一种宫颈癌预防性VLP疫苗

摘要

本发明公开了一种宫颈癌预防性VLP疫苗，VLP是HPV18型、52型、58型L1蛋白的环部位插入1个16型的E7表位而得到的嵌合蛋白的聚集体。本发明的疫苗可以高效地诱导抗多种抗高危型HPV病毒的中和抗体，免疫效果好，免疫时间长。

权利要求

1.一种宫颈癌预防性VLP疫苗，所述疫苗含有人乳头瘤病毒HPV的嵌合蛋白聚集体，所述嵌合蛋白通过在HPV 18型、52型或58型的L1蛋白的140与141位之间插入HPV 16型的E7表位而得到，其中，E7表位为MLDLQPETT（SEQ ID NO：1）、RAHYNIVTF（SEQ ID NO：

2）、LLMGTLGIV（SEQ ID NO：3）、TLGIVCPI（SEQ ID NO：4）中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的一种宫颈癌预防性VLP疫苗，其特征在于：聚集体由多个五聚体病毒壳粒聚集而成。

3.根据权利要求2所述的一种宫颈癌预防性VLP疫苗，其特征在于：聚集体的五聚体病毒壳粒的个数为60～85个。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的一种宫颈癌预防性VLP疫苗，其特征在于：所述疫苗的聚集体中，至少含有两种不同的E7表位。

5.根据权利要求4所述的一种宫颈癌预防性VLP疫苗，其特征在于：所述疫苗的聚集体中，含有4种E7表位。

6.根据权利要求1所述的一种宫颈癌预防性VLP疫苗，其特征在于：所述疫苗还含有可接受的药用辅料。

说明书

一种宫颈癌预防性VLP疫苗

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于诱导抗高危型人乳头瘤病毒的疫苗。

背景技术

[0002] 人乳头瘤病毒（HPV）是小型DNA病毒，存在100个以上的基因型，其中有15个基因型（高危型：16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66、68、73型）是子宫颈癌的原因。HPV16型在50-60%的子宫颈癌中被检出。在欧美以18型居多，在亚洲以16、58型居多。

[0003] HPV病毒壳体为正20面体骨架上具有12分子的L2蛋白质的结构，所述正20面体骨架由72个L1蛋白质五聚体形成。L2蛋白质的两端位于病毒壳体的内部，而其N末端侧的一部分露出在壳体表面。如果采用重组DNA技术仅使L1蛋白质大量表达，则会产生病毒样颗粒（Virus-like particle；VLP）。实验证实，如果将牛乳头瘤病毒、棉尾兔乳头瘤病毒的VLP或L2蛋白质接种于动物，则会对病毒侵染表现出抵抗性。

[0004] 目前尚没有可供HPV增殖的培养细胞系。为了监测HPV的感染，制作了假病毒。在表达SV40T抗原的人293细胞中导入具有SV40复制起点的分泌性碱性磷酸酶(SEAP)表达质粒、以及L1和E7蛋白质表达质粒，则复制的SEAP表达质粒组入L1/E7-病毒样颗粒，从而形成了感染性假病毒。可以通过抑制假病毒的感染性的活性来测定中和抗体（Rose,R.C.,Bonnez,W.,Reichman,R.C.,Garcea,R.L.,1993.Expression of human papillomavirus type11L1protein in insect cells:in vivo and in vitro assembly of virus-like particles.J.Virol.67,1936–1944）。

[0005] 将HPV的VLP接种于动物而得到的抗血清具有基因型特异性的中和活性（Chen,X.S.,Garcea,R.L.,Goldberg,I.,Casini,G.,Harrison,S.C.,2000.Structure of small virus-like particules assembled from the L1protein of human
papillomavirus16.Mol.Cell5,557–567；Harper,D.M.,et al.:Sustained efficacy up to4.5years of abivalent L1virus-like particle vaccine against human
papillomavirus type16and18:follow up from a randomized control trial.
Lancet367(9518),1247-1255）。基于此，Merck公司开发出了HPV16、18型VLP的混合疫苗。
这些疫苗在大规模临床实验中显示出基因型特异性的感染预防效果，Merck公司的疫苗于
2006年取得了FDA和欧洲委员会的认证并上市销售。

[0006] 但是，如上述，如果用HPV的L1-病毒壳体免疫动物，则会诱导出相应型病毒基因特异性的免疫应答。如使用16型L1-病毒壳体疫苗进行的临床实验的中间成绩显示对16型的感染的预防有效性，但也显示对于其它基因型基本没有预防效果。

[0007] 在15个高危HPV群体中，现在销售的HPV疫苗仅对16型和18型有效。因为VLP诱导基因型特异性的中和抗体，为了针对全部高危HPV群，必须使用15种VLP的鸡尾酒，以此作为实用性疫苗抗原是困难的。因此，希望开发诱导交叉反应性中和抗体的疫苗抗原。

[0008] WO2007/018049公开的抗原是至少能够抗全部高危型的抗原，而且是基因型共有性更高的抗原。但是，其使用的感染性假病毒仅为16、18型，相对于这些感染性假病毒，WO2007/018049使用的抗原显示了良好的中和活性。而本申请发明人在后续的实验中发现，WO2007/018049公开的抗原对本发明人新开发的52、58型的感染性假病毒的中和活性并不高。

[0009] 为了用疫苗预防子宫颈癌的发生，至少必须开发出能够抵抗所有高危型病毒的疫苗。

发明内容

[0010] 本发明的目的在于提供一种可以对抗多种高危型HPV病毒的疫苗。

[0011] 本发明所采取的技术方案是：

[0012] 一种宫颈癌预防性VLP疫苗，所述疫苗含有人乳头瘤病毒HPV的嵌合蛋白聚集体，所述嵌合蛋白通过在HPV18型、52型或58型的L1蛋白的140与141位之间插入HPV16型的E7表位而得到，其中，E7表位为MLDLQPETT（SEQ ID NO：1）、RAHYNIVTF（SEQ ID NO：2）、LLMGTLGIV（SEQ ID NO：3）、TLGIVCPI（SEQ ID NO：4）中的至少一种。

[0013] 聚集体由多个五聚体病毒壳粒聚集而成。优选的，五聚体病毒壳粒的个数为60～85个。

[0014] 疫苗的聚集体中，至少含有两种不同的E7表位，优选的，含有4种E7表位。

[0015] 疫苗还含有可接受的药用辅料。

[0016] 本发明的有益效果是：

[0017] 本发明的疫苗，可以高效地诱导抗多种抗高危型HPV病毒的中和抗体，免疫效果好，免疫时间长。

具体实施方式

[0018] 一种宫颈癌预防性VLP疫苗，所述疫苗含有人乳头瘤病毒HPV的嵌合蛋白聚集体，所述嵌合蛋白通过在HPV18型、52型或58型的L1蛋白的140与141位之间插入HPV16型的E7表位而得到，其中，E7表位为MLDLQPETT（SEQ ID NO：1）、RAHYNIVTF（SEQ ID NO：2）、LLMGTLGIV（SEQ ID NO：3）、TLGIVCPI（SEQ ID NO：4）中的至少一种。

[0019] 在本发明中，从蛋白质的氨基末端起依次对氨基酸残基进行编号，例如第50号位的氨基酸记作氨基酸50。本发明中HPV18型、52型或58型L1蛋白的序列分别如SEQ IDNO：5～7所示。

[0020] 为了制作本发明的嵌合蛋白质而插入L1蛋白质的人乳头瘤病毒16型的E7表位序列为：

[0021] MLDLQPETT（以下简称12-20E7表位）

[0022] RAHYNIVTF（以下简称49-57E7表位）

[0023] LLMGTLGIV（以下简称82-90E7表位）或

[0024] TLGIVCPI（以下简称86-93E7表位）。

[0025] 12-20E7表位由HPV16型的E7蛋白质的氨基酸12-20区域的9个氨基酸构成。49-57E7表位由HPV16型的E7蛋白质的氨基酸49-57区域的9个氨基酸构成。82-90E7表位由HPV16型的E7蛋白质的氨基酸82-90区域的9个氨基酸构成。86-93E7表位由HPV16型的E7蛋白质的氨基酸86-93区域的8个氨基酸构成。

[0026] HPV的基因型多，因而，通常以HPV16、HPV58等表示方式将其基因型一并表示出来。在本文中，类似将HPV16型的L1-病毒壳体表述为16L1-病毒壳体。

[0027] 聚集体由多个五聚体病毒壳粒聚集而成。优选的，五聚体病毒壳粒的个数为60～85个。

[0028] 如前述，HPV粒子中，72个由5个分子的L1蛋白质聚集而成的病毒壳粒聚集在一起形成正20面体的病毒壳体。如果使L1蛋白质在细胞中高表达，则L1蛋白质集中在核内，并自主性的形成病毒壳体。仅由L1蛋白质形成的病毒壳体称为L1-病毒壳体或病毒样颗粒（virus-like particle：VLP）。如果使L1蛋白质和E7蛋白质同时表达，则12个分子的E7蛋白质会组入L1-病毒壳体，从而形成L1/E7-病毒壳体（或L1/E7-VLP）。L1-病毒壳体与L1/E7-病毒壳体无法用电子显微镜辨别。

[0029] 天然型VLP通常由360个分子的L1蛋白质形成，这种情况下，每个粒子具有360个交叉反应性表位。使用重组杆状病毒在昆虫sf9细胞中表达将HPV16E7蛋白质的氨基酸12～20、49～57、82～90、86～93的序列插入HPV18型、52型、58型L1蛋白质的氨基酸140/141之间而VLP，电子显微镜照片显示各嵌合蛋白形成了VLP粒子，分别命名为Ch12/20、Ch49/57、Ch82/90、Ch86/93。

[0030] 疫苗的聚集体中，至少含有两种不同的E7表位，优选的，含有4种E7表位。这可以获得更多的交叉中各反应，使得该疫苗可以对抗更多的高危型HPV。

[0031] 疫苗还含有可接受的药用辅料。

[0032] 将E7表位对应的核酸序列插入到相应的L1蛋白基因中的对应位置，之后将得到的核酸序列插入表达载体中表达，即可得到相应的嵌合蛋白。

[0033] 下面结合实施例，进一步说明本发明。

[0034] 兔肽抗血清的制作：

[0035] 对2只新西兰兔（2.5kg～3.0kg）进行了免疫。所使用的抗原是化学合成的肽与KLH（keyhole limpet hemocyanin）相结合而得到的。首次致敏是将0.5mg抗原与弗氏完全佐剂一起皮下施用。首次施用2周后将0.25mg抗原与弗氏完全佐剂一起皮下施用。而且，在2周后、4周后、6周后同样（0.25mg）地进行致敏，共计进行5次致敏。在末次致敏1周后，采集全血，得到了血清。

[0036] 采用以下所示的中和实验，考察了用具有HPV16型E7-表面区域的氨基酸序列的合成兔肽兔而得到的抗血清。结果如表1所示。由表1所示的结果可知：氨基酸12-20、49-57、82-90、86-93区域中存在交叉反应性表位。

[0037] 中和实验：

[0038] 1)中和实验前一天，在96孔细胞培养用平板中播种10000个/孔的293FT细胞（购自Invitrogen公司）；

[0039] 2)用Neautralization Buffer(在除去酚红的DMEM培养基中添加10%FCS、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酸、10mM HEPES而得到)稀释血清，并与感染性假病毒相混合，4℃反应1小时，再将其添加于前一天播种的293FT细胞；

[0040] 3)培养约72小时后，回收上清20μl,采用Roden等的方法（参照http://home.ccr.cancer.gov/lco/colorimetricSEAP.htm）测定碱性磷酸酶活性。

[0041] 表1、抗E7肽抗体中和活性

[0042]

[0043] 病毒壳体抗原的制作方法：

[0044] 1)嵌合基因和合成：

[0045] (1)利用从Genebank里面调取的HPV18型、52型、58型L1蛋白质已知基因序列，进行全序列合成得到L1基因，设计HPV18型、52型、58型L1特异性引物扩增L1全长基因。为了便于目的基因克隆到杆状病毒供体质粒上，在上、下游引物中分别引人了BamHI和EcoRI限制性酶切位点识别核苷酸序列，利用PCR技术进行扩增，将回收的HPV18型、52型、58型L1PCR产物与pGEM--T载体连接后经蓝白斑筛选出阳性克隆，提取阳性克隆质粒，同时将阳性克隆中的HPV16型、18型、52型、58型L1序列进行测序；

[0046] (2)合成HPV16型E7相应表位蛋白基因片段，并通过重组PCR技术进行扩增，并与HPV16型、18型、52型、58型L1基因进行嵌合，形成HPV18L1/E7、HPV52L1/E7、HPV58L1/E7嵌合基因，将回收的PCR产物与pGEM--T载体连接后经蓝白斑筛选出阳性克隆，提取阳性克隆质粒，同时将阳性克隆中的序列进行测序。

[0047] 2)供体质粒的构建：

[0048] (1)将HPV18Ll/E7、HPV52Ll/E7、HPV58Ll/E7阳性克隆质粒经BamHI和EcoRI酶切后，回收HPV18Ll/E7、HPV52Ll/E7、HPV58Ll/E7DNA片段，与经BamHI和EcoRI酶切的pFASTBacHTb质粒连接，反应过程为：

[0049] (2)HPV18Ll/E7DNA8μL,2 倍 T4 连 接 Buffer10μL,T4 连 接 酶1μL,pFASTBacHTb1μL，4℃连接过液，将连接物转化至DH5α，提取pFASTBacHTb-HPV18L1供体质粒，备用；

[0050] (3)HPV52Ll/E7DNA8μL,2 倍 T4 连 接 Buffer10μL,T4 连 接 酶1μL,pFASTBacHTb1μL，4℃连接过液，将连接物转化至DH5α，提取pFASTBacHTb-HPV52L1供体质粒，备用；

[0051] (4)HPV58Ll/E7DNA8μL,2 倍 T4 连 接 Buffer10μL,T4 连 接 酶1μL,pFASTBacHTb1μL，4℃连接过液，将连接物转化至DH5α，提取pFASTBacHTb-HPV58L1供体质粒，备用。

[0052] 3)供体质粒与DH10BAC菌的转座反应：

[0053] (1)制备Luria平板：称取Luria培养基适量，8磅高压后，凉至55℃时，加人以下成分:卡那霉素80μg/mL，庆大霉素20μg/mL，四环素20μg/mL,IPTG60μg/mL,X—gal100μg/mL，制平板；

[0054] (2)DH10BAC感受态的制备：挑取大肠杆菌DH10BAC单个菌落，接种于含10μg/mL氨苄青霉素和7μg/mL庆大霉素的LB培养液中，37℃培养过夜，次日，按1%的量接种于同样的LB中，37℃培养至光密度值A600约为0.4时，取出冰浴l0min,4℃，离心，收集菌体，用冰浴的TSS(含10%PEG,20mM MgCl2,5%DMSO的LB8.5mL)悬浮，分装，-70℃冰箱冻存；

[0055] (3)转座反应：取出冻存的DH10BAC感受态，置冰上融化，加5μL重组供体质粒，轻弹管壁混匀，冰浴30min,42℃90sec，取出，冰浴2min，加入900μL的SOC培养基至转化物中，37℃慢摇培养4h。对培养物做10-1,10-2`,10-3系列稀释(即100μL的转座培养物加900μL的SOC培养基，依次类推)。每个稀释度各取100μL，加于Luria平板上，涂匀，37℃培养36-48小时至蓝及白斑出现；

[0056] (4)重组Bacmid DNA提取：挑取上述平板上的白色菌落3～4个，分别再在Luria平板划线培养过夜，挑取仍为白斑的菌落，加入5mL的LB(含80μg/mL卡那霉素，20μg/mL庆大霉素，50μg/mL四环素)中，37℃振摇培养24h。取1.5mL的培养物，离心，收集菌体，沉淀中加入0.3mL溶液1(15mM Tris-Cl pH8.0,10mM EDTA.100μg/mL RNase A)悬浮菌体，加人0.3mL溶液11(0.2M NaOH,l%SDS)混匀，室温放置5min，加人0.3mL3M pH5.5醋酸钾，混匀，冰浴5-10min,14000g离心10min，取上清，加人0.8m1的异丙醇，混匀，冰浴5-10min,14000g离心15min，沉淀用70%的乙醇洗后，离心，沉淀室温干燥，溶于40μL的PH8.0TE中。

[0057] 4)培养：

[0058] (1)细胞转染：Sf9细胞培养采用含10%胎牛血清和双抗(50U/mL青霉素，50μg/mL链霉素)的SFM培养基(Grace培养基中含酵母提取物5.3g/L，水解乳蛋白4.3g/L)中27℃培养。细胞生长液为含10%胎牛血清的SFM培养基；细胞维持液为含2%胎牛血清的SFM培养基。转染前24h将细胞传至6孔板中，待细胞长至约70%丰度时进行转染。转染在无血清无抗生素的SFM培养液中进行，反应体系如下：A液:取重组Bacmid DNA10μL，与
100μL的无血清无抗生素的SFM混合。B液:取7μL的细胞脂质体CELLFECTIN，与100μL无血清无抗生素的SFM混合。将上述A液与B液混合，轻弹管壁混匀，室温下放置40min。
用无血清无抗生素的SFM培养液洗细胞2次，将上述A液与B液的混合物加至Sf9细胞中，每孔补加0.8mL的无血清无抗生素的SFM,27℃孵育5h，将转染液移去，换为2%的细胞维持液，27℃培养72h；

[0059] (2)重组杆状病毒的收获和繁殖：细胞转染72h后，收获转染上清至无菌管中，此即为含重组杆状病毒的原代毒种。Sf9细胞大量传代，选取24h后生长成90%丰度的细胞，弃细胞生长液，接种0.1ml的原代毒，加人2%细胞维持液，27℃培养72h，收取上清，此即为2代毒种，按同样的方法收获3代毒种，2代毒与3代毒的细胞留做鉴定用。Sf9细胞大量繁殖、传代，接种3代毒种后，收获大量接毒后的Sf9细胞；

[0060] (3)重组杆状病毒的PCR鉴定：收集2代和3代毒接种后的Sf9细胞于无菌管中，用酚:氯仿法提取细胞DNA，酒精沉淀，干燥后溶于20μL去离子水中，作为PCR鉴定的模板。PCR反应条件同上。反应结束后，取5μL经1%的琼脂糖电泳鉴定；

[0061] (4)HPV16L1表达蛋白的鉴定：1）SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳-收集3代毒接种后的Sf9细胞，1500g离心5min，收集细胞沉淀，加l×电泳加样缓冲液，100℃变性5min，电泳采用12%的分离胶和5%的成层胶。开始电泳电压8V/cm，行至分离胶后电压加大到15V/cm。电泳结束后染色、脱色；2）蛋白印迹反应(Western一blot)-SDS-PAGE电泳结束后，将蛋白质直接电转移至硝酸纤维素滤膜上，电转结束后用丽春红染液染色观察是否转膜完全。
5%脱脂奶室温封闭2h后，加人HPV16Ll或HPV18Ll或HPV52Ll或HPV58Ll单抗，平缓摇动
2h,,PBS洗膜3次，加人辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体，平缓摇动2h。PBST洗膜3次。在9mL的10mmol/L Tris-Cl(PH7.5)溶液中溶解6mg的二氨基联苯胺，加人10μL30%过氧化氢，混匀后将膜加入，观察反应过程，至蛋白带的颜色深度达到要求。

[0062] 5)纯化：

[0063] (1)层析柱的处理：1）3～5倍柱体积去离子水冲洗柱子，流速为0.2mL/min；2）2～3倍柱体积0.2mol/L硫酸镍过柱，流速为0.2mL/min；3）3～5倍柱体积去离子水冲洗柱子，流速为0.2mL/min；4）3～5倍柱体积15%乙醇冲洗柱子，流速为0.2mL/min；取
30%Ni-NT A Agarose适量至离心管中，1500g离心5min，用10倍体积的Buffer A(20mM Tris-Cl PH8.5,300mM KCl,10mMm咪唑，5mM2-琉基乙醇,10%甘油，8M尿素)平衡，备用；

[0064] (2)样品制备：用3代毒种大量接种Sf9细胞，72h收毒，细胞沉淀用6M PH7.8盐酸胍溶解，水浴2h,4000g离心，收集上清，上清用1mL注射器吹打后备用；

[0065] (3)表达蛋白的纯化：将制备好的细胞上清加至平衡好的层析柱中，4℃磁力搅拌器搅拌过夜，4000g离心5min，收集沉淀。用离心的方法经Buffer A液(20mM Tris-Cl PH8.5,500mM KC1,20mM咪唑,5mM2-琉基乙醇,10%甘油，8M尿素)、Buffer B液(20mM Tris-Cl pH8.5,1M KCl,5mM2-琉基乙醇,10%甘油，8M尿素),Buffer C液(20mM Tris-Cl PH8.5,100mM KCl,100mM咪唑，5m M2-琉基乙醇，10%甘油，8M尿素)分别依次洗脱，如下:10倍柱体积的Buffer A洗脱，去上清，7次；2倍柱体积的Buffer B洗脱，去上清，3次；2倍柱体积的Buffer A洗脱，去上清，2次；与镍柱等体积的Buffer C洗脱表达蛋白，保留上清，反复洗脱5次；

[0066] (4)纯化蛋白的鉴定：将每次洗脱的蛋白各取15μL，与等量的2×电泳加样缓冲液混合，经SDS-PAGE电泳，一部分经考马斯亮蓝染色，观察纯化情况，另一部分转膜，进行Western blot鉴定。

[0067] 以HPV18型L1/E7为例：通过上述病毒壳体抗原的制作方法，使用重组杆状病毒在昆虫sf9细胞中表达将HPV16E7蛋白质的氨基酸12～20、49～57、82～90、86～93的序列插入HPV16L1蛋白质的氨基酸140/141间而得到的嵌合蛋白质，制作了嵌合VLP，分别命名为：Ch12/20、Ch49/57、Ch82/90、Ch86/93。电子显微镜照片显示各嵌合VLP形成了粒子。在以这些嵌合VLP作为抗原的ELISA中显示：针对插入表位的抗体特异性地结合，表位被呈递在VLP表面。结果如表2所示。

[0068] 表2、抗E7-肽抗体与嵌合VLP的结合

[0069]

[0070] 其中，各肽抗原用血清1:500稀释，HPV18L1VLP用血清1：2000稀释用上述嵌合VLP免疫兔，得到抗血清。抗血清的制备与前述的方法相同（但嵌合病毒壳体的1次施用量为50μg，施用TiterMax(美国TiterMax公司生产)作为佐剂）。在以与交叉反应性表位具有相同序列的合成肽作为抗原的ELISA中，各抗血清与插入表位特异性地反应。结果如表3所示。86/93的肽容易凝集，在ELISA平板上的结合量少，因而与其它2个的结果相比，显示低效价。

[0071] 表3、抗嵌合VLP抗体（血清）与E7肽的结合

[0072]

[0073] 表中的数值为ELISA中的吸光度，其中，各肽抗原用血清1：500稀释，HPV18L1VLP用血清1：2000稀释。

[0074] 感染性假病毒制作

[0075] 1)对于293FT细胞，使用HPV18L1蛋白质表达质粒、HPV18E7蛋白质表达质粒、分泌型碱性磷酸酶表达质粒通过Fugene HD进行了转染。转染72小时后，回收细胞；

[0076] 2)将 回 收 的 细 胞 悬 浮 于 洗 涤 剂 缓 冲 液（Detergent buffer）（含0.5%Briji58,0.5%Benzonase,1%ATP依 赖 性 质 粒 安 全 外 切 核 酸 酶 C（1%ATP dependentplasmid safe exonuclease C）的D-PBS（CaCl21mM,MgCl210mM））中，37℃静置一夜；

[0077] 3)4℃、静置10分钟后，添加5M NaCl使得NaCl终浓度为850mM；

[0078] 4)1500g离心10分钟，回收上清；

[0079] 5)将回收的上清加载27%，33%，39%的optiprep(AXIS-SHIELD PoCAS制造)溶液（用PBS稀释）之上，50000rpm、16℃超离心3小时

[0080] 6)超离心后，从底面对级分进行回收，一次回收约300μl，将效价最高的级分作为感染性假病毒级分用于感染实验。

[0081] 中和实验

[0082] 1)中和实验前一天，在96孔细胞培养用平板上播种10000个/孔的293FT细胞（购自Invitrogen公司）；

[0083] 2)用Neautralization Buffer（在除去酚红的DMEM培养基中添加10%FCS、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酸、10mM HEPES而得）稀释血清，并与感染性假病毒混合，4℃反应1小时，将其添加于前一天播种的293FT细胞；

[0084] 3)培养约72小时后，回收上清20μl，采用Roden等的方法测定碱性磷酸酶活性。

[0085] 采用上述方法，考察了HPV16、18、31、35、52、58型假病毒的中和活性。结果如表4所示。抗Ch12/20的抗体中和了16、18、31型，抗Ch49/57的抗体中和了全部的6个类型，抗Ch82/90的抗体中和了16、18、31、58型，抗Ch86/93的抗体中和了16、18、31、52型。作为比较的抗HPV16VLP中和了16、31、35型。

[0086] 表4、抗-嵌合VLP血清对HPV16，18，31，35，52，58中和中和效价

[0087]