一种金樱根的检测方法

摘要

本发明涉及一种金樱根的质量控制方法，该方法为控制金樱根中野蔷薇苷(C36H58O10)的质量含量不得少于0.15％，和/或蔷薇苷(C36H58O10)的质量含量不得少于0.15％。该方法为采用HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量。本发明所提供的金樱根的质量控制方法引入了野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量测定，从而使金樱根的质量控制指标更加全面；本发明首次将HPLC-ELSD法用于野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量测定，该方法精密度、重现性、稳定性好。

权利要求

1.一种金樱根的检测方法，其特征在于，该方法为采用HPLC-ELSD法测定金樱根中野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量；其步骤包括：色谱条件与系统适用性试验、对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、含量的测定；其中：所述色谱条件与系统适用性试验为用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水为流动相；用蒸发光散射检测器检测或使用紫外检测器检测；理论板数按野蔷薇苷峰计算不低于2000；所述甲醇-水中甲醇与水的体积比为56:44；使用紫外检测器检测时检测波长为

210nm；

所述对照品溶液的制备为分别取野蔷薇苷与蔷薇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，即得；所述野蔷薇苷与蔷薇苷对照品采用如下方法自制：将金樱根的根茎，粉碎，用提取溶剂提取后，将提取液减压浓缩，进行溶剂萃取或上大孔树脂吸附，并依次用水、30％、40～90％乙醇洗脱，收集40～90％乙醇洗脱物，回收溶剂，再将萃取物或洗脱物经过柱层析分离，或将提取液浓缩至干后，直接经过柱层析分离；将含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分再次经过硅胶柱层析分离，收集含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分，得野蔷薇苷和蔷薇苷粗晶，再加入重结晶试剂反复重结晶即得；

所述供试品溶液的制备为取过三号筛的本品粉末2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50ml，称定重量，在功率250W、频率40kHz的条件下超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加0.05mol/L氢氧化钠溶液20ml，使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次

15ml，合并正丁醇提取液，用水40ml洗涤1次，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得；

所述含量的测定为分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl与供试品溶液10～20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算野蔷薇苷、蔷薇苷的含量，即得；本品按干燥品计算，含野蔷薇苷（C36H58O10）与蔷薇苷（C36H58O10）分别不少于0.15%。

说明书

一种金樱根的检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于中药材的质量控制领域，尤其中药材金樱根的质量控制方法。 [0002] 背景技术

[0003] 金樱根别名金樱蔃、脱骨丹等，为双子叶蔷薇科植物金樱子Rosa laevigata Michx.的根，主产于广东、广西、湖南、江西、浙江、江苏、安徽等地，均为野生，其性味酸涩平，有固精涩肠的作用，可用于治疗子宫脱垂、细菌性痢疾、小儿脱肛等症，近年来金樱根受到较广泛的应用，如金鸡片、金鸡胶囊、广东凉茶、三金片、妇科千金片、快应茶、金鸡颗粒、三金颗粒、广东凉茶颗粒等，但金樱根在临床上应用较混乱，如有其茎入药的。为了制定金樱根的质量标准、为其临床应用及开发提供科学依据，田素英等提供了一种金樱根的生药学研究【田素英等.金樱根的生药学研究.中国药房，2009,20（36）：2853-2855】，分别从原植物、性状、显微、理化鉴别等方面对金樱根进行生药学研究，结8果表明金樱根在原植物来源、性状、显微、理化等方面具有专属性的特征，为金樱根的临床应用及开发提供了科学依据。

[0004] 本发明人经系统的分离研究发现，野蔷薇苷与蔷薇苷为金樱根的特征性活性成分，故增加野蔷薇苷与蔷薇苷为控制本品质量的指标成分是十分必要的。本发明在原有质量标准的基础上增加了HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷与蔷薇苷的含量，使金樱根的质量控制指标更加全面。

[0005] 发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种金樱根的质量控制方法，该方法精密度、稳定性、重现性良好，使金樱根的质量控制指标更加全面。

[0007] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 一种金樱根的质量控制方法，其中，所述质量控制方法为控制金樱根中野蔷薇苷（C36H58O10）的质量含量不得少于0.15%，和/或蔷薇苷（C36H58O10）的质量含量不得少于0.15%。 [0009] 本发明人经系统的分离研究发现，野蔷薇苷与蔷薇苷为金樱根的特征性活性成分，故增加野蔷薇苷与蔷薇苷为控制金樱根质量的指标成分是十分必要的。本发明首次引入野蔷薇苷和/或蔷薇苷的质量含量，从而使金樱根的质量控制指标更加全面。

[0010] 根据前述的质量控制方法，其中，该方法为采用HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量。

[0011] 本发明首次将HPLC-ELSD法用于野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量测定，该方法精密度、重现性、稳定性好，ELSD法是针对无紫外吸收化合物进行有效测定的较好方法。 [0012] 根据前述的质量控制方法，其中，所述采用HPLC-ELSD法测定野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量的步骤包括：色谱条件与系统适用性试验、对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、含量的测定。

[0013] 根据前述的质量控制方法，其中，所述色谱条件与系统适用性试验为用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水为流动相；用蒸发光散射检测器检测或使用紫外检测器检测；理论板数按野蔷薇苷峰计算应不低于2000。

[0014] 根据前述的质量控制方法，其中，所述甲醇-水中甲醇与水的体积比为56∶44。 [0015] 根据前述的质量控制方法，其中，所述对照品溶液的制备为分别取野蔷薇苷与蔷薇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，即得。

[0016] 根据前述的质量控制方法，其中，所述野蔷薇苷与蔷薇苷对照品采用如下方法自制：将金樱根的根茎，粉碎，用提取溶剂提取后，将提取液减压浓缩，进行溶剂萃取或上大孔树脂吸附，并依次用水、30％、40～90％乙醇洗脱，收集40～90％乙醇洗脱物，回收溶剂，再将萃取物或洗脱物经过柱层析分离，或将提取液浓缩至干后，直接经过柱层析分离；将含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分再次经过硅胶柱层析分离，收集含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分，得野蔷薇苷和蔷薇苷粗晶，再加入重结晶试剂反复重结晶即得。

[0017] 根据前述的质量控制方法，其中，所述供试品溶液的制备为取过三号筛的本品粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，称定重量，在功率250W、频率40kHz的条件下超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加0.05mol/L氢氧化钠溶液20ml，使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用水40ml洗涤1次，取正丁醇液，减压回收溶 剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

[0018] 根据前述的质量控制方法，其中，所述含量的测定为分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl与供试品溶液10～20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算野蔷薇苷、蔷薇苷的含量，即得；本品按干燥品计算，含野蔷薇苷(C36H58O10)与蔷薇苷(C36H58O10)分别不得少于0.15％。

[0019] 本发明所提供的金樱根的质量控制方法具有如下优点：

[0020] (1)本发明所提供的金樱根的质量控制方法引入了野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量测定，从而使金樱根的质量控制指标更加全面；

[0021] (2)本发明所提供的金樱根的质量控制方法首次将HPLC-ELSD法用于野蔷薇苷和/或蔷薇苷的含量测定，该方法精密度、重现性、稳定性好。

附图说明

[0022] 图1为野蔷薇苷对照品线性回归方程，其中回归方程为：y＝0.7282x-8.5342，r＝0.9996；

[0023] 图2为蔷薇苷对照品线性回归方程，其回归方程为：y＝0.7342x-8.5782，r＝0.9997；

[0024] 图3为金樱子(广西柳州)色谱图；

[0025] 图4为金樱子(广西忻城)色谱图；

[0026] 图5为金樱子(湖南株洲)色谱图；

[0027] 图6为金樱子(江西余江)色谱图；

[0028] 图7为金樱子(贵州安顺)液相色谱图(ELSD)；

[0029] 图8为金樱子(江西樟树)液相色谱图(ELSD)；

[0030] 图9为粉团蔷薇(广西永福)液相色谱图(ELSD)；

[0031] 图10为小果蔷薇(广西来宾)液相色谱图(ELSD)；

[0032] 图11为小果蔷薇(广西永福)液相色谱图(ELSD)；

[0033] 图12为小果蔷薇(湖南株洲)液相色谱图(ELSD)；

[0034] 图13为小果蔷薇(湖北恩施)液相色谱图(ELSD)；

[0035] 图14为野蔷薇苷与蔷薇苷对照谱图(野蔷薇苷Rt＝19.6，蔷薇苷Rt＝15.9)(ELSD)；

[0036] 图15为金樱子(广西柳州)液相色谱图(UV)；

[0037] 图16为金樱子(广西忻城)液相色谱图(UV)；

[0038] 图17为金樱子(湖南株洲)液相色谱图(UV)；

[0039] 图18为金樱子(江西余江)液相色谱图(UV)；

[0040] 图19为金樱子(贵州安顺)液相色谱图(UV)；

[0041] 图20为金樱子(江西樟树)液相色谱图(UV)；

[0042] 图21为粉团蔷薇(广西永福)液相色谱图(UV)；

[0043] 图22为小果蔷薇(广西来宾)液相色谱图(UV)；

[0044] 图23为小果蔷薇(广西永福)液相色谱图(UV)；

[0045] 图24为小果蔷薇(湖南株洲)液相色谱图(UV)；

[0046] 图25为小果蔷薇(湖北恩施)液相色谱图(UV)；

[0047] 图26为野蔷薇苷与蔷薇苷对照谱图(野蔷薇苷Rt＝19.6，蔷薇苷Rt＝15.9)(UV)。

具体实施方式

[0048] 以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。

[0049] 【实施例1】

[0050] 野蔷薇苷和蔷薇苷的【含量测定】为新增的检测项目。

[0051] 本发明人经系统的分离研究发现，野蔷薇苷与蔷薇苷为金樱根的特征性活性成分，故增加野蔷薇苷与蔷薇苷为控制本品质量的指标成分是十分必要的，此方法使金樱根的质量控制指标更加全面。

[0052] 1、仪器与试剂

[0053] 仪器：Waters 2695高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器(Alltech-ELSD2000)，(Waters996紫外检测器)，Empower色谱工作站。

[0054] 试剂：甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

[0055] 对照品：自制，因《中国药典》未收载野蔷薇苷与蔷薇苷化学对照品，故我们对野蔷薇苷与蔷薇苷进行了分离制备，并按《中药新药质量标准研究用对照品研究技术要求》进行了结构确证和纯度检查，在选定的色谱条件下测定，按归一化法计算含量为98.5％，结果表明所制备的野蔷薇苷和蔷薇苷化学对照品符合含量测定用对照品要求。

[0056] 野蔷薇苷与蔷薇苷对照品采用如下方法自制：将金樱根的根茎，粉碎，用提取溶剂提取后，将提取液减压浓缩，进行溶剂萃取或上大孔树脂吸附，并依次用 水、30％、40～90％乙醇洗脱，收集40～90％乙醇洗脱物，回收溶剂，再将萃取物或洗脱物经过柱层析分离，或将提取液浓缩至干后，直接经过柱层析分离；将含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分再次经过硅胶柱层析分离，收集含有野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分，得野蔷薇苷和蔷薇苷粗晶，再加入重结晶试剂反复重结晶即得。

[0057] 具体地说采用如下方法自制：取新鲜金樱根根茎10Kg，粉碎，用60％乙醇回流提取2次，每次2小时，滤过，浓缩得浸膏。浸膏加蒸馏水1000mL使均匀分散，加同样体积乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯，浓缩回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏。乙酸乙酯浸膏用硅胶柱层析粗分离，以氯仿/甲醇(10∶0～0∶10)梯度洗脱，每个梯度洗脱3000mL，TLC检测合并相同部分，得到9个主要部分。其中富含野蔷薇苷和蔷薇苷的馏分，以氯仿/甲醇(10∶1)为洗脱剂进行硅胶柱层析，收集富含野蔷薇苷的馏分，在体积比为10∶1的氯仿/甲醇混合溶液中重结晶，得白色不定型固体，即野蔷薇苷；收集富含蔷薇苷的馏分，以55％甲醇为洗脱剂反复进行中压反相柱层析，在体积比为10∶1的氯仿/甲醇混合溶液中重结晶，得白色不定型固体，即蔷薇苷。

[0058] 2、色谱条件的选择

[0059] 色谱柱：Phenomenex C18(250×4.6mm，5μm)；

[0060] 流动相：甲醇-水(56∶44)；流速：0.8ml/min；

[0061] 漂移管温度：90℃；气体流速：2.4L/min；

[0062] 在流动相选择中，试验了不同比例的甲醇-水系统的分离效果，结果以甲醇-水(56∶44)为最佳，保留时间适宜，分离效果能满足要求。

[0063] 在选定的条件下，三批供试品的野蔷薇苷与蔷薇苷色谱峰的分离度、理论板数的结果见表1。

[0064] 表1、野蔷薇苷与蔷薇苷理论板数和分离度的结果

[0065]供试品 野蔷薇苷理论板数 蔷薇苷理论板数 分离度
金樱根(金樱子、广西柳州) 2528 2615 1.596
金樱根(金樱子、广西忻城) 3536 3632 1.538
金樱根(金樱子、湖南株洲) 2433 2458 1.572

[0066] 野蔷薇苷与左侧蔷薇苷峰分离度：R1＝2(tR-tR1)/(W+W1)

[0067] tR-为相邻两峰中后一峰的保留时间

[0068] tR1-为相邻两峰中前一峰的保留时间

[0069] W、W1此相邻两峰的峰宽

[0070] 根据试验结果，考虑到仪器、色谱柱、流动相的配制和温度等系统因素的影响，规定理论板数按野蔷薇苷峰计算，应不低于2000。

[0071] 3、线性范围的考察

[0072] 对照品溶液的制备：取经105℃干燥至恒重的野蔷薇苷与蔷薇苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液(野蔷薇苷实取10.32mg，蔷薇苷实取10.61mg，定容至10ml，即分别为1.032mg/ml、1.061mg/ml)，即得。

[0073] 测定：分别精密吸取混合对照品溶液溶液1μl、2μl、4μl、8μl、10μl注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积的自然对数为横坐标，以进样量的自然对数为纵坐标，回归计算，得线性方程，测定结果见表2，表3。

[0074] 表2、野蔷薇苷对照品线性考察结果

[0075]序号 进样量μg 峰面积 进样量取对数 峰面积取对数
1 1.032 126931 0.0315 11.75
2 2.064 346441 0.7246 12.76
3 4.128 834045 1.418 13.63
4 8.256 2182760 2.111 14.60
5 10.32 3119725 2.334 14.95

[0076] 其回归方程为：y＝0.7282x-8.5342，r＝0.9996。

[0077] 以上结果表明，在进样量1.032～10.32μg范围内，野蔷薇苷峰面积的自然对数与进样量的自然对数有良好的线性关系。

[0078] 表3、蔷薇苷对照品线性考察结果

[0079]序号 进样量μg 峰面积 进样量取对数 峰面积取对数
1 1.061 123767 0.05921 11.73
2 2.122 347752 0.7524 12.76
3 4.244 848650 1.446 13.65
4 8.488 2177280 2.139 14.59
5 10.61 2922124 2.362 14.89

[0080] 其回归方程为：y＝0.7342x-8.5782，r＝0.9997。

[0081] 以上结果表明，在进样量1.061～10.61μg范围内，蔷薇苷峰的自然对数与进样量的自然对数有良好的线性关系。

[0082] 4、供试品溶液制备方法的研究

[0083] (1)提取溶剂的选择

[0084] 分别考察50％甲醇，80％甲醇，甲醇，乙醇作为提取试剂，对比不同溶剂对提取效果的影响。具体方法为：

[0085] 分别取金樱根(金樱子、广西柳州)粉末(过三号筛)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入不同提取溶剂各50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用对应的提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加0.05mol/L的氢氧化钠溶液20ml，使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用水40ml洗涤1次，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，进样10μl，结果见表
4。

[0086] 表4、提取溶剂的选择

[0087]提取溶剂 50％甲醇 80％甲醇 甲醇 乙醇
野蔷薇苷含量(％) 0.275 0.345 0.301 0.281
蔷薇苷含量(％) 0.152 0.206 0.173 0.185

[0088] 实验结果表明80％甲醇作为溶剂时，提取效果最好。

[0089] (2)提取方法及提取时间的考察。

[0090] 试验考察超声提取，索氏提取，加热回流提取三种提取方法，不同提取时间对提取达平衡的影响。

[0091] 超声提取具体为：分别取金樱根(金樱子、广西柳州))粉末(过三号筛)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)不同时间，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加0.05mol/L的氢氧化钠溶液20ml，使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用水40ml洗涤1次，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。

[0092] 索氏提取具体为：分别取金樱根(金樱子、广西柳州))粉末(过三号筛)约1g，精密称定，置索氏提取器中，精密加入80％甲醇50ml，分别提取4小时，8小时，12小时。提取液回收溶剂至干，从“残渣加0.05mol/L的氢氧化钠”起与超声处理同法操作，制成供试品溶液。

[0093] 加热回流提取具体为：分别取金樱根(金樱子、广西柳州))粉末(过三号筛)约2g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入80％甲醇50ml，称定重量，分别加热回流1小时，2小时，4小时。从“放冷，再称定重量”起与超声处理同法操作，制成供试品溶液。 [0094] 上述供试品溶液进样10μl，测定结果见表5。

[0095] 表5、不同提取方法及提取时间的考察

[0096]不同提取方法及时间 野蔷薇苷的含量(％) 蔷薇苷的含量(％)
超声提取30分钟 0.313 0.184
超声提取45分钟 0.346 0.212
超声提取60分钟 0.348 0.215
索氏提取4小时 0.213 0.116
索氏提取8小时 0.306 0.193
索氏提取12小时 0.344 0.214
加热回流1小时 0.303 0.187
加热回流2小时 0.349 0.211
加热回流4小时 0.345 0.213

[0097] 实验结果表明，超声处理45分钟已达平衡状态，且与索氏提取12小时，加热回流提取2小时效果基本相当。从操作方便考虑，故提取方法定为：超声提取45分钟。 [0098] (3)提取次数的选择

[0099] 为考察正丁醇提取次数，在提取3次后，继续用水饱和的正丁醇提取第4次、第5次，分别减压蒸发至干，残渣用甲醇1ml溶解，进样，结果表明第4次水饱和正丁醇振摇提取液中已无野蔷薇苷及蔷薇苷，故振摇提取3次，野蔷薇苷及蔷薇苷已能提取完全。故纯化方法采用水饱和正丁醇提取3次。

[0100] (4)纯化方法的考察

[0101] 试验采用传统的皂苷纯化方法。即：样品的甲醇提取液，蒸干后的残渣用碱水溶解，以水饱和正丁醇振摇提取，继以水洗涤正丁醇提取液的方法。

[0102] 试验另选用乙酸乙酯作为提取液，作为比较。结果见表6。

[0103] 表6、纯化方法考察

[0104]纯化溶剂 正丁醇 乙酸乙酯
野蔷薇苷的含量(％) 0.343 0.338
蔷薇苷的含量(％) 0.215 0.208

[0105] 结果表明，正丁醇或乙酸乙酯提取效果基本-致，但是在试验操作过程中发现，乙酸乙酯提取时，溶液更容易乳化，处理时间较长，且从提取溶液颜色及供试品色谱图来看，乙酸乙酯提取的杂质更多。因此，选用正丁醇作为纯化的提取溶剂。

[0106] 5、精密度试验

[0107] 取本品金樱根(金樱子、广西柳州))粉末2g，按[含量测定]项下方法制备供试品溶液，进样10μl，重复进样6次，测定野蔷薇苷与蔷薇苷面积值，并分别计算含量，结果见表7。

[0108] 表7、精密度试验结果

[0109]

[0110] 以上结果表明，所用液相色谱仪的精密度良好。

[0111] 6、稳定性试验

[0112] 取本品金樱根(金樱子、广西柳州))粉末2g，按[含量测定]项下方法制备供试品溶液，在室温下保存，分别于0、1、2、4、6、8、24小时的时间间隔，精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定野蔷薇苷与蔷薇苷峰面积值，并分别计算含量，结果见表8。 [0113] 表8、稳定性试验结果

[0114]

[0115]

[0116] 试验结果表明，供试品溶液在24小时内测定，其相对偏差分别为1.84％、2.97％，说明供试品溶液在24小时内测定稳定。

[0117] 7、重现性试验

[0118] 取同一批金樱根(金樱子、广西柳州))的金樱根药材6份，分别依法制备供试品溶液，分别测得峰面积值，并分别计算野蔷薇苷与蔷薇苷含量，RSD分别为：3.25％、3.47％，结果见表9。试验结果表明，方法重现性良好。

[0119] 表9、重现性试验结果

[0120]

[0121] 8、加样回收试验

[0122] 取与重现性试验同一批号的金樱根药材(含量测定结果为：野蔷薇苷0.360％，蔷薇苷0.222％)1g，平行6份，精密称定，分别精密加入野蔷薇苷与蔷薇苷混合对照品溶液(浓度分别为：1.032μg/ml、1.061μg/ml)1ml，依法制备加样回收供试品溶液，测定结果，以下列公式计算回收率，结果见表10，表11。

[0123]

[0124] 表10、野蔷薇苷加样回收试验结果

[0125]

[0126]

[0127] 表11、蔷薇苷加样回收试验结果

[0128]

[0129] 试验结果表明：回收率在95％～100％之间，加样回收良好。

[0130] 9、样品测定

[0131] 考察了不同产地、不同采收季节共11批不同产地金樱根中野蔷薇苷与蔷薇苷的含量，据此初步制订了药材的含量限度标准。结果见表12：

[0132] 表12、金樱根中野蔷薇苷与蔷薇苷测定结果

[0133]

[0134] 含量限度的制定：由表1中可看出，共11批金樱根中野蔷薇苷与蔷薇苷的含量范围分别为0.069％～0.359％，0.071％～0.313％。波动范围较大，平均含量分别为0.186％，0.182。以平均含量下浮20％，即均为0.15％，故将金樱根中野蔷薇苷与蔷薇苷的含量限度暂定为分别不低于0.15％。

[0135] 虽然所测的成分本身无明显的紫外吸收，但在本实验的分离条件下，采用紫外检测器，在210nm检测波长下，也能实现有效测定，采用紫外检测器检测并计算11批不同产地金樱根药材含量结果见表13。

[0136] 表13、金樱根中野蔷薇苷与蔷薇苷测定结果

[0137]

[0138] 由上述结果可见，紫外检测方法结果与蒸发光散射检测器检测方法结果基本一致，因此，上述两种检测器，均可作为本品种的含量测定检测器。(紫外检测方法谱图详见图15至图26)

[0139] 【实施例2】

[0140] 金樱根：金樱子，广西柳州

[0141] 照高效液相色谱法(《中国药典》附录VID)测定。

[0142] 色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水(56∶44)为流动相；用蒸发光散射检测器检测(或使用紫外检测器检测)。理论 板数按野蔷薇苷峰计算应不低于2000。

[0143] 对照品溶液的制备：分别取野蔷薇苷与蔷薇苷对照品(采用实施例1中所述的方法自制)适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，即得。

[0144] 供试品溶液的制备：取本品粉末(过三号筛)约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，回收溶剂至干，残渣加0.05mol/L氢氧化钠溶液20ml，使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用水40ml洗涤1次，取正丁醇液，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

[0145] 测定法：分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl与供试品溶液10～20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算野蔷薇苷、蔷薇苷的含量，即得。 [0146] 本品按干燥品计算，含野蔷薇苷(C36H58O10)与蔷薇苷(C36H58O10)分别不得少于：0.15％。

[0147] 试验例1

[0148] 该试验例对采用本发明实施例1中所述的方法自制的野蔷薇苷和蔷薇苷对照品的化学结构进行了鉴定。

[0149] gjy-4：2α，3β，19α-三羟基乌苏-12烯-28酸，28-O-β-D-葡萄糖苷；野蔷薇苷；Rosamultin；

[0150] 1H-NMR(CD3OD)δ：0.77(3H，s)，0.81(3H，s)，0.93(3H，d，J ＝ 6.5Hz，H-30)，1.01(6H，s)，1.20(3H，s)，1.33(3H，s)，2.51(1H，s，H-18)，2.91(1H，d，J＝9.6Hz，H-3)，
5.31(1H，brs，H-12)，5.32(1H，d，J＝8.0Hz，H-1′)；

[0151] 13C-NMR(CD3OD)δ：48.2(t，C-1)，69.5(d，C-2)，84.5(d，C-3)，40.5(s，C-4)，56.7(d，C-5)，19.7(t，C-6)，34.1(t，C-7)，41.3(s，C-8)，48.6(d，C-9)，39.2(s，C-10)，
24.8(t，C-11)，129.5(d，C-12)，139.7(s，C-13)，42.7(s，C-14)，29.6(t，C-15)，26.5(t，C-16)，49.5(s，C-17)，54.9(d，C-18)，73.7(s，C-19)，42.9(d，C-20)，27.2(t，C-21)，
38.3(t，C-22)，29.4(q，C-23)，16.7(q，C-24)，17.2(q，C-25)，17.7(q，C-26)，24.7(q， C-27)，178.5(s，C-28)，27.1(q，C-29)，17.5(q，C-30)，95.8(d，C-1′)，73.8(d，C-2′)，
78.5(d，C-3′)，71.1(d，C-4′)，78.3(d，C-5′)，62.4(t，C-6′)。

[0152] gjy-6：2α，3α，19α-三羟基乌苏-12-烯-28酸，28-O-β-D-葡萄糖苷；蔷薇苷；Euscaphicoside；刺梨苷；Kajiichigoside F1；

[0153] 1H-NMR(CD3OD)δ：0.76(3H，s)，0.88(3H，s)，0.92(3H，d，J ＝ 6.5Hz，H-30)，0.97(3H，s)，0.98(3H，s)，125(3H，s)，1.32(3H，s)，2.50(1H，s，H-18)，3.32(1H，brs，H-3)，
3.92(1H，m，H-2)，5.30(1H，brs，H-12)，5.32(1H，d，J＝8.0Hz，H-1′)；

[0154] 13C-NMR(CD3OD)δ：42.8(t，C-1)，67.2(d，C-2)，80.1(d，C-3)，39.5(s，C-4)，49.3(d，C-5)，19.3(t，C-6)，34.0(t，C-7)，41.4(s，C-8)，48.2(d，C-9)，39.4(s，C-10)，
24.7(t，C-11)，129.6(d，C-12)，139.7(s，C-13)，42.7(s，C-14)，29.6(t，C-15)，26.6(t，C-16)，49.6(s，C-17)，55.0(d，C-18)，73.6(s，C-19)，43.0(d，C-20)，27.3(t，C-21)，
39.0(t，C-22)，29.3(q，C-23)，22.4(q，C-24)，16.9(q，C-25)，17.6(q，C-26)，24.8(q，C-27)，178.5(s，C-28)，27.0(q，C-29)，16.6(q，C-30)，95.8(d，C-1′)，73.8(d，C-2′)，
78.6(d，C-3′)，71.1(d，C-4′)，78.3(d，C-5′)，62.4(t，C-6′)。