环氧二烯作为破骨细胞分化抑制剂的应用

摘要

环氧二烯作为破骨细胞分化抑制剂的应用，涉及一种环氧二烯化合物。提供环氧二烯作为破骨细胞分化抑制剂在制备治疗骨质疏松症药物的应用，特别是作为治疗雌激素缺乏引起的骨质疏松症药物的应用。该化合物可从真菌发酵产物中分离获得，也可采用化学合成。经药理实验证实环氧二烯能抑制核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导的破骨细胞的分化，并通过抑制破骨细胞关键整合因子活化T细胞核因子c1(NFATc1)的表达来抑制抗酒石酸性酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K(Cathepsin K)和降钙素受体(Calcitonin Receptor)等破骨细胞分化特征基因的表达。

权利要求

1.环氧二烯在制备治疗骨质疏松症药物的应用，所述环氧二烯的化学结构式如下：环氧二烯的化学式为C16H18O5，分子量为290.12；

所述骨质疏松症药物是雌激素缺乏引起的骨质疏松症药物。

说明书

环氧二烯作为破骨细胞分化抑制剂的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种环氧二烯化合物，尤其是涉及一种环氧二烯作为破骨细胞分化抑制剂的应用。

背景技术

[0002] 骨质疏松症是以低骨量和骨组织微结构退化为特征，使得骨脆性增加而易于发生骨折的一种全身性骨骼结构退化疾病，包括原发性和继发性骨质疏松症。典型的骨质疏松症的骨特点是，皮质骨薄，空隙增加，骨小梁稀疏，排列杂乱。引起骨质疏松症的因素包括内分泌因素、营养因素、物理因素、免疫因素、遗传因素等。其中女性绝经后骨质疏松症主要由于雌激素缺乏导致松质骨骨量减少，加速骨重建，并引起骨骼结构脆化导致。因此，目前常用的骨质疏松症研究模型是小鼠卵巢切除模型，小鼠卵巢切除后雌激素降低而引起骨质疏松。

[0003] 多年来，雌激素是食品和药品管理局推荐的预防和治疗骨质疏松症的唯一药物，但是雌激素替代疗法容易产生耐受并且具有较高副作用，可提高患中风和心肌梗死的风险。因此，需要进一步寻找有效抑制骨质疏松症的药物，为以后开发低副作用的治疗骨质疏松症药物提供新的思路。化合物环氧二烯最早见于1999年的报道(Cai et al.，Tetrahedron Letters，1999，40，1479-1482)，它从一株稀有真菌OS-F66617发酵液中分离得到，但文献未报道其具有治疗骨质疏松症生理活性。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供环氧二烯作为破骨细胞分化抑制剂在制备治疗骨质疏松症药物的应用，特别是作为治疗雌激素缺乏引起的骨质疏松症药物的应用。

[0005] 本发明所述环氧二烯的化学结构式如下：

[0006]

[0007] 环氧二烯的化学式为C16H18O5，分子量为290.12。

[0008] 本发明所述环氧二烯为化合物，可以来源于真菌发酵产物或化学合成。

[0009] 经药理实验证实环氧二烯能在体内、外有效地抑制破骨细胞分化和骨量的丢失，本发明所述环氧二烯可作为破骨细胞分化抑制剂，并在制备治疗骨质疏松症药物的应用，特别是作为治疗雌激素缺乏引起的骨质疏松症药物的应用。

[0010] 所述破骨细胞分化包括核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导的破骨细胞分化，抗酒石酸性酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K(Cathepsin K)和降钙素受体(Calcitonin Receptor)等破骨细胞分化特征基因以及破骨细胞关键整合因子活化T细胞核因子c1(NFATc1)。

附图说明

[0011] 图1为MTT法检测MED对小鼠C57/BL6骨髓来源的巨噬细胞的细胞毒性。在图1中，横坐标为MED的浓度梯度(μmol/L)，纵坐标为560nm处的相对吸光度值OD560；MTT法实验结果表明，MED在浓度范围(0.5～10μmol/L)之间对小鼠C57/BL6骨髓来源的巨噬细胞不具有细胞毒性。

[0012] 图2为TRAP染色技术检测MED对破骨细胞分化的影响。在图2中，从左至右依次为Control，RANKL，R+MED(1μmol/L)，R+MED(2.5μmol/L)，R+MED(5μmol/L)；结果显示，MED在2.5、5μmol/L浓度下对RANKL诱导小鼠C57/BL6骨髓来源的巨噬细胞分化成破骨细胞具有抑制作用；以DMSO为空白对照组。

[0013] 图3为细胞计数检测MED对破骨细胞分化的影响。在图3中，横坐标为MED的浓度梯度(μmol/L)，纵坐标为相对破骨细胞数量；通过对TRAP染色图进行细胞计数显示，MED在2.5、5μmol/L浓度下对RANKL诱导小鼠C57/BL6骨髓来源的巨噬细胞分化成破骨细胞的数量具有明显地抑制作用；以DMSO为空白对照组，其他浓度组分别与DMSO组进行t检验；*表示p＜0.05，**表示p＜0.01。

[0014] 图4为TRAP染色技术检测MED在5μmol/L浓度下对破骨细胞分化形成阶段的影响。在图4中，从左至右依次为RANKL，0h，24h，68h，72h；结果显示，MED与RANKL同时刺激小鼠C57/BL6骨髓来源的巨噬细胞时可抑制破骨细胞分化，其他时间点无抑制作用；以DMSO为空白对照组。

[0015] 图5为细胞计数检测MED对破骨细胞分化形成阶段的影响。在图5中，横坐标为MED的加入时间(h)，纵坐标为相对破骨细胞数量；通过对TRAP染色图进行细胞计数显示，MED与RANKL同时刺激小鼠C57/BL6骨髓来源的巨噬细胞时可明显地抑制破骨细胞的数量，其他时间点无抑制作用。以DMSO为空白对照组，其他时间组分别与DMSO组进行t检验；**表示p＜0.01。

[0016] 图6为实时荧光定量PCR技术检测MED对TRAP基因mRNA表达的影响。MED在5μmol/L浓度下对RANKL诱导的TRAP基因mRNA表达具有显著的抑制作用。横坐标为组别，纵坐标为TRAP基因mRNA相对表达量。以DMSO为空白对照组，其他组分别与DMSO组进行t检验；*表示p＜0.05。

[0017] 图7为实时荧光定量PCR技术检测MED对Cathepsin K基因mRNA表达的影响。MED在5μmol/L浓度下对RANKL诱导的Cathepsin K基因mRNA表达具有显著的抑制作用。
横坐标为组别，纵坐标为Cathepsin K基因mRNA相对表达量。以DMSO为空白对照组，其他组分别与DMSO组进行t检验；**表示p＜0.01。

[0018] 图8为实时荧光定量PCR技术检测MED对Calcitonin Receptor基因mRNA表达的影响。MED在5μmol/L浓度下对RANKL诱导的Calcitonin Receptor基因mRNA表达具有显著的抑制作用。在图8中，横坐标为组别，纵坐标为Calcitonin Receptor基因mRNA相对表达量。以DMSO为空白对照组，其他组分别与DMSO组进行t检验；**表示p＜0.01。

[0019] 图9为Western Blotting技术检测MED对NFATc1表达的影响。图中时间为RANKL刺激的时间，GAPDH为内参。MED在5μmol/L浓度下对RANKL诱导的NFATc1表达具有抑制作用。

[0020] 图10为微计算机断层扫描技术检测MED对卵巢切除后引起的小鼠骨量丢失的影响。横坐标为组别，纵坐标为平均骨密度。结果显示，4mg/kg/d和8mg/kg/d剂量的MED可抑制卵巢切除后引起的小鼠骨量的丢失。

[0021] 图11为微计算机断层扫描技术图。结果显示，4mg/kg/d和8mg/kg/d剂量的MED可抑制卵巢切除后引起的小鼠松质骨的丢失。

具体实施方式

[0022] 下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步阐述。

[0023] 实施例1、环氧二烯细胞毒性实验

[0024] 采用MTT法检测环氧二烯的细胞毒性

[0025] 试验方法如下：

[0026] 小鼠C57/BL6骨髓来源的巨噬细胞(7×103细胞/孔)接入96孔培养板培养过夜，次日，加入不同浓度的MED(0.5、1、5、10μmol/L)作用72h，然后加入MTT至终浓度0.5mg/ml作用4h，按100μl/孔加入溶解液(10％SDS，0.01mol/L HCL)过夜后测定560nm处的吸光度值(OD560)。

[0027] MTT实验方法可反映细胞的生长情况，因此通过比较OD560值来判断MED是否对骨髓来源的巨噬细胞存在细胞毒性。

[0028] 试验结果如下：

[0029] MTT法检测结果见图1。试验结果表明，环氧二烯在0.5～10μmol/L浓度范围内对骨髓来源性巨噬细胞不存在细胞毒性。

[0030] 实施例2、环氧二烯在抑制破骨细胞分化过程中的作用

[0031] 本发明通过抗酒石酸性酸性磷酸酶(TRAP)染色实验技术检测MED在破骨细胞分化过程中的作用。

[0032] 试验方法如下：

[0033] 1)MED浓度梯度：

[0034] 将小鼠C57/BL6骨髓来源的巨噬细胞(2×104细胞/孔)接入48孔培养板，培养过夜后加入RANKL至终浓度为50ng/mL，同时加入不同浓度的MED(1、2.5、5μmol/L)，刺激96h后观察观察MED对破骨细胞分化的影响。

[0035] 2)MED作用时间：

[0036] 将小鼠C57/BL6骨髓来源的巨噬细胞(2×104细胞/孔)接入48孔培养板，培养过夜后加入RANKL至终浓度为50ng/ml，RANKL刺激不同时间(0，24，48，72h)后加入5μmol/LMED，刺激96h后观察MED加入不同时期对破骨细胞分化的影响。

[0037] 试验结果如下：

[0038] 实施例2的试验结果见图2～5。试验结果表明，MED在浓度为2.5和5μmol/L时对破骨细胞分化具有明显的抑制作用。当RANKL刺激24h后再加入环氧乙烯，环氧乙烯失去抑制破骨细胞分化的作用。证明环氧二烯作用时间在破骨细胞分化的早期。

[0039] 实施例3、环氧二烯抑制破骨细胞特征基因mRNA表达水平

[0040] 试验方法如下：

[0041] 将小鼠C57/BL6骨髓来源的巨噬细胞(2×105细胞/孔)接入6孔培养板，培养过夜后加入RANKL至终浓度为50ng/mL，同时分别加入MED(5μmol/L，用DMSO作为空白对照)刺激96h后，提取细胞RNA，通过实时荧光定量PCR技术检测抗酒石酸性酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K(Cathepsin K)和降钙素受体(Calcitonin Receptor)等破骨细胞分化特征基因mRNA表达水平。

[0042] 试验结果如下：

[0043] 实施例3的试验结果见图6～8。试验结果表明，MED在5μmol/L浓度下可以抑制破骨细胞TRAP、Cathepsin K、Calcitonin Receptor等破骨细胞分化特征基因mRNA表达水平。

[0044] 实施例4、环氧二烯抑制破骨细胞关键整合因子活化T细胞核因子c1(NFATc1)的表达

[0045] 试验方法如下：

[0046] 将小鼠C57/BL6骨髓来源的巨噬细胞(2×105细胞/孔)接入6孔培养板，培养过夜后加入RANKL至终浓度为50ng/mL，同时分别加入MED(5μmol/L，用DMSO作为空白对照)，刺激不同的时间点后收集蛋白样品，通过Western Blotting技术检测NFATc1的表达。

[0047] 试验结果如下：

[0048] 实施例4的试验结果见图9。试验结果表明，MED在5μmol/L浓度下可以抑制破骨细胞关键整合因子活化T细胞核因子c1(NFATc1)的表达。

[0049] 实施例5、环氧二烯在抑制小鼠卵巢切除引起的骨质疏松症中的应用[0050] 本实验用C57BL/6小鼠作为实验对象，研究MED在小鼠卵巢切除后引发的骨质疏松症中的治疗效果。

[0051] 试验方法如下：

[0052] 采用20只SPF级C57BL/6小鼠进行实验，随即将其中15只小鼠实施卵巢切除手术作为卵巢切除组，其余5只小鼠实施假手术作为阴性对照组。小鼠手术后愈合两个星期。然后随机将卵巢切除组分为三组(每组5只小鼠)：第一组按4mg/kg/d剂量腹腔隔天注射MED；第二组按8mg/kg/d剂量腹腔隔天注射MED；第三组腹腔隔天注射同等体积的DMSO。
MED治疗周期为两个月。

[0053] 试验结果如下：

[0054] 实施例5的试验结果见图10～11。试验结果表明，环氧二烯可有效抑制小鼠卵巢切除后引起的骨质疏松症。