一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备方法

摘要

一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备方法，将人工合成H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的部分片段和真核表达载体pBI-221连接获得重组质粒，通过基因枪、电转化等转化方法将获得的重组质粒转化入杜氏藻细胞，使血凝素在杜氏藻细胞中表达，制备得到表达病毒蛋白亚单位的工程藻；将制备的工程藻细胞进行开放式扩大培养后，收集藻体，然后经低温干燥、制粒等加工工艺过程，得到一种抗禽流感的功能性饲料添加剂。本发明所制备的饲料添加剂应用于禽类养殖业具有抗禽流感的免疫保护作用，能够提高禽类机体的免疫力和生长速度，并且无任何毒副作用，生物安全性好。

权利要求

1.一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备方法，其特征在于：其具体步骤为：

步骤一、工程藻的制备

（1） H5N1禽流感血凝素基因的制备：根据GenBank中登录的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因序列，人工合成血凝素基因的部分片段，其基因序列如序列表序列1，然后采用PCR的方法对该基因片段进行扩增；PCR的上游引物为p1：5’TCTAGAATGCGCAGCATGTCCATACCATA3’，下游引物为p2：5’GAGCTCAATGTGGATTCTTTGTCTGC 3’， 下划线所指为上下游引物分别引入的Xba I和Sac I酶切位点；PCR 的扩增体系如下：5μl 10×PCR buffer，3μl 浓度为25mmol/L MgCl2，2μl浓度为25mmol/L dNTP，浓度为25μmol/L p1和 p2引物各

2μl，基因模板 2μl，1μl浓度为 5U/μl Taq酶，补加无菌水至终体积50μl；RT-PCR反应参数为：94℃预变性3min，94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸60S，共计30个循环，然后72℃延伸10min，4℃终止反应；

（2）真核表达载体的pBI-HA构建：将鉴定正确的血凝素基因片段进行Xba I和Sac I双酶切，然后采用胶回收试剂盒回收血凝素基因片段片段；将真核载体pBI-221进行Xba I和Sac I双酶切，同样进行胶回收载体片段；然后通过T4连接酶连接血凝素基因片段和真核表达载体pBI-221，将连接体系转化入大肠杆菌感受态，挑选阳性菌落培养后进行质粒的提取，采用Xba I和Sac I进行双酶切鉴定血凝素基因片段是否成功构建入真核表达载体中，得到正确的pBI-HA重组质粒，备用；基因片段和载体片段按照下列体系建立连接反应：3 μl 10× Ligation Buffer，1 μl pBI-221载体，8 μl HA基因片段，1 μl T4 DNA Ligase，补加ddH2O至终体积30 μl；连接体系于16℃水浴放置过夜；

（3）利用电转化法将重组质粒转化杜氏藻细胞：将鉴定正确的重组质粒通过基因枪、电转化等转化方法将重组质粒转化入杜氏藻细胞；通过对转基因细胞的筛选，结合分子生物方法的鉴定，得到表达禽流感病毒亚蛋白单位的工程藻细胞；

步骤二、工程藻的扩大培养

将步骤一制备的表达禽流感病毒亚蛋白单位的工程藻细胞接种到15L玻璃瓶中进行扩大培养，当细胞生长至对数生长期时，按1%的接种量接种于天然海水的藻类养殖场，进6

行规模化的生产培养，培养约10-14天，细胞的浓度增加为10 个/ml；

步骤三、工程藻的收集和加工处理

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当工程藻细胞生长至10 个/ml 时，对藻类细胞进行收集；可以采用静止沉降或离心沉降法，批量的收集藻体；收集后的藻体经过低温干燥、制粒或与其它营养成分混合加工后，得 到一种抗禽流感的功能性饲料添加剂。

说明书

一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及饲料添加剂领域，具体地说是一种具有抗禽流感病毒感染的禽用功能性饲料添加剂的制备方法。

背景技术

[0002] 禽流感疾病是由A型禽流感病毒引起的一种禽类急性高度接触性传染疾病，能够感染多种家禽、野禽和哺乳动物，甚至传播人类。目前，针对禽流感疾病还没有真正有效的治疗方法，针对于感染禽流感动物的处理方法主要是进行扑杀和焚烧，这种处理方式给整个发病地区带来了损失和不便。虽然疫苗接种是对防治禽流感暴发和流行起到了积极的作用，但禽流感病毒变异速度快，造成了免疫失败或效果不理想。且目前市场应用的疫苗以传统疫苗为主，其通过对活病毒的培养和灭活制备而成，其成本高、操作繁琐、对环境存在污染和散毒可能等缺点。

[0003] 在实际生产中，通过疫苗来预防禽流感的发生需要很长的免疫操作时间，比如对万只鸡场进行注射免疫，需要约3天的时间，如果养殖数量更多，操作时间更长。同时，疫苗的生产和使用成本较高，养殖投入资金大，生产成本高。为此，鉴于目前防控禽流感的现状，本发明通过基因工程手段制备了一种表达H5N1亚型禽流感病毒蛋白亚单位的工程藻株。加上藻体本身的诸多优点，将其开发作为一种新型的功能性饲料添加剂。该添加剂不仅能够促进机体的生长、提高机体的体质和改善机体肉质品质等作用外，更重要的是，其具备了抵抗禽流感病毒感染的作用，在禽类养殖业和饲料加工业中有着广阔的应用前景和巨大的市场经济价值。

发明内容

[0004] 本发明针对上述问题提供一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备及其应用，借助于转基因技术，将H5N1亚型禽流感病毒的部分血凝素基因转入杜氏藻细胞，将获得的工程藻细胞收集后，直接作为一种饲料添加剂投喂家禽，对养殖禽类抵抗禽流感的感染起到很好的免疫保护作用。

[0005] 一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备及其应用，其具体步骤为：

[0006] 步骤一、工程藻的制备

[0007] （1）H5N1禽流感血凝素基因的制备：：根据GenBank中登录的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA) 基因序列，人工合成HA基因的部分片段（基因序列如序列表序列1）。然后采用PCR的方法对该基因片段进行扩增。PCR的上游引物为p1：5’TCTAGAATGCGCAGCATGTCCATACCATA3’，下游引物为p2：5’GAGCTCAATGTGGATTCTTTGTCTGC 3’， 下划线所指为上下游引物分别引入的Xba �和Sac �酶切位点；

[0008] （2）真核表达载体的pBI-HA构建：将鉴定正确的HA基因片段进行Xba �和Sac �双酶切，然后采用Axygene公司胶回收试剂盒回收HA基因片段。将真核载体pBI-221进行Xba �和Sac �双酶切，同样进行胶回收载体片段。通过T4连接酶将HA基因片段连接到真核表达载体pBI-221上，将连接体系转化入大肠杆菌感受态。挑起阳性菌落培养后进行质粒的提取，采用Xba �和Sac �进行双酶切鉴定说明HA基因片段是否成功构建入真核表达载体中，得到正确的重组质粒；

[0009] （3）利用电转化法将重组质粒转化杜氏藻细胞：将鉴定正确的重组质粒通过基因枪、电转化等转化方法将重组质粒转化入杜氏藻细胞。通过对转基因细胞的筛选，结合RT-PCR扩增等分子生物方法的鉴定，制备得到表达禽流感病毒亚蛋白单位的工程藻细胞；

[0010] 步骤二、工程藻的扩大培养

[0011] 在实验室条件下，步骤一制备的表达禽流感病毒亚蛋白单位的工程藻细胞接种到15L玻璃瓶中进行扩大培养，当细胞生长至对数生长期时，按1%的接种量接种于天然海水
6
的藻类养殖场，进行规模化的生产培养，培养约10-14天，细胞的浓度可增加为10 个/ml；

[0012] 步棸三、工程藻的收集和加工处理

[0013] 当工程藻细胞生长至106个/ml 时，对藻类细胞进行收集。可以采用静止沉降或离心沉降法，批量的收集藻体。收集后的转基因可经过低温干燥、制粒、粉碎或与其它营养成分混合等加工工艺后，，得到一种抗禽流感的功能性饲料添加剂；

[0014] 步骤四、饲料添加剂在禽类养殖业和饲料加工业中的应用：饲料添加剂应用到禽类饲料中，添加量为0.5-5%，添加形态可以为粉剂、颗粒剂等固体形式、也可以是糊剂、丸剂等半固体形式，也可以是液体形式。通过使用该饲料添加剂，能够明显提高禽类机体的免疫力和改善机体体质，促进禽类机体生长，改善养殖禽类肉、蛋品质。

[0015] 有益效果

[0016] 1、本发明利用了杜氏藻自身的诸多优点作为基础，该藻类细胞是一种天然的保健剂，藻体本身无毒无害，且富含维生素、蛋白质和不饱和脂肪酸等营养物质，具有很高的食用价值和医用价值。同时，该藻类属于光能自养型生物，可直接进行天然开放式大规模培养，培养成本廉价，生产费用低。这就促使该藻类可直接作为饲料或饲料组份应用于禽类的养殖。

[0017] 2、本发明在利用杜氏藻自身优点的基础上，通过基因工程手段将禽流感的HA基因片段引入到该藻细胞，制备得到了表达禽流感病毒亚单位的工程藻，使得此类藻细胞具备了抗禽流感病毒的免疫保护作用。将其作为一种饲料添加剂，不仅能够增强养殖动物的免疫力和促进机体生长外，还能够刺激养殖动物产生免疫保护作用，抵抗禽流感病毒的感染，使用效果更佳。

[0018] 3、本发明所制备的饲料添加剂可采用天然开放式的工厂化养殖，养殖产量高，来源稳定，不受季节性的限制，生产成本低廉。

[0019] 4、本发明制备的饲料添加剂能够在禽类养殖业和饲料加工业中得以广阔的应用，具有无任何毒副残留、无抗药性、绿色环保等特殊优点，消除了因其它疫苗或抗生素之类添加剂对动物产生的潜在威胁，不会对人体带来任何间接的生物安全隐患。

附图说明

[0020] 图1 为H5N1 HA基因片段的PCR扩增结果；

[0021] 图中：最右侧为分子量2000 Marker，左侧为两个重复的PCR样品；

[0022] 图2为重组质粒pBI-HA的Xba �和Sac �双酶切鉴定；

[0023] 图中：左侧为分子量2000 Marker，右侧为质粒pBI-HA的双酶切结果；

[0024] 图3为转化藻株的PKS筛选液体培养基的筛选结果；

[0025] 图中：1. 野生型藻株，未加PPT；2. 野生型藻株，加PPT筛选；3、4、5分别为不同的转化藻株，加PPT筛选；

[0026] 图4为H5N1 HA基因片段在工程藻的RT-PCR扩增鉴定；

[0027] 图中：最右侧为分子量2000 Marker，左侧分别为三株不同的转化株。

具体实施方式

[0028] 本发明所用的基因工程基本操作技术按科学出版2005年出版的《精编分子生物学实验指南（第四版）》中提供的方法进行，或按照所购买试剂、产品的使用说明书进行操作。

[0029] 一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备及其应用，其具体步骤为：

[0030] 步骤一、工程藻的制备

[0031] （1）H5N1禽流感HA基因片段的克隆

[0032] 根据GenBank中登录的H5N1亚型禽流感病毒的HA基因序列，人工合成HA基因片段（基因序列如序列表序列1），以其基因序列设计一对引物，上游引物p1：5’TCTAGAATGCGCAGCATGTCCATACCATA3’，下游引物p2：5’GAGCTCAATGTGGATTCTTTGTCTGC 3’， 下划线所指为上下游引物分别引入的Xba �和Sac �酶切位点；然后以人工合成HA基因片段为模板，通过PCR的方法扩增出H5N1亚型禽流感病毒的HA基因片段； PCR 的扩增体系如下：5μl10×PCR buffer，3μl MgCl2（25mM），2μl dNTP（25mM）, p1和 p2（25μM）引物各2μl，基因模板 2μl，1μl Taq酶（5U/μl），，补加无菌水至终体积50μl。RT-PCR反应参数为：
94℃预变性3min，94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸60S，共计30个循环，然后72℃延伸10min，4℃终止反应。经PCR扩增后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶鉴定，得到了约720bp大小的基因片段（结果如图1所示）。同时，将基因片段寄送上海生工生物有限公司进行测序鉴定。

[0033] （2）真核表达载体的pBI-HA构建

[0034] 将鉴定正确的HA基因片段进行Xba �和Sac �双酶切，然后采用Axygene公司胶回收试剂盒回收HA基因片段。将真核载体pBI-221进行Xba �和Sac �双酶切，同样进行胶回收载体片段。将切好的基因片段和载体片段按照下列体系建立连接反应：3 μl10× Ligation Buffer，1 μl pBI-221载体，8 μl HA基因片段，1 μl T4 DNA Ligase，补加ddH2O至终体积30 μl。连接体系于16℃水浴放置过夜。次日将该体系转化导入大肠杆菌感受态。挑起阳性菌落培养后进行质粒的提取，采用Xba �和Sac �进行双酶切鉴定，结果切出了预期的目的片段（如图2所示），说明HA基因片段成功构建入真核表达载体中。

[0035] （3）利用电转化法将重组质粒转化杜氏藻细胞

[0036] 收集对数生长期的杜氏藻细胞，用2×HEPES电击液（调整细胞浓度为105个/ml。取400μl 调整细胞悬液，加入50μl重组质粒（浓度为0.65μg/μl），混匀后加入到0.2cm电击杯内，于冰浴中静置10min后进行电击。电击参数为：电阻400Ω，电压1.5 kV进行电击；电击完毕后置于冰浴中静置5min，然后弃去电击液，用50ml新鲜配置的PKS筛选培养基悬浮即完成转化操作。将转化的细胞正常光照培养7天(光:暗比为12:12)。以上转化操作设有三组重复，同时设有阴性对照，即野生型细胞不加质粒进行转化，其余过程均一样。培养结果如图3所示，转化藻细胞生长良好，而阴性对照组细胞全部死亡。

[0037] （4）工程藻的RT-PCR分子鉴定

[0038] 对培养的工程藻进行2000rpm离心5min，收集藻体。采用Trizol试剂提取盐藻基因组RNA，提取过程参照其试剂说明书进行。以盐藻总RNA作为模板，进行目的基因的RT-PCR扩增，反应体系和条件同上述步骤（1）中RT-PCR反应。将PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图4所示，得到了特异性的HA基因片段条带，说明HA基因片段已经整合到宿主细胞基因组中，并且得到了转录水平的表达。

[0039] 步骤二、工程藻的扩大培养

[0040] 在实验室条件下，将工程藻细胞在15L玻璃瓶中进行扩大培养，培养约10-14天，6
细胞生长至对数生长期，细胞的浓度可增加为10 个/ml，即得到藻种；

[0041] 步骤三、工程藻的养殖和收集

[0042] 将海水以NaClO3消毒后引入养殖池，向养殖池中按1%的接种量接种藻种，在天然开放式模式下养殖。养殖时间为10-14天，中间向养殖池中补加2 mmol/L硝酸盐、2 mmol/L柠檬酸铁和0.2mmol/L NaHCO3等营养成分，不断的检测细胞浓度。在培养过程中，使用增6
氧泵或水体搅拌装置对水体进行流动处理，以增加藻细胞的生长。当藻细胞浓度达到10 个/ml时，方可收集藻细胞。通过向养殖的海水池中加入等体积的淡水，关闭一切搅拌设备，促使藻细胞静止沉淀，收集藻体。

[0043] 步骤四、 饲料添加剂的制备

[0044] （1）将饲料添加剂制备成液体形态

[0045] 取收集的工程藻体，加入少量的养殖用水，可直接灌装成袋，或通过超声波快速破碎后，收集分装成瓶，低温保存。在使用时，直接将其按1%的比例均匀的掺入动物饲料中去；亦可按5%的比例加入到养殖动物的饮用水中，混合均匀后通过口服方式作用于机体；

[0046] （2）将饲料添加剂制备成半固体形态

[0047] 取收集的工程藻体，含有少量的养殖用水，可与明胶等粘性剂按照1:1的比例混合，制成糊剂流体形式；亦可与其它一些饲料组份：如维生素、抗氧化剂、蛋白粉、药物成份等混合后制成半固体形式，分装低温保存。在使用时，直接将其按0.5%的比例均匀的掺入动物饲料中去；

[0048] （3）将饲料添加剂制备成固体形态

[0049] 取收集的工程藻体，不含养殖用水，通过低温干燥制成粉末状，或通过制粒机进而制成颗粒状等固体形式，分装低温保存。在使用时，直接将其按1%的比例均匀的掺入动物饲料中去；

[0050] 步骤五、 饲料添加剂在禽类养殖业和饲料加工业中的应用

[0051] （1）饲料添加剂通过口服方式对机体的抗病毒的免疫保护作用[0052] 对工程盐细胞和未转化的野生藻细胞分别进行收集，在低温条件下制成颗粒状，按占饲料5%的比例添加到饲料中去，混匀后投喂实验动物，现配现用，控制在2h内食用完。按照正常饲喂标准进行，每天投喂三次，连续投喂10天。选用40日龄的家鸡300只作为实验对象，随即分成A、B、C三组，每组100只。A组为空白组，即对鸭投喂的是普通饲料，没有加入藻体；B组为阴性组，即对鸡投喂的是含5%的野生型藻体饲料；C组是比较组，即对鸡投喂含5%的工程藻体饲料。所用组别在连续投喂10天后，采用滴鼻方法对鸡给予禽流感病毒感染实验，禽流感病毒接种后，连续投喂1周时间，每天记录鸡发病情况。实验结果表明（如表1所示）：空白组和阴性组的累计死亡率达到100%，而治疗组没有鸡出现死亡，表明该饲料添加剂具有很好的免疫保护作用，有效保护率为100%。

[0053] 治疗组保护率的计算方法：保护率=（1-治疗组死亡数/治疗组动物总数）*100%[0054] 空白对照组死亡率的计算方法：死亡率=（空白对照组死亡数/空白对照组动物总数）*100%

[0055] 阴性对照组鸡死亡率的计算方法：死亡率=（阴性对照组死亡数/阴性对照组动物总数）*100%

[0056] 表1 饲料添加剂通过口服方式对鸡体的免疫保护作用

[0057]

[0058] （2）饲料添加剂对养殖机体的免疫调节和生长促进作用

[0059] 取收集的工程藻细胞，将其与其它饲料组份（如蛋白粉）进行1:1混合后，按占饲料的2%量添加到养殖饲料中，混匀后投喂。每天投喂三次，连续投喂30天。饲养结果表明，使用该饲料添加剂的养殖动物，其生长速度较快，体重增加，羽色明显鲜艳、自然亮泽，肉质细嫩，口感好。

[0060] 本发明中所述的杜氏藻为生物企业普遍使用的杜氏藻，不限定特定藻株，可通过购买得到；

[0061] 所述的大肠杆菌感受态为普通大肠杆菌感受态，通过市场购买能得到；

[0062] 所述的pBI-221载体购置于美国Promega公司；

[0063] 所述的限制性内切酶Xba �和Sac �购置于大连宝生物有限公司；

[0064] 所述的胶回收试剂盒购置于Axygene公司；

[0065] 所述的Trizol试剂购置于美国Invitrogen公司；

[0066] 所述的特异性引物以及HA基因片段的合成由上海生工生物有限公司定做；

[0067] 所述的2×HEPES电击液的组成分为：每升2×HEPES电击液中含有500 mmol氯化钠，5 mmol氯化钾, 5 mmol氯化钙，20 mmol Hepes，200 mmol 甘露醇, 200 mmol山梨糖醇，余量为水，pH值为7.2；

[0068] 所述的PKS培养基的组成成份：每升PKS培养基中含有1.5 mol 氯化钠, 10 m mol硝酸钾, 50 m mol碳酸氢钠, 5 m mol 七水硫酸镁, 0.4 mmol磷酸二氢钾, 2 µmol 六水三氯化铁, 5 µmol乙二胺四乙酸, 7 µmol四水二氯化锰, 1 µmol二水氯化铜, 1 µmol氯化锌, 1 µmol六水氯化钴, 1 µmol四水钼酸铵, 185 µmol 硼酸, 0.2 mmol氯化钙,余量为水。