一种梅花叶片愈伤组织高效诱导方法

摘要

本发明提供一种梅花叶片愈伤组织诱导方法，其为以真梅系梅花品种胚培养获得的实生苗的幼嫩叶片为外植体，近轴面朝上接入愈伤组织诱导培养基，暗培养2周以上，所述的愈伤组织诱导培养基为MS+蔗糖20～40g/L+2，4-D 0.25～2.00mg/L，pH＝5.8～6.0的固体培养基。本发明中建立了梅花叶片愈伤组织高效诱导的培养体系，该体系的建立，能够高效的诱导愈伤组织，使叶片愈伤组织的诱导率可达90％以上，而且愈伤组织的增殖量大。

权利要求

1.一种梅花叶片愈伤组织诱导方法，其为以真梅系梅花品种胚培养获得的实生苗的幼嫩叶片为外植体，近轴面朝上接入愈伤组织诱导培养基，暗培养2周以上，所述的愈伤组织诱导培养基为MS+蔗糖20~40g/L+2,4-D0.25~2.00mg/L，pH=5.8~6.0的固体培养基；

所述胚培养包括如下步骤：

1）取开花后50~70天未成熟的梅花果实，用0.5~1.5%的高锰酸钾溶液清洗外果皮并浸泡1~2h，之后流水冲洗1~2h；

2）砸碎果实，取出种子，并用流水清洗去掉种皮；

3）将步骤2）去掉种皮的种子用70%的乙醇浸泡20~40s，1%升汞浸泡8~15min，无菌水冲洗至少3次后备用；

4）将步骤3）表面灭菌后的种子保留部分子叶，接种于MS+0.5~1.5mg/L6-BA+0.1~0.3mg/L IBA+蔗糖20~40g/L，pH=5.8~6.0的固体实生苗诱导培养基中，暗培养

1~3周后，进行光照培养，光照强度为2000~3000Lx，光照时间为14h/d。

2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，其中幼嫩叶片在接种前，去掉叶柄，用刀片沿主脉横切2~3刀，保证叶缘处相连。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述幼嫩叶片为实生苗长至6~8片叶片时，从上往下数第3~4片叶片。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固体实生苗诱导培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+蔗糖20~40g/L。

5.根据权利要求1~4任一项所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基为MS+蔗糖20~40g/L+2,4-D0.5~1.5mg/L，pH=5.8~6.0的固体培养基。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基为MS+蔗糖

20~40g/L+2,4-D1.0mg/L，pH=5.8~6.0的固体培养基。

说明书

一种梅花叶片愈伤组织高效诱导方法

技术领域

[0001] 本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种梅花愈伤组织高效诱导的方法。

背景技术

[0002] 梅花(Prunus mume Sieb.Et Zucc.)是中国的传统名花，品种繁多，种质资源丰富。它原产于我国西南地区及长江流域、珠江流域，以川、滇、藏为中心，在我国有7000年以上的应用史和3000年以上的栽培史。引种栽培过程中，培育出了众多优良的园艺新品种，极大地丰富了我国的园林景观。

[0003] 梅花从受粉到果实成熟仅要两三个月左右的时间，果实发育时间短，其果实达到成熟时，胚尚未成熟。种子经过砂藏处理，在正常条件下播种萌发率也很低。胚培养技术可以挽救胚败育和发育不良，缩短休眠期，无需沙藏，极大地提高胚的萌发率及成苗率。潘晓等对‘淡丰后’杏梅品种的胚培养做了初步研究，显著提高了种子的成苗率，但观赏价值高的真梅品种在该研究中未有涉及。

[0004] 愈伤组织一方面可研究植物生长发育及分化的机制、遗传变异规律，对植物遗传育种具有特殊意义；另一方面可用于大规模工厂化生产有用化合物，或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，或用于原生质体培养中的原生质体来源等。实践证明，愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是植物改良，种质保存和有用化合物生产的理想途径。而木本植物外植体污染率比较高，并且木本植物愈伤组织的诱导具有一定的困难。梅花组织培养研究中，通过叶片进行愈伤组织诱导少见报道，高效的愈伤组织诱导体系更是少人问津。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种梅花叶片愈伤组织高效诱导方法。

[0006] 为实现本发明目的，本发明提供了一种梅花叶片愈伤组织诱导方法，其为以真梅系梅花品种胚培养获得的实生苗的幼嫩叶片为外植体，近轴面朝上接入愈伤组织诱导培养基，暗培养2周以上，所述的愈伤组织诱导培养基优选为MS+蔗糖20～40g/L+2，4-D0.25～2.00mg/L，pH＝5.8～6.0的固体培养基，更优选为MS+蔗糖20～40g/L+2，4-D0.5～
1.5mg/L，pH＝5.8～6.0的固体培养基，更优选为MS+蔗糖20～40g/L+2，4-D1.0mg/L，pH＝5.8～6.0的固体培养基。

[0007] 其中，幼嫩叶片在接种前，去掉叶柄，用刀片沿主脉划2～3刀，保证叶缘处相连目的在于使叶片产生更多的伤口，促进愈伤组织的诱导。

[0008] 其中，所述幼嫩叶片优选为实生苗长至6～8片叶片时，从上往下数第3～4片叶片。

[0009] 在本发明一个优选的实施方案中，胚培养包括如下步骤：

[0010] 1)取开花后50～70天未成熟的梅花果实，用0.5～1.5％的高锰酸钾溶液清洗外果皮并浸泡1～2h，之后流水冲洗1～2h；

[0011] 2)砸碎果实，取出种子，并用流水清洗去掉种皮；

[0012] 3)将步骤2)去掉种皮的种子用70％的乙醇浸泡20～40s，1％升汞浸泡8～15min，无菌水冲洗至少3次后备用；

[0013] 4)将步骤3)表面灭菌后的种子保留部分子叶，接种于MS+0.5～1.5mg/L6-BA+0.1～0.3mg/L IBA+蔗糖20～40g/L，pH＝5.8～6.0的固体实生苗诱导培养基中，暗培养1～3周后，进行光照培养，光照强度为2000～3000Lx，光照时间为14h/d。

[0014] 其中，优选的梅花果实为开花后60天未成熟的果实。

[0015] 其中，优选的固体实生苗诱导培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+蔗糖20～40g/L，pH＝5.8～6.0的固体培养基。

[0016] 本发明中建立了梅花叶片愈伤组织高效诱导的培养体系，该体系的建立，能够高效的诱导愈伤组织，使叶片愈伤组织的诱导率达90％以上。此外，本发明建立了梅花胚培养体系，实现无菌苗长期保存。用无菌实生苗的幼嫩叶片为外植体，解决了愈伤组织外植体来源的问题。

附图说明

[0017] 图1所示为梅花胚培养无菌苗植株。

[0018] 图2所示为梅花叶片愈伤组织诱导结果。

具体实施方式

[0019] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0020] 实施例1梅花外植体的采集及消毒

[0021] 春季采集真梅系梅花品种‘淡寒红’果实，清水洗净。配制1％的高锰酸钾溶液置于2L的大烧杯中，浸泡清洗外果皮1h，流水冲洗1h直至水澄清为止。用石制研钵轻砸，去掉果肉，轻砸内果皮，取完整饱满的种子，用清水浸泡去掉种皮，胚培养备用。接种时消毒，用70％酒精浸泡种子30s，1％升汞浸泡10min，无菌水冲洗3次，接种备用。

[0022] 实施例2梅花种子的胚培养

[0023] 将实施例1灭菌过的种子放在无菌滤纸上，吸干种子表面的水；用镊子将子叶分离，用刀片切割带胚的子叶的下半部分，去掉其中的一片子叶以及另一片子叶的1/2，然后将外植体接种于含有40ml培养基的100ml锥形瓶中，每瓶接种3个外植体，培养基配方为MS+0.5-1.5mg/L 6-BA+0.1-0.3mg/L IBA(见表1)，其中添加了浓度30g/L的蔗糖，7g/L的琼脂；将培养瓶置于黑暗条件下，25±3℃培养两周时间，再转入光培养，培养两周。光培养条件为光照强度2000～3000Lx，光照时间14h/d。接种一个月左右即可得到无菌苗。个激素浓度与萌发率结果见表1。

[0024] 表1不同激素组合对胚培养的影响

[0025]

[0026] 注：小写字母表示0.05水平上差异显著；大写字母表示0.01水平上，下同。基本培养基中添加30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂，PH 5.85。

[0027] 实施例3愈伤组织的诱导

[0028] 当实施例2中的无菌苗长至6-8片叶时，取从上往下数的第3-4片叶片，沿中脉1/3处横切2-3刀，保持叶缘连接，接种到MS+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+2，4-D 0～3.0mg/L，pH＝5.85(见表2)；置于温度25±3℃，暗培养条件下，培养两周时间。

[0029] 表2植物激素诱导愈伤组织

[0030]

[0031] 从表3中可以看出，2，4-D 0.25～3.0mg/L的浓度均能诱导出愈伤组织，但当2，4-D浓度超过1.00mg/L时，愈伤组织较易发生褐化、坏死等现象，当2，4-D浓度超过
2.50mg/L时，愈伤组织诱导率降低。综合考虑，2，4-D浓度为0.5～1.50mg/L时，诱导效果较好，最佳的浓度为1.0mg/L。

[0032] 用上述建立的愈伤组织诱导方法试验另外的真梅系梅花品种，如‘粉瓣’、‘双碧垂枝’等，愈伤组织组织诱导率也均在85％以上。

[0033] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。