一种重组羧肽酶G2的药物组合物

摘要

本发明涉及一种重组羧肽酶G2药物组合物。本药物组合物包含医学有效剂量的重组羧肽酶G2蛋白、稳定剂、赋型剂及调节制剂pH值使其保持最佳生理活性的不挥发性缓冲剂。每ml重组羧肽酶G2药物组合物溶液含500-2000U重组羧肽酶G2，按重量体积比计3％～6％的赋型剂和按重量体积比计1％～3％的稳定剂，调节pH范围6.8～7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲剂及0.1-0.5mM氯化锌。本所述的重组羧肽酶G2冻干粉针制剂的有益效果体现在：在2-8℃保存条件下，活性保持可达24个月，并保持天然二聚体活性结构。本制剂为无菌，可通过静脉注射发挥药理作用。

权利要求

1.一种重组羧肽酶G2药物组合物，包括重组羧肽酶G2、药学可接受的赋型剂和稳定剂、含有金属离子的不挥发性缓冲溶液，其中活性成分为羧肽酶G2，其每ml重组羧肽酶G2药物组合物溶液中，活性成分重组羧肽酶G2为500～2000U，重量体积比（w/v）为3～6%的赋型剂30～60mg，1～3%的稳定剂10～30mg，含有二价锌离子的Tris-HCl缓冲溶液使重组羧肽酶G2药物组合物溶液中的pH值为6.8～7.8，所述赋形剂为甘露醇，所述稳定剂为蔗糖。

2.根据权利要求1所述的重组羧肽酶G2药物组合物，其特征在于：所述含有二价锌离子的不挥发性Tris-HCl缓冲溶液为含有0.1~0.5mM二价锌离子的pH值为7.3±0.5的Tris-HCl缓冲溶液。

3.根据权利要求1所述的重组羧肽酶G2药物组合物，其特征在于：所述二价锌离子溶液选自氯化锌或硫酸锌溶液。

说明书

一种重组羧肽酶G2的药物组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种可提高药物稳定性的重组羧肽酶G2药物组合物冻干粉针制剂及其制备方法。

背景技术

[0002] 羧肽酶G2(Carboxypeptidase G2，简称CPG2)可水解叶酸C端谷氨酸残基、叶酸的聚谷氨酰衍生物、叶酸类似物，例如氨甲喋呤(MTX)、以及叶酸的亚片段如对氨基苯甲酰谷氨酸(Chabner et al.1972；Goldman 1975；Kalghatgl&Bertino1981)。CPG2最初是从假单胞菌属菌株RS-16中分离得到的一种细菌酶(Levy&Goldman 1967)，到80年代时在大肠杆菌中被克隆、纯化(Minton，et al 1983)。羧肽酶G2水解MTX成无毒的非活性代谢物2，4-二甲基-N10-甲基蝶呤酸(DAMPA)和谷氨酸，两者可以通过肝脏代谢，提供了一个非肾的MTX清除通道，减轻了肾脏毒性。

[0003] MTX是叶酸的类似物，对二氢叶酸还原酶具有高度亲和力，并对其有强大而持久的抑制作用。与二氢叶酸还原酶结合后，阻止二氢叶酸(FH2)还原为生理活性的四氢叶酸(FH4)，使蛋白质和核酸的合成延迟或受阻，切断细胞代谢途径。合成的MTX自1948年已用于临床(Bleyer 1978)，是用于治疗肿瘤的多种化疗药物的重要成分。高剂量MTX(HD-MTX)是很多肿瘤的一线治疗药物，通常以长时间输注的方式给药，经常用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)以及软组织肿瘤(如骨肉瘤)等。此外，MTX具有免疫调节效应，可用于如类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)和牛皮癣的治疗。MTX在发挥治疗作用的同时，对人体正常细胞的毒性损伤非常强，其副作用包括粘膜毒性、骨髓抑制及肝肾脏损伤等。在早期研究中，应用高剂量MTX治疗的患者中，10％出现了严重的毒性作用，死亡率达到6％。MTX及其代谢产物易堵塞肾小管，大剂量MTX会引发急性肾功能衰竭，结果导致MTX排泄延缓和MTX血药浓度升高。实验证明，MTX毒性反应的强度在很大程度上取决于细胞在超限浓度下所暴露的时间。

[0004] 目前，临床上MTX高剂量化疗所致的毒副作用，通常采用亚叶酸钙进行解救。亚叶酸钙与MTX竞争进入细胞、靶组织(骨髓、胃肠道上皮)，阻止MTX的作用，补偿DNA合成代谢途径，从而达到缓解HD-MTX引发的不良反应。MTX浓度升高时需要更高浓度的亚叶酸钙，但大剂量亚叶酸钙同样可解救肿瘤细胞，降低抗肿瘤效果。通过水化和碱化尿液增强MTX的水溶性来降低肾毒性，可将毒性影响范围降低到1.5％，但仍会发生因清除延迟而致全身毒性。CPG2是目前被证明用于MTX大剂量治疗的特异性解救药，其可特异迅速裂解MTX为谷氨酸和2，4-二氨基-N10-甲基蝶酸(DAMPA)，且不透过血-脑屏障(BBB)和细胞膜，因而不会抵消细胞内MTX的作用。谷氨酸和DAMPA可在肝代谢，因此CPG2治疗实际上间接提供了一种肝解毒途径。

[0005] 羧肽酶G2活性分子是一种锌(Zn)依赖的同源二聚体蛋白质，亚单位分子量为41400Da，具有较复杂的高级结构，且其高级结构对维持活性至关重要。CPG2是目前被证明用于MTX大剂量治疗最有效的解救药。重组的CPG2(Glucarpidase，商品名Voraxaze)最初由Protherics Plc公司开发(2008年被BTG公司收购)，于2003年被美国和欧洲确定为罕见孤儿药(Orphan Drug)，正处于新药申报中，暂未获准上市，临床上用于MTX肿瘤化疗的患者的解救。用量为50U/kg，以静脉输液泵在5min内输入或者团注，可显著降低MTX血药浓度，避免脏器毒性。根据临床试验报告，血浆MTX清除可达到98％，将使MTX快速降到安全血药难度下，对MTX蓄积引起的肾功能衰竭有很好的预防作用。

[0006] 与亚叶酸钙比较，CPG2在解救途径上与之完全不同，其显著优势表现在：

[0007] (1)CPG2不透过血脑屏障，不影响细胞内的MTX水平，不会减弱MTX的疗效；

[0008] (2)CPG2显著降低MTX血药浓度，清除率可达98％，从根本上清除MTX。而亚叶酸钙只是补偿核酸代谢的通畅，拮抗MTX对细胞的毒性，并不能降低MTX浓度；(3)CPG2将MTX酶解为无活性、无毒、可通过肝脏排泄的代谢产物，避免了肾脏毒性，能帮助MTX导致肾毒性患者的肾功能恢复；(4)CPG2是解决MTX清除延迟唯一有效的方法。因此，CPG2将发展成为预防HD-MTX导致肾衰和MTX清除延缓的最有效治疗方法(Daniel M Patterson&Siow Ming Lee，ExpertOpin.Biol.Ther.2010，10(1)：105-111)。

[0009] 作为生物大分子，羧肽酶G2对温度、光照、湿度等因素较传统的小分子药物更敏感；同时各种化学因素，如pH、离子强度、缓冲剂、保护剂等，对蛋白质的稳定性也有重大影响。这些因子的作用，可能导致蛋白变性、解聚等物理或化学变化，从而导致蛋白质生物活性的丧失，引起给药药效的变化。天然微生物来源的羧肽酶G2在动物体内特异性高，抗原性不强，但要开发用于人体的治疗性药物，羧肽酶G2必须配制成稳定的、无毒的药物制剂形式。蛋白结构的多样性决定了在药物组成上有着不同的要求，同时，还需要满足产业化生产方便、成本控制合理的要求。此外，为保证长期保存，对蛋白质进行冷冻干燥处理去除水分通常具有更好的稳定性。

[0010] 我公司在专利(申请号：200910103526.1)中已公开了重组羧肽酶G2的载体构建及制备方法。重组羧肽酶G2以大肠杆菌表达系统生产，产物以可溶方式表达，具有天然结构和生物活性，无需变性和复性；重组CPG2表达量不低于可溶蛋白的30％，最终得率为500mg/L，显著地高于已有研究报道(Sherwood etal.1985)。该蛋白活性形式为非共价结合的同源二聚体，单体理论设计序列为390个氨基酸残基(氨基酸序列见图6所示)。

[0011] 目前，常用重组羧肽酶G2与乳糖组成药物组合物，由于乳糖作为冻干制剂有以下缺陷：BTG公司产品说明书记载了用乳糖作为冻干制剂，但在保存和冷冻干燥过程中，蛋白质和还原性的乳糖易发生梅拉德反应(Maillard反应)导致纯度降低，影响药效的内容(见Withdrawal assessment report for Voraxaze，EMEA/CHMP/171907/2008)。同时鉴于乳糖中所含杂蛋白的潜在风险和在亚洲人群中不耐性等安全性问题，因此，有必要寻求其他辅料用于羧肽酶G2注射剂。到目前为止，尚没有一种适合羧肽酶G2稳定保存和便于临床应用的制剂报道。

发明内容

[0012] 本发明的目的是提供一种重组羧肽酶G2的药物组合物，所述组合物药物稳定性高，便于保存，方便临床使用。

[0013] 本发明所提供的重组羧肽酶G2药物组合物，包括重组羧肽酶G2、药学可接受的赋型剂和稳定剂、含有金属离子的不挥发性缓冲溶液，其中活性成分为羧肽酶G2。

[0014] 其中，每ml重组羧肽酶G2药物组合物溶液中，活性成分重组羧肽酶G2为500～2000U，重量体积比(w/v)为3～6％的赋型剂30～60mg，1～3％的稳定剂10～30mg，含有二价锌离子的Tris-HCl缓冲溶液使重组羧肽酶G2药物组合物溶液中的pH值为6.8～
7.8。

[0015] 所述的赋型剂为多羟基醇。

[0016] 所述的多羟基醇为甘露醇或山梨醇。

[0017] 所述的稳定剂为糖类。

[0018] 所述的糖类为蔗糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖中一种或几种。

[0019] 所述的糖类优选蔗糖。

[0020] 所述含有二价锌离子的不挥发性Tris-HCl缓冲溶液为含有0.1～0.5mM二价锌离子的pH值为7.3±0.5的Tris-HCl缓冲溶液。

[0021] 所述二价锌离子溶液选自氯化锌或硫酸锌溶液。

[0022] 本药物制剂通过以下步骤实现：

[0023] 1、经过最终纯化、符合临床用药要求的重组羧肽酶G2原液(纯度＞98％)，与重量体积比计3～6％的赋型剂和1～3％的稳定剂、缓冲溶液等配制成半成品，其中重组羧肽酶G2活性成分500U/ml、1000U/ml、1500U/ml和2000U/ml，优选1000U/ml；

[0024] 2、进一步将制成的半成品溶液，进行除菌过滤，1.1ml/支分装入干烘灭菌的3ml西林瓶中；

[0025] 3、以冻干剂水分含量、成型度为考察指标，确定优化的冷冻干燥程序，冻干成粉针剂，并压盖封装；

[0026] 对以上冻干制剂，按照《中国药典2010版第二部》中药物制剂稳定性试验指导原则进行试验，考察不同温度、不同影响因素条件下的活性保持和纯度变化情况。

[0027] 本发明所述药物组合物选用以无菌水配制的Tris-HCl作为缓冲剂，缓冲范围2+
7.3±0.5，其中添加0.1～0.5mM Zn ，其中二价锌离子较优的浓度为0.2mM。

[0028] 本发明所述的二价锌选自硫酸锌或氯化锌溶液中的一种。羧肽酶G2活性分子为2+ 2+ 2+
同源二聚体，其活性需要Zn 。每个酶分子包含4个Zn 。Zn 对于维持蛋白活性起着重要作用。通过尺寸排阻HPLC和还原性SDS-PAGE分析可知，该蛋白表观分子量分别为83KD和
42.0KD，显示出该蛋白具有天然的同源二聚体结构，分子间的疏水相互作用可能是维持其高级结构的重要因素之一。

[0029] 经实验验证，本发明所述的药物组合物，在无菌条件下，将含有医学有效剂量的重组羧肽酶G2、药用辅料及缓冲溶液分装为1.1ml/支在3ml西林瓶中，利用冷冻干燥技术冻干成具有一定形状的、能迅速复溶的疏松粉块，因此方便临床使用和储存、运输等。

[0030] 本制剂中赋型剂选自甘露醇或山梨醇，优选甘露醇，含量范围为3～6％。它作为保护剂及冻干过程中的膨化剂，容易形成良好的骨架，且不影响药物体内生理活性，对机体不会产生任何过敏反应和无毒副作用等优势，是理想的冻干赋型剂。

[0031] 作为冻干保护剂的糖，可以选择葡萄糖、α-D-吡喃甘露糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、纤维二糖、甘露糖、麦芽糖、肌糖、棉白糖、菊糖、右旋糖酐、麦芽糖糊精、麦芽多糖等，糖在水性组合物中可作为冻干支持结构，有效防止蛋白质在冻干过程中失水时的变性。乳糖既可与甘露醇合用，也可单独作为冻干赋型剂和稳定剂，其含量浓度为5％。本制剂中，优选蔗糖，其含量在1～3％范围，可有效保护目的蛋白。

[0032] 本发明的有益效果是：通过优选的制剂配方和制备工艺，提供一种水分含量不超过3％的、无菌粉末状制剂。该制剂在2～8℃条件下，活性成分和纯度可稳定保持24个月，能满足临床使用对药物制剂的要求，且具有生产简单、成本低廉、使用方便等优点，为今后药物的临床研究及上市提供基础。

[0033] 本发明制剂中加入的缓冲剂，除了保证药物稳定性要求(或高级结构)外，接近生理pH环境，有利于在体内发挥生理活性，同时对人体不会产生过敏及增加新的毒副作用。

[0034] 按照BTG公司有关 的药品说明书规定，本药物制剂以常规的生理盐水(0.9％氯化钠)复溶后即可静脉推注使用，制剂生产规格1000U/支，同时可根据患者体重调整临床使用量。用于HD-MTX化疗过程中MTX中毒或高危患者解救的临床剂量为50U/kg，以静脉输液泵在5min内输入或者团注，可显著降低MTX血药浓度，避免脏器毒性。

附图说明

[0035] 图1是实施例4所述发明药物组合物2～8℃保存条件下高效液相色谱纯度和生物活性分析；

[0036] 图2是实施例5所述发明药物组合物2～8℃保存条件下高效液相色谱纯度和生物活性分析；

[0037] 图3是实施例6所述发明药物组合物2～8℃保存条件下高效液相色谱纯度和生物活性分析；

[0038] 图4是实施例7所述发明药物组合物2～8℃保存条件下高效液相色谱纯度和生物活性分析；

[0039] 图5是实施例4-7所述发明药物组合物25℃加速试验条件下SDS-PAGE纯度分析；

[0040] 图6是本制剂中活性成分羧肽酶G2氨基酸序列。

具体实施方式

[0041] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步阐述。应该理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，但并不是对本发明的限定。

[0042] 本发明的药物组合物为冻干粉末形式，其中所述的缓冲溶液、赋型剂、稳定剂、辅助金属离子等均采用药用级辅料配制，可以通过市售获得。

[0043] 本发明涉及的药物组合物中的活性成分是重组羧肽酶G2，来源于基因工程手段获得的重组蛋白质，通过大肠杆菌可溶表达获得，表达量高，纯化工艺简单高效，具体参见专利(申请号：200910103526.1)。

[0044] 本发明赋型剂选用甘露醇。甘露醇具有不易吸湿，流动性好的特点，易于形成膨松的骨架结构。同时，化学稳定性好，与羧肽酶G2不发生相互作用，可用作蛋白质活性保护剂；亦对人体无过敏和毒副作用。

[0045] 本发明的药物组合物选用蔗糖或乳糖作为冻干保护剂，基于蔗糖为多羟基双糖，能代替水分子同蛋白质表面部分结合，且具有较高的玻璃化温度，故对组织蛋白质二级结构的改变、冻干处理过程中及储藏期内蛋白质多肽链的伸展和聚集起着显著作用。乳糖也普遍地用于各种制剂的赋型剂，并已在注射级乳糖方面形成严格的质量标准，最大限度控制生产过程中的外源蛋白。

[0046] 本发明中所提供的重组羧肽酶G2冻干制剂中，羧肽酶G2氨基酸序列见图6所示。在具体实施方案中，赋型剂甘露醇终浓度为3～6％(W/V)，保护剂蔗糖和乳糖的终浓度分别为1～3％和5％(W/V)，含0.2mM ZnCl2的pH为7.3±0.5的缓冲。

[0047] 实施例1：赋型剂浓度对制剂成型、溶解度的影响

[0048] 甘露醇和山梨醇两种赋型剂在不同浓度条件下，冻干品的成型度及复溶的溶解度考察。具体实验过程为：以含有0.2mM ZnCl2的pH为7.3的25mM Tris-HCl缓冲溶液配制浓度为20％的甘露醇和山梨醇；分别取5ml羧肽酶G2原液(2000U/ml)和一定量的甘露醇或山梨醇母液(0ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4.0ml、5.0ml)，以上述Tris-HCl缓冲液定容至10ml，得到含不同浓度赋型剂的1000U/ml羧肽酶G2溶液，按1.1ml/支分装，冻干；在25℃条件下，放置20天后，每支样品以1ml注射用水复溶，观察溶解性，并进行RP-HPLC分析：

[0049] 1、甘露醇对制剂稳定性影响

[0050]

[0051]

[0052] 2、山梨醇对制剂稳定性影响

[0053]

[0054] 由上表可以看出，随甘露醇或山梨醇浓度渐升高，冻干制剂的成型也逐渐提高，而溶解性却有所下降，且蛋白质的稳定性变差。因此，综合药物稳定性、制剂成型度及溶解性等因素，确定甘露醇含量2～6％或者山梨醇含量4～7％均能很好地满足制剂要求。但同时考虑到人体渗透压因素，最终的制剂中甘露醇含量选择3％，山梨醇含量选择5％比较合适。

[0055] 实施例2：不同糖类对制剂稳定性的影响

[0056] 按如下条件考察不同糖类对冻干制剂稳定性的影响：分别以25mM，pH7.3Tris-HCl，0.2mM ZnCl2缓冲溶液配制浓度为10％的蔗糖、乳糖、葡萄糖和海藻糖；取
2000U/ml的羧肽酶G2原液5ml，加入3ml的上述糖溶液和2ml缓冲液，即得：含羧肽酶G2活性1000U/ml，糖含量3％的溶液。每种样品共配制10ml，按1.1ml/支分装入西林瓶，冷冻干燥后，于25℃条件下放置20天后取样进行RP-HPLC分析和活性测定。

[0057]

[0058] 以上结果显示：糖的添加对于稳定性的保持有益，其中又以蔗糖保护效果最佳，活性和纯度基本没有明显降低，其次是乳糖，海藻糖和葡萄糖在20天的观察期内有所降低。

[0059] 在此基础上，考察不同蔗糖浓度条件下制剂溶解度及稳定性的差异。其中赋型剂选用甘露醇，终浓度为3％；蔗糖浓度按0～5％添加，稳定性考察结果如下：

[0060]

[0061]

[0062] 蔗糖浓度在1～3％范围内，既能提供好的稳定性，且制剂溶解性好。

[0063] 综合以上实验结果，最终选择采用甘露醇3％和蔗糖1％作为冻干制剂辅料，既能有效保护目的蛋白活性，也有利于成型和使用时的溶解配制。

[0064] 实施例3：不同pH缓冲剂对制剂稳定性的影响

[0065] 经最终纯化的样品(含25mM Tris-HCl pH7.3)，以截留分子量10kD的膜进行超滤，分别用pH为4.0～6.0的25mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液、pH7.0～pH9.0的25mmol/L Tris-HCl缓冲溶液进行缓冲溶液交换。按3％甘露醇，1％蔗糖添加入样品，每种样品配制10ml，按1.1ml/支分装入西林瓶，冷冻干燥后，于25℃条件下放置20天后取样进行RP-HPLC分析和活性测定。

[0066]

[0067] 以上结果显示：pH7.0～8.0缓冲体系对药物活性保持最佳。根据已有的研究报道显示，该酶蛋白的最适pH为7.3，且接近人体生理pH环境，因此，以pH7.3作为制剂的缓冲pH最佳。

[0068] 实施例4：药物成品的制备

[0069] 配制1000U/ml的重组羧肽酶G2溶液100ml，每1ml溶液所含组分如下：

[0070]

[0071]

[0072] (1)辅料母液配制：以25mM，pH7.3Tris-HCl，0.2mM ZnCl2缓冲溶液配制，按重量体积比计，浓度为20％的甘露醇母液、浓度为10％的蔗糖母液，0.22μm过滤除菌，待用；

[0073] (2)取重组羧肽酶G2(已测定活性为1600U/ml)62.5ml，先后加入15ml的20％甘露醇母液和10ml的10％蔗糖母液；

[0074] (3)上述溶液以25mM，pH7.3Tris-HCl，0.2mM ZnCl2缓冲溶液定容至100ml，其中5
即含重组羧肽酶G21×10U，按重量体积比为3％的甘露醇和1％的蔗糖，除菌过滤；

[0075] (4)在百级洁净度的无菌条件下将上述混合溶液按1.1ml/支分装到3ml的安倍瓶中，进行装盘冻干。

[0076] 以上样品冻干后，按照《药品注册管理办法》及《中国药典2010版第三部》的有关要求和规定，取样经鲎试剂法检测内毒素＜0.5EU/ml，无菌检查为阴性，水分含量＜3％。其他各检定指标均符合质量标准。该制剂在2～8℃条件下稳定性结果见图1所示。

[0077] 实施例5：

[0078] 配制1000U/ml的重组羧肽酶G2溶液100ml，每1ml溶液所含组分如下：

[0079]

[0080] 按实施例1中相同方法配制重组羧肽酶G2混合液100ml，其中含按重量体积比为3％的甘露醇和2％的蔗糖：

[0081] (1)辅料母液配制：以25mM，pH7.3Tris-HCl，0.2mM ZnCl2缓冲溶液配制，按重量体积比计，浓度为20％的甘露醇母液、浓度为10％的蔗糖母液，0.22μm过滤除菌，待用；

[0082] (2)取重组羧肽酶G2(已测定活性为1600U/ml)62.5ml，先后加入15ml的20％甘露醇母液和20ml的10％蔗糖母液；

[0083] (3)上述溶液以25mM，pH7.3Tris-HCl，0.2mM ZnCl2缓冲溶液定容至100ml，其中5
即含重组羧肽酶G21×10U，按重量体积比为3％的甘露醇和2％的蔗糖，除菌过滤；

[0084] (4)在百级洁净度的无菌条件下，将上述混合溶液按1.1ml/支分装到3ml的安倍瓶中，进行装盘冻干。

[0085] 以上样品冻干后，按照《药品注册管理办法》及《中国药典2010版第三部》的有关要求和规定，取样经鲎试剂法检测内毒素＜0.5EU/ml，无菌检查为阴性，水分含量＜3％。其他各检定指标均符合质量标准。该制剂在2～8℃条件下稳定性结果见图2所示。

[0086] 实施例6：

[0087] 配制1000U/ml的重组羧肽酶G2溶液100ml，每1ml溶液所含组分如下：

[0088]

[0089] 按实施例1中相同方法配制重组羧肽酶G2混合液100ml，其中含按重量体积比为5％的乳糖：

[0090] (1)辅料母液配制：以25mM，pH7.3Tris-HCl，0.2mM ZnCl2缓冲溶液配制，按重量体积比计，浓度为20％的乳糖母液，0.22μm过滤除菌，待用；

[0091] (2)取重组羧肽酶G2(已测定活性为1600U/ml)62.5ml，然后加入25ml的20％乳糖母液；

[0092] (3)上述溶液以25mM，pH7.3Tris-HCl，0.2mM ZnCl2缓冲溶液定容至100ml，其中5
即含重组羧肽酶G21×10U，按重量体积比为5％的乳糖，除菌过滤；

[0093] (4)在百级洁净度的无菌条件下将上述混合溶液按1.1ml/支分装到3ml的安倍瓶中，进行装盘冻干。

[0094] 以上样品冻干后，按照《药品注册管理办法》及《中国药典2010版第三部》的有关要求和规定，取样经鲎试剂法检测内毒素＜0.5EU/ml，无菌检查为阴性，水分含量＜3％。其他各检定指标均符合质量标准。该制剂在2～8℃条件下稳定性结果见图3所示。

[0095] 实施例7：

[0096] 配制500U/ml的重组羧肽酶G2溶液100ml，，每1ml溶液所含组分如下：

[0097]

[0098] 按实施例1中相同方法配制重组羧肽酶G2混合液100ml，其中含按重量体积比为3％的甘露醇和1％的蔗糖：

[0099] (1)辅料母液配制：以25mM，pH7.3Tris-HCl，0.2mM ZnCl2缓冲溶液配制，按重量体积比计，浓度为20％的甘露醇母液、浓度为10％的蔗糖母液，0.22μm过滤除菌，待用；

[0100] (2)取重组羧肽酶G2(已测定活性为1600U/ml)31.25ml，先后加入15ml的20％甘露醇母液和10ml的10％蔗糖母液；

[0101] (3)上述溶液以25mM，pH7.3Tris-HCl，0.2mM ZnCl2缓冲溶液定容至100ml，其中4
即含重组羧肽酶G25×10U，按重量体积比为3％的甘露醇和1％的蔗糖，除菌过滤；

[0102] (4)在百级洁净度的无菌条件下将上述混合溶液按1.1ml/支分装到3ml的安倍瓶中，进行装盘冻干。

[0103] 以上样品冻干后，按照《药品注册管理办法》及《中国药典2010版第三部》的有关要求和规定，取样经鲎试剂法检测内毒素＜0.5EU/ml，无菌检查为阴性，水分含量＜3％。其他各检定指标均符合质量标准。该制剂在2～8℃条件下稳定性结果见图4所示。

[0104] 实施例8：

[0105] 制剂的稳定性

[0106] 对上述实施例4～7制备重组羧肽酶G2药物组合物冻干制剂，按照《中国药典2010版第三部》要求，进行加速试验和长期试验考察。其中，加速试验在25℃的温度条件下考察6个月，分别于1、2、3、6月取样进行相关检测；长期稳定性试验在2～8℃条件下考察
24个月。

[0107] 样品准备：用注射器准确吸取1.0ml注射用水或生理盐水，加入西林瓶中复溶，测定纯度及活性。

[0108] 生物活性测定采用特异性MTX降解法测定，活性单位定义为：一个活力单位定义为，37℃，pH7.3条件下，每分钟催化1.0μmol氨甲蝶呤水解所需要的酶量。测定方法详见(Carl C.Levy et al，J Biol Chem，1967)的报道。

[0109] 纯度采用高效液相色谱法，以反相HPLC和尺寸排阻过滤HPLC测定：

[0110] 反相HPLC(RP-HPLC)：柱子Agilent ZORBAX 300SB-C18；流动相：A：0.075％TFA/水，B：0.075％TFA/乙腈，10％～90％，30min；流速1.0ml/min；紫外检测波长220nm；进样量20μl；柱温25℃。

[0111] 尺寸排阻过滤HPLC(SEC-HPLC)：柱子TOSOH公司TSK G2000SWxl；流动相0.2M硫酸钠，50mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠，pH6.8；流速0.8ml/min；紫外检测波长220nm；柱温25℃。

[0112] 1、加速试验

[0113] 将本发明的药物组合物，在25℃，60％湿度条件下进行加速试验，结果见下表：

[0114]

[0115]

[0116] 采用SDS-PAGE方法分析样品，对每个组合物在第6个月分别取样，进行非还原性SDS-PAGE电泳(每孔上样量约5μg)。结果见图5。泳道1为rCPG2初始样，泳道2-5分别为实施例4-7所述药物制剂在以上加速条件下存放6个月的样品。结果显示：25℃条件下放置6个月，没有产生明显的降解和聚集体，与以上RP-HPLC分析结果吻合。

[0117] 以上结果表明，依本发明的药物组分及其制备方法所得的重组羧肽酶G2药物制剂稳定性良好，各项指标检查符合《中国药典2010版第三部》的有关规定，满足新药对稳定性的要求；其中采用甘露醇与蔗糖作为冻干辅料，稳定性略优于乳糖。在25℃的加速试验条件下，考察6个月时间，活性保持良好。

[0118] 2、长期稳定性考察

[0119] 对上述药物制剂(实施例4～7)进行2～8℃条件下的长期稳定性考察，于放置后的每3个月取样进行RP-HPLC分析，结果见附图1、2、3和4。结果显示：在2～8℃避光条件下，本制剂含量和有关物质无显著变化，可稳定保存24个月，符合《中国药典2010版第三部》的要求。

[0120] 实施例9：

[0121] 冷冻干燥工艺

[0122] 按实施例4所述方法，制备1000支样品，放入冷冻干燥机中。按照冻干程序进行冻干，冻干结束后，压塞，封铝盖。经优化并最终确定的冻干工艺如下：

[0123] 冻干工艺中温度控制

[0124]

[0125] 水分测定结果显示：＜3％；纯度＞98％；制剂溶解性和成型度均较好。该结果表明，此冻干工艺可满足中试规模条件的样品制备，用于提供临床前药理毒理及临床研究所需样品。

[0126] 实施例10：

[0127] 羧肽酶G2生物学活性测定

[0128] 羧肽酶G2可特异性水解MTX成DAMPA和谷氨酸，临床上用于大剂量MTX治疗中的解救，预防和降低MTX引起的血液、粘膜及脏器毒性。参考文献(Roger F.SHERWOOD et al，Eur.J.Biochem.1985，148：447-453)中的方法测定羧肽酶G2生物活性。

[0129] 反应原理：MTX+H2O→谷氨酸+DAMPA

[0130] 取2.82ml 0.1mol/L Tris-HCl，pH7.3，0.2mmol/L ZnCl2，加入180μl 1mmol/L氨甲蝶呤(MTX，中国药品生物制品检定所)，即最终3ml反应体系中含：0.1mol/LTris-HCl，pH7.3，0.2mM ZnCl2，0.06mM MTX。37℃预热5min。快速加入50μl标准品或待测样品(适当稀释，使加入反应体系中的酶量以1min吸光值变化在0.0204～0.0782之间为宜)，并混匀，倒入比色杯中，在37℃条件下，测定320nm处吸光值，每间隔0.25min(即15s)检测一次。记录吸光值变化。分光光度计以蒸馏水调零。以吸光值A对时间(min)作图，得线性曲线斜率(k)，并按照下式计算活性：

[0131]

[0132] ΔA-每分钟吸光值变化值

[0133] ε-摩尔吸光系数(L/mol·cm)：8300L/mol·cm＝8.3mL/μmol·cm

[0134] Vt-反应总体积(L)：3050μL

[0135] Δt-测定时间(min)

[0136] Vs-反应样品总体积(ml)：50μL

[0137] df-样品稀释倍数

[0138] k-吸光值变化曲线的斜率

[0139] 活性定义：一个活力单位定义为，37℃，pH7.3条件下，每分钟催化1.0μmol氨甲蝶呤水解所需要的酶量。

[0140] 比活力＝活性(U/ml)/蛋白含量(mg/ml)

[0141] 本制剂中的重组羧肽酶G2比活力＞400U/mg，与国外同类药物相当。

[0142] 尽管本发明是结合的最佳实施例进行描述的，但是对于本领域的技术人员而言，可在所附权利要求限定的范围内对本发明内容进行各种修改，这些修改形式同样落于本发明范围之内。