20分钟；吸走实验板孔中的液体，吸干实验板底；
[0065] (3)相应孔分别加入梯度稀释的标准品、质控对照和样品；
[0066] (4)在背景孔、标准品和质控对照孔中加入血清基质；
[0067] (5)每孔加入珠子；
[0068] (6)封板后将实验板振摇4℃孵育过夜或室温下孵育0.5～2h；吸走实验板孔中的液体，吸干实验板底；利用洗液洗涤实验板两次；
[0069] (7)每孔加入相应的检测抗体；室温下振摇实验板0.5～2h；
[0070] (8)每孔加入streptavidin-phycoerythrin标记抗体；室温下振摇实验板孵育20～40min；用洗液洗涤洗扳两次；
[0071] (9)每孔加入鞘液，检测分析得到实验结果。
[0072] 本发明所述的试剂盒的使用方法的第一优选技术方案为，包括以下步骤： [0073] (1)采集全血，室温静置1h后，1000rpm离心10分钟收取上清，分装后-80。C冰箱保存备用2ml；
[0074] (2)应用200μl实验液或洗涤液预湿实验板，置于振荡器振摇10～15分钟；应用负压吸引器吸走实验板孔中的液体，纸巾吸干实验板底；
[0075] (3)相应孔分别加入25μl梯度稀释的标准品、质控对照和样品；
[0076] (4)在背景孔、标准品和质控对照孔中加入血清基质25μl；
[0077] (5)每孔加入25μl珠子；
[0078] (6)封板后将实验板置于振荡器振摇4℃孵育过夜或室温下孵育1h；应用负压吸引器吸走实验板孔中的液体，纸巾吸干实验板底；每孔加入200μl洗液，应用负压吸引器吸走实验板孔中的液体，纸巾吸干实验板底，洗扳两次；
[0079] (7)每孔加入25μl检测抗体，室温下振荡器振摇实验板1h；
[0080] (8)每孔加入25μl streptavidin-phycoerythrin标记抗体，室温下振荡器振摇实验板孵育30min；每孔加入200μl洗液，应用负压吸引器吸走实验板孔中的液体，纸巾吸干实验板底，洗扳两次；
[0081] (9)每孔加入150μl鞘液，流式点阵仪检测，软件分析，得到实验结果。 [0082] 本发明所述的试剂盒的使用方法的第二优选技术方案为，在步骤(3)中标准品、质控对照和样品的按照1；4～5的比例逐级稀释。标准品和质控对照的初始浓度采用了与Luminex检测试剂盒Human Cytokine/Chemokine(MPXHCYTO-60K)、Human Cytokine/Chemokine Panel II(MPXHCYP2-62K)、Human Cytokine/Chemokine Panel III(MPXHCYP3-63K)、Human Soluble Cytokine Receptor Panel(HSCR-32K-PMX14)、Human Sepsis Panel I(HSEP-63K)中相同的浓度。
[0083] 本发明所述的试剂盒的使用方法的第三优选技术方案为，在步骤(9)中所述的鞘液购自 luminex公司，货号为#40-50000。
[0084] 本发明所述的试剂盒的使用方法的第四优选技术方案为，在步骤(9)中所述的流式点阵仪为luminex200，软件为MILLIPLEX Analyst分析。
[0085] 本发明的第四发明目的在于提供蛋白SCF、sRAGE、CXCL7NAP2、CCL14α-HCC1、sCD40L、GCSF、GRO、IL-1Rα、MCP3、IL-20、MIP1d、IL-28A、IL-29IFNλ1在移植肾急性排斥反应或移植肾排斥反应预警中的应用。
[0086] 其中，所述的蛋白的筛选方法为：首先，采集肾移植受者的移植术后多个时间点的血清，并对临床病例进行分析和分组；然后应用Luminex系统对各组血清中96种细胞因子及趋化因子的表达水平进行检测；最后，统计学方法筛选出移植排斥反应相关的标志物，联合应用这些标志物群，建立以多因子综合分析为特征的移植肾排斥反应的诊断和预警体系。
[0087] 本发明应用美国密理博公司(Millipore)的Luminex检测试剂盒：MPXHCYTO-60K、MPXHCYP2PMX23、MPXHCYP2-62K、MPXHCYP3-63K、HSCR-32K-PMX14、HSEP-63K-06，共检测96种细胞因子、细胞因子受体以及趋化因子在急性排斥反应组和移植肾功能稳定组病人血清中的表达水平。具体实验过程见各试剂盒说明书。
[0088] 应用统计学分析软件SPSS16.0对检测数据进行正态性检验和方差齐性检验后，非正态分布资料应用minitab15.0进行数据转换，经数据转换后为正态分布的应用T检验分析急性排斥反应组和移植肾功能稳定组间表达水平有显著性差异的标记物，未能转换为正态分布的资料经非参分析的方法分析表达水平有显著性差异的标记物。分析后共得到35个有显著性差异的标记物：SCF，sEGFR，sIL-2Rα，sRAGE，sTNFR1，sTNFR2，sVEGFR2，sVCAM1，sFas，CCL14α-HCC1，sCD40L，Eotaxin，FGF2，Flt3ligand，Fracktalkine，GCSF，GRO，IFNγ，IL-1Rα，IL-3，IL-4，IL-6，IL-12p70，IL-13，IP10，MIP1α，VEGF，BCA-1，IL-16，MIP1d，IL-20，IL-28A，CXCL9MIG，CXCL111TAC，CCL19MIP3β。其中，蛋白SCF，11sRAGE，CXCL7NAP2，CCL14α-HCC1，sCD40L，GCSF，GRO，IL-1Rα，MCP3，IL-20，MIP1d，IL-28A，IL-29IFNλ1未见有在移植肾急性排斥反应或移植肾排斥反应预警中的报道。
[0089] 下面对本发明的内容进行详细说明：
[0090] 发明人应用液态蛋白质芯片luminex检测技术对142例急性移植肾排斥反应病人和移植肾功能稳定的移植受者共266份血清中的96种细胞因子/趋化因子及其受体的表达水平进行 了监测和综合分析，建立了含至少一种联合标志物的移植肾排斥反应预警系统和含至少一种因子联合标志物的移植肾排斥反应早期诊断系统，对急性排斥反应的预测和准确率达到98.6％，内部交叉验证率分别为97.1％和97.2％。其中，优选的，移植肾排斥反应预警系统中优选含有至少3种所述的蛋白抗体，移植肾排斥反应早期诊断系统含有至少4种所述的蛋白抗体。其中，所述试剂盒中所含有的本发明所述的蛋白因子越多，其准确度越高，但会增加实际操作中的复杂性。
[0091] 本发明所述的标记物蛋白的筛选过程为：
[0092] (1)采集肾移植受者的移植术前及术后多个时间点的血清、尿样和PBMC，并对临床病例进行分析和分组。
[0093] (2)应用Luminex系统对各组血清和尿液中96种细胞因及趋化因子的表达水平进行检测。
[0094] (3)统计学方法(ANOVA)筛选出移植排斥反应相关的标志物，联合应用这些标志物群，建立以多因子综合分析为特征的移植肾排斥反应的诊断和预警体系。
[0095] 本发明的试剂盒是在美国密理博公司(Millipore)的Luminex检测试剂盒 HumanCytokine/Chemokine(MPXHCYTO-60K)、Human Cytokine/Chemokine Panel II(MPXHCYP2-62K)、Human Cytokine/Chemokine Panel III(MPXHCYP3-63K)、Human Soluble Cytokine Receptor Panel(HSCR-32K-PMX14)、Human Sepsis Panel I(HSEP-63K)的基础上，对急性移植肾排斥反应病人和移植肾功能稳定的移植受者血清中的96种细胞因子/趋化因子及其受体的表达水平进行了分析得到的，本发明试剂盒中的试剂的大部分购自Millipore公司，公众可通过本发明中公开的货号从市场上购得。Luminex检测试剂盒的原理为双抗体夹心法。
[0096] 本发明通过建立排斥反应的联合标志物群诊断和预警体系，具有更强的可行性和更高的敏感度。附图说明：
[0097] 图1为实施例2中移植肾排斥反应早期诊断试剂盒的诊断曲线下面积图； [0098] 图2为实施例3中移植肾排斥反应早期诊断试剂盒的诊断曲线下面积图； [0099] 图3为实施例5中移植肾排斥反应预警试剂盒的诊断曲线下面积图；
[0100] 图4为实施例6中移植肾排斥反应预警试剂盒的诊断曲线下面积图；
[0101] 图5为移植肾功能稳定组和急性移植肾排斥反应组在早期诊断系统中各因子在血清中的浓度比较图，其中0为稳定组，1为排斥组；
[0102] 图6为移植肾功能稳定组和急性移植肾排斥反应组在预警系统中各因子在血清中的浓度比较图，其中0为稳定组，1为排斥组。
[0103] 以下具体实施方式仅对本发明的内容做进一步的解释和说明，并不对本发明的内容构成限制。
具体实施方式
[0104] 实施例1移植肾排斥反应早期诊断试剂盒显著性差异标记物的筛选
[0105] 1、采集肾移植受者的移植术后多个时间点的血清，并对临床病例进行分析和分组。
[0106] 1.1选取术前基础病或者并发症少，手术未发生严重并发症的移植肾受者，分别在肾移植受者移植术后1天、7天、14天、21天、28天、2个月、3个月～12个月采集全血2ml，室温静置1h后，1000rpm离心10分钟收取上清，分装后-80℃冰箱保存备用。另外随时收取急性排斥反应组患者在急性排斥反应确诊后的血清。
[0107] 1.2根据肾移植患者血清肌酐、尿素氮、移植肾B超、临床表现、穿刺病理诊断结果和激素冲击治疗是否有效等综合分析和病例筛选，将收集病例分为两组：急性排斥反应组和移植肾功能稳定组。急性排斥反应组33例，移植肾功能稳定组38例。
[0108] 1.3急性排斥反应组入组标准：
[0109] ①未发生肾移植外科并发症、感染以及其他严重并发症的肾移植患者； [0110] ②活检穿刺病理诊断为急性排斥反应的病例；
[0111] ③未经活检穿刺的病例根据临床诊断和激素冲击治疗的有效性进行判断：肾移植患者血清肌酐＞120μmol/L，尿素氮＞8.3mmol/L，移植肾B超显示移植肾体积增大、血流减少、血管阻力增加，临床表现为发热，伴乏力关节酸痛、体重增加、血压升高、尿量减少和移植肾胀痛等，穿刺病理诊断结果为急性排斥反应，激素冲击治疗后血清肌酐下降10％以上。
[0112] 1.4移植肾功能稳定组入组标准：
[0113] ①未发生肾移植外科并发症、感染以及其他严重并发症的肾移植患者； [0114] ②未发生排斥反应；
[0115] ③移植肾功能恢复较快(14天内血清肌酐降至正常(＜120μmol/L))。 [0116] 2、应用Luminex系统对各组血清中96种细胞因子及趋化因子的表达水平进行检测。
[0117] 2.1选取移植肾功能稳定组病人血清肌酐恢复正常时(肾移植术后7天或14天)的血清样本共38份急性排斥反应组发生排斥反应并确诊后时收取的血清32份； [0118] 2.2应用美国密理博公司(Millipore)Luminex检测试剂盒(MPXHCYTO-60K、 MPXHCYP2PMX23、MPXHCYP2-62K、MPXHCYP3-63K、HSCR-32K-PMX14、HSEP-63K-06)共检测96种细胞因子、细胞因子受体以及趋化因子在急性排斥反应组和移植肾功能稳定组病人血清中的表达水平；具体实验过程见各试剂盒说明书；其中，移植肾功能稳定组和急性移植肾排斥反应组早期诊断系统中各因子在血清中的浓度比较如图5所示，其中0为稳定组，1为排斥组；
[0119] 简要实验过程为：应用assay buffer200μl预湿实验板，置于振荡器振摇10分钟后应用负压吸引器吸走实验板孔中的液体，纸巾吸干实验板底后分别加入25μl梯度稀释的标准品、对照和样品，随后每孔加入25μl珠子，封板后将实验板置于振荡器振摇4℃孵育过夜，洗板后加入检测抗体，室温振荡器振摇实验板1h，再加入streptavidin-phycoerythrin标记抗体后孵育30min，洗板后luminex200上机检测，MILLIPLEX Analyst软件分析；
[0120] 3、统计学方法筛选出移植排斥反应相关的标志物，联合应用这些标志物群，建立以多因子综合分析为特征的移植肾排斥反应的诊断体系。
[0121] 应用统计学分析软件SPSS16.0对检测数据进行正态性检验和方差齐性检验后，非正态分布资料应用minitab15.0进行数据转换，经数据转换后为正态分布的应用T检验分析急性排斥反应组和移植肾功能稳定组间表达水平有显著性差异的标记物，未能转换为正态分布的资料经非参分析的方法分析表达水平有显著性差异的标记物。分析后共得到35个有显著性差异的标记物：SCF，sEGFR，sIL-2Rα，sRAGE，sTNFR1，sTNFR2，sVEGFR2，sVCAM1，sFas，CCL14α-HCC1，sCD40L，Eotaxin，FGF2，Flt3ligand，Fracktalkine，GCSF，GRO，IFNγ，IL-1Rα，IL-3，IL-4，IL-6，IL-12p70，IL-13，IP10，MIP1α，VEGF，BCA-1，IL-16，MIP1d，IL-20，IL-28A，CXCL9MIG，CXCL111TAC，CCL19MIP3β。
[0122] 实施例2
[0123] 将实施例1得到的35个有显著性差异的标记物进行分析，对这些表达水平有显著性差异的标记物进行logstic回归分析后得到4个因子：SCF、sEGFR、sIL2Ralpha和Eotaxin组成的移植肾急性排斥反应的预警诊断系统，统计学分析得到预测阳性率为91.4。ROC诊断曲线下面积为97.5％，见附图1。
[0124] 其中，试剂盒的具体组成为：
[0125] (1)96孔滤膜板和两张封板膜；购自Millipore公司，货号MX-PLATE； [0126] (2)所述试剂盒中蛋白抗体的标准品；购自Millipore公司，货号MXH8060，MXH8062，MXH8063，LHSP-8063和HSCR-8032；
[0127] (3)质控对照；购自Millipore公司，货号为：MXH6060，MXH6062，MXH6063，LHSP-6063和HSCR-6032；
[0128] (4)血清基质；购自Millipore公司，货号为：MXHSM，LHSP-SM，HSCR-SM； [0129] (5)实验液；购自Millipore公司，货号L-AB；
[0130] (6)洗液；购自Millipore公司，货号L-WB；
[0131] (7)streptavidin-phycoerythrin标记抗体；购自Millipore公司，货号L-SAPE9，L-SAPE3，L-SAPE10，L-SAPE11，L-SAPE6；
[0132] (8)珠子稀释液；液购自Millipore公司，货号LBD；
[0133] (9)抗SCF的抗体、抗sEGFR的抗体、抗sIL2Ralpha的抗体和抗Eotaxin的抗体；购自Millipore公司，货号MXH1060，MXH1062，MXH1063，LHSP-1063，HSCR-1032； [0134] (10)预包被抗体的珠子，购自Millipore公司，货号MXHPMX39，MXHP2PMX23，HSP，HASP-PAI1，MXH3PMX9，HSCRPMX14。
[0135] 实施例3：移植肾急性排斥反应早期诊断试剂盒的组成：
[0136] 将实施例1得到的35个有显著性差异的标记物进行分析，对这些表达水平有显著性差异的标记物进行logstic回归分析后得到14个因子：sTNFR2、Flt3Ligand、Fractalkine、IL1ra、IL2、MDC、MIP1alpha、SDF1alphabeta、TARC、TRAIL、SCF、CCL20、MIP3alpha和XCL1Lymphotactin；统计学分析得到早期诊断系统预测阳性率为98.6％，ROC诊断曲线下面积为99.8％，见附图2。
[0137] 其中，试剂盒的具体组成为：
[0138] (1)96孔滤膜板和两张封板膜；购自Millipore公司，货号MX-PLATE； [0139] (2)所述试剂盒中蛋白抗体的标准品；购自Millipore公司，货号MXH8060，MXH8062，MXH8063，LHSP-8063和HSCR-8032；
[0140] (3)质控对照；购自Millipore公司，货号为：MXH6060，MXH6062，MXH6063，LHSP-6063和HSCR-6032；
[0141] (4)血清基质；购自Millipore公司，货号为：MXHSM，LHSP-SM，HSCR-SM； [0142] (5)实验液；购自Millipore公司，货号L-AB；
[0143] (6)洗液；购自Millipore公司，货号L-WB；
[0144] (7)streptavidin-phycoerythrin标记抗体；购自Millipore公司，货号L-SAPE9，L-SAPE3，L-SAPE10，L-SAPE11，L-SAPE6；
[0145] (8)珠子稀释液；液购自Millipore公司，货号LBD；
[0146] (9)抗sTNFR2的抗体、抗Flt3Ligand的抗体、抗Fractalkine的抗体、抗IL1ra的抗体、抗IL2的抗体、抗MDC的抗体、抗MIP1alpha的抗体、抗SDF1alphabeta的抗体、抗TARC的抗体、抗TRAIL的抗体、抗SCF的抗体、抗CCL20的抗体、抗MIP3alpha的抗体和抗XCL1Lymphotactin的抗体；购自Millipore公司，货号MXH1060，MXH1062，MXH1063，LHSP-1063，HSCR-1032；
[0147] (10)预包被抗体的珠子，购自Millipore公司，货号MXHPMX39，MXHP2PMX23，HSP，HASP-PAI1，MXH3PMX9，HSCRPMX14。
[0148] 实施例4移植肾排斥反应预警试剂盒的显著性差异标记物的筛选
[0149] 1、采集肾移植受者的移植术后多个时间点的血清，并对临床病例进行分析和分组。
[0150] 1.1选取术前基础病或者并发症少，手术未发生严重并发症的移植肾受者，分别在肾移植受者移植术后1天、7天、14天、21天、28天、2个月、3个月...12个月采集全血2ml，室温静置1h后，1000rpm离心10分钟收取上清，分装后-80℃冰箱保存备用。另外随时收取急性排斥反应组患者在急性排斥反应确诊后的血清。
[0151] 1.2根据肾移植患者血清肌酐、尿素氮、移植肾B超、临床表现、穿刺病理诊断结果和激素冲击治疗是否有效等综合分析和病例筛选，将收集病例分为两组：急性排斥反应组和移植肾功能稳定组。急性排斥反应组33例，移植肾功能稳定组38例。
[0152] 1.3急性排斥反应组入组标准：
[0153] ①未发生肾移植外科并发症、感染以及其他严重并发症的肾移植患者。 [0154] ②活检穿刺病理诊断为急性排斥反应的病例
[0155] ③未经活检穿刺的病例根据临床诊断和激素冲击治疗的有效性进行判断：肾移植患者血清肌酐＞120μmol/L，尿素氮＞8.3mmol/L，移植肾B超显示移植肾体积增大、血流减少、血管阻力增加，临床表现为发热，伴乏力关节酸痛、体重增加、血压升高、尿量减少和移植肾胀痛等，穿刺病理诊断结果为急性排斥反应，激素冲击治疗后血清肌酐下降10％以上；
[0156] 1.4移植肾功能稳定组入组标准：
[0157] ①未发生肾移植外科并发症、感染以及其他严重并发症的肾移植患者。 [0158] ②未发生排斥反应
[0159] ③移植肾功能恢复较快(14天内血清肌酐降至正常(＜120μmol/L))
[0160] 2、应用Luminex系统对各组血清中96种细胞因子及趋化因子的表达水平进行检测。
[0161] 2.1选取移植肾功能稳定组病人血清肌酐恢复正常时(肾移植术后7天或14天)的血清样本共38份急性排斥反应组发生排斥反应并确诊后时收取的血清32份
[0162] 2.2应用美国密理博公司(Millipore)Luminex检测试剂盒：MPXHCYTO-60K、MPXHCYP2PMX23、MPXHCYP2-62K、MPXHCYP3-63K、HSCR-32K-PMX14、HSEP-63K-06；共检测96种细胞因子、细胞因子受体以及趋化因子在急性排斥反应组和移植肾功能稳定组病人血清中的表达水平。具体实验过程见各试剂盒说明书。其中，移植肾功能稳定组和急性移植肾排斥反应组在预警系统中各因子在血清中的浓度比较如图6所示，其中0为稳定组，1为排斥组；
[0163] 简要实验过程：应用assay buffer200μl预湿实验板，置于振荡器振摇10分钟后应用负压吸引器吸走实验板孔中的液体，纸巾吸干实验板底后分别加入25μl梯度稀释的标准品、对照和样品，随后每孔加入25μl珠子，封板后将实验板置于振荡器振摇4℃孵育过夜，洗板后加入检测抗体，室温振荡器振摇实验板1h，再加入streptavidin-phycoerythrin标记抗体后孵育30min，洗板后luminex200上机检测，MILLIPLEX Analyst软件分析
[0164] 3、统计学方法筛选出移植排斥反应相关的标志物，联合应用这些标志物群，建立以多因子综合分析为特征的移植肾排斥反应预警体系。
[0165] 应用统计学分析软件SPSS16.0对检测数据进行正态性检验和方差齐性检验后，非正态分布资料应用minitab15.0进行数据转换，经数据转换后为正态分布的应用T检验分析急性排斥反应组和移植肾功能稳定组间表达水平有显著性差异的标记物，未能转换为正态分布的资料经非参分析的方法分析表达水平有显著性差异的标记物。分析后共得到35个有显著性差异的标记物：SCF，sEGFR，sIL-2Rα，sRAGE，sTNFR1，sTNFR2，sVEGFR2，sVCAM1，sFas，CCL 14α-HCC1，sCD40L，Eotaxin，FGF2，Flt3ligand，Fracktalkine，GC SF，GRO，IFNγ，IL-1Rα，IL-3，IL-4，IL-6，IL-12p70，IL-13，IP10，MIP1α，VEGF，BCA-1，IL-16，MIP1d，IL-20，IL-28A，CXCL9MIG，CXCL111TAC，CCL19MIP3β。
[0166] 实施例5移植肾排斥反应预警试剂盒
[0167] 将实施例4得到的35个有显著性差异的标记物进行分析，对这些表达水平有显著性差异的标记物进行logstic回归分析后得到3个因子：IL-1Rα，sCD40L和IL-20组成的移植肾急性排斥反应的预警诊断系统，统计学分析得到预测阳性率为91.4。ROC诊断曲线下面积为97.5％，见附图3。
[0168] 其中，试剂盒的具体组成为：
[0169] (1)96孔滤膜板和两张封板膜；购自Millipore公司，货号MX-PLATE； [0170] (2)所述试剂盒中蛋白抗体的标准品；购自Millipore公司，货号MXH8060，MXH8062，MXH8063，LHSP-8063和HSCR-8032；
[0171] (3)质控对照；购自Millipore公司，货号为：MXH6060，MXH6062，MXH6063，LHSP-6063和HSCR-6032；
[0172] (4)血清基质；购自Millipore公司，货号为：MXHSM，LHSP-SM，HSCR-SM； [0173] (5)实验液；购自Millipore公司，货号L-AB；
[0174] (6)洗液；购自Millipore公司，货号L-WB；
[0175] (7)streptavidin-phycoerythrin标记抗体；购自Millipore公司，货号L-SAPE9，L-SAPE3，L-SAPE10，L-SAPE11，L-SAPE6；
[0176] (8)珠子稀释液；液购自Millipore公司，货号LBD；
[0177] (9)抗IL-1Rα的抗体，抗sCD40L的抗体和抗IL-20的抗体；购自Millipore公司，货号MXH1060，MXH1062，MXH1063，LHSP-1063，HSCR-1032；
[0178] (10)预包被抗体的珠子，购自Millipore公司，货号MXHPMX39，MXHP2PMX23，HSP，HASP-PAI1，MXH3PMX9，HSCRPMX14。
[0179] 实施例6移植肾排斥反应预警试剂盒
[0180] 将实施例4得到的35个有显著性差异的标记物进行分析，对这些表达水平有显著性差异的标记物进行logstic回归分析后得到11个因子：sIL-1R1，sVCAM1，SICAM-1，Fracktalkine，IL-1Rα，IP10，MDC，MIP1α，SDFαβ，TRAIL和SCF组成的移植肾急性排斥反应的预警诊断系统，统计学分析得到预测阳性率为98.6％，ROC诊断曲线下面积为99.8％。，见附图4。
[0181] 其中，试剂盒的具体组成为：
[0182] (1)96孔滤膜板和两张封板膜；购自Millipore公司，货号MX-PLATE； [0183] (2)所述试剂盒中蛋白抗体的标准品；购自Millipore公司，货号MXH8060，MXH8062，MXH8063，LHSP-8063和HSCR-8032；
[0184] (3)质控对照；购自Millipore公司，货号为：MXH6060，MXH6062，MXH6063，LHSP-6063和HSCR-6032；
[0185] (4)血清基质；购自Millipore公司，货号为：MXHSM，LHSP-SM，HSCR-SM； [0186] (5)实验液；购自Millipore公司，货号L-AB；
[0187] (6)洗液；购自Millipore公司，货号L-WB；
[0188] (7)streptavidin-phycoerythrin标记抗体；购自Millipore公司，货号L-SAPE9，L-SAPE3，L-SAPE10，L-SAPE11，L-SAPE6；
[0189] (8)珠子稀释液；液购自Millipore公司，货号LBD；
[0190] (9)抗sIL-1R1的抗体，抗sVCAM1的抗体，抗SICAM-1的抗体，抗Fracktalkine的抗体，抗IL-1Rα的抗体，抗IP10的抗体，抗MDC的抗体，抗MIP1α的抗体，抗SDFαβ的抗体，抗TRAIL的抗体和抗SCF的抗体；购自Millipore公司，货号MXH1060，MXH1062，MXH1063，LHSP-1063，HSCR-1032；
[0191] (10)预包被抗体的珠子，购自Millipore公司，货号MXHPMX39，MXHP2PMX23，HSP，HASP-PAI1，MXH3PMX9，HSCRPMX14。
