中性树枝状高分子材料在制备药物载体中的应用

摘要

本发明公开了中性树枝状高分子材料在制备药物载体中的应用。所述中性树枝状高分子材料具体可为式I所示化合物，式I中，n为0-128之间的任一数值。本发明提供的树枝状高分子材料具有pH敏感性，在生理条件下呈中性，而在低pH时PAMAM内部的三级胺会质子化变为正电性材料。其独特性质使得这种中性树枝状材料在pH5的条件下可以复合siRNA，而后通过PAMAM表面酰肼基团间的交联将siRNA固定其中并形成稳定的递送系统。本发明提供的交联复合物，具有良好的稳定性、安全性和可控性，从而克服阳离子高分子或阳离子脂质材料的局限。基于中性树枝状材料的交联递送颗粒显示出优于传统递送系统的潜力，并在基因治疗领域有着广阔的应用前景。

权利要求

1.中性树枝状高分子材料在制备药物载体的应用；

所述中性树枝状高分子材料为式Ⅰ所示化合物；

式Ⅰ；

式Ⅰ中，n=15、23或40；所述药物为核酸药物。

2.一种药物载体，它的活性成分为中性树枝状高分子材料；

所述中性树枝状高分子材料为式Ⅰ所示化合物；

式Ⅰ；

式Ⅰ中，n=15、23或40；所述药物为核酸药物。

3.中性树枝状高分子材料在制备复合药物中的应用；

所述中性树枝状高分子材料为式Ⅰ所示化合物；

式Ⅰ；

式Ⅰ中，n为15、23或40；所述药物为核酸药物。

4.一种复合药物，它的活性成分为中性树枝状高分子材料和药物的复合物；

所述中性树枝状高分子材料为式Ⅰ所示化合物；

式Ⅰ；

式Ⅰ中，n为15、23或40；所述药物为核酸药物。

5.式Ⅰ所示化合物；

式Ⅰ；

式Ⅰ中，n为15、23或40。

说明书

中性树枝状高分子材料在制备药物载体中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及中性树枝状高分子材料在制备药物载体中的应用。

背景技术

[0002] RNA干扰(RNAi)是细胞内由小分子RNA诱发的特定基因表达水平下调的一种现象，通过转录后沉默的机制完成。其中，小干扰RNA(siRNA)是引发RNAi的有效分子之一，具有互补双链的结构，每条链由21-23个核苷酸组成。化学合成siRNA技术的建立不仅为基础研究提供了有力的工具，更为今后的临床治疗手段带来新的前景。然而，siRNA容易被降解、不易穿过细胞膜以及相对分子量较大等性质制约了其在医疗领域的进一步发展，亟待安全有效的递送系统的建立。

[0003] 目前，很多材料和方法上的研究都集中于构建纳米级siRNA递送体系的探索上。研究表明，减小递送材料的毒性和副作用，同时保证siRNA递送体系的稳定性和转染效率是优化其体内效果时最首要的问题，因此探索在整体上解决这些问题的策略就显得非常重要了。

[0004] 类似于DNA递送领域的发展，目前对于siRNA非病毒载体的研究主要集中于阳离子载体材料，包括阳离子高分子和阳离子脂质。这些阳离子材料都可以在生理条件下的水溶液中直接通过静电作用与siRNA复合形成递送颗粒。通过对材料结构和性质的改性，很多研究也致力于调控给药颗粒的尺寸、稳定性、毒性和靶向性等方面的性能，从而改进其在医疗领域的应用前景。但是正电性成分自身的性质使得阳离子材料具有一些内在的缺陷。其一，阳离子成分(如可在生理条件下质子化的一级胺)往往会引起细胞毒性问题，阳离子可能造成细胞膜的损坏、凋亡通路的激活以及培养基成分的损失。第二，阳离子材料和siRNA之间的静电作用并不稳定，由此形成的聚电解质颗粒容易被环境因素所影响，在高盐离子强度或者强剪切力的情况下变得松散或变形，不能持久维持给药体系的结构和性能。
例如已有研究表明，siRNA与聚丙烯亚胺(PPI)的复合颗粒在磷酸缓冲液(PBS)环境中的
48小时内粒径发生了明显的改变。而随着聚电解质颗粒在缓冲液环境中放置时间的增长，其转染效率也有显著的下降。其三，由于至今没有明确的机理可以定向地破坏静电作用，所以siRNA从聚电解质颗粒中的释放依然是不可控制的过程。这些阳离子给药系统难以避免的缺陷严重制约了基因药物在医疗领域的发展。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供中性树枝状高分子材料在制备药物载体中的应用。

[0006] 本发明首先保护中性树枝状高分子材料在制备药物载体中的应用。

[0007] 所述中性树枝状高分子材料为如下(a)或(b)：(a)将带氨基的阳离子树枝状高分子材料依次进行酰肼化和糖基化得到的中性树枝状高分子材料；(b)将带氨基的阳离子树枝状高分子材料进行酰肼化得到的中性树枝状高分子材料。

[0008] 所述中性树枝状高分子材料具体可为式I所示化合物。

[0009]

[0010] 式I中，n为0-128之间的任一数值。

[0011] 通过材料合成中控制投料比可以控制n的数值。

[0012] n具体可为10-50之间的任一数值，更具体可为15-40之间的任一数值，如15、23或40。

[0013] 所述药物具体可为核酸药物，如siRNA药物。

[0014] 本发明还保护一种药物载体，它的活性成分为中性树枝状高分子材料。

[0015] 所述中性树枝状高分子材料为如下(a)或(b)：(a)将带氨基的阳离子树枝状高分子材料依次进行酰肼化和糖基化得到的中性树枝状高分子材料；(b)将带氨基的阳离子树枝状高分子材料进行酰肼化得到的中性树枝状高分子材料。

[0016] 所述中性树枝状高分子材料具体可为式I所示化合物。式I中，n具体可为10-50之间的任一数值，更具体可为15-40之间的任一数值，如15、23或40。

[0017] 所述药物具体可为核酸药物，如siRNA药物。

[0018] 本发明还保护中性树枝状高分子材料在制备药物中的应用。

[0019] 所述中性树枝状高分子材料为如下(a)或(b)：(a)将带氨基的阳离子树枝状高分子材料依次进行酰肼化和糖基化得到的中性树枝状高分子材料；(b)将带氨基的阳离子树枝状高分子材料进行酰肼化得到的中性树枝状高分子材料。

[0020] 所述中性树枝状高分子材料具体可为式I所示化合物。式I中，n具体可为10-50之间的任一数值，更具体可为15-40之间的任一数值，如15、23或40。

[0021] 所述药物具体可为核酸药物，如SiRNA药物。

[0022] 本发明还保护一种复合药物，它的活性成分为中性树枝状高分子材料和药物的复合物。

[0023] 所述中性树枝状高分子材料为如下(a)或(b)：(a)将带氨基的阳离子树枝状高分子材料依次进行酰肼化和糖基化得到的中性树枝状高分子材料；(b)将带氨基的阳离子树枝状高分子材料进行酰肼化得到的中性树枝状高分子材料。

[0024] 所述中性树枝状高分子材料具体可为式I所示化合物。式I中，n具体可为10-50之间的任一数值，更具体可为15-40之间的任一数值，如15、23或40。

[0025] 所述药物具体可为核酸药物，如siRNA药物。

[0026] 所述复合物具体可采用如下方法制备：将所述中性树枝状高分子材料和所述药物置于同一酸性(pH5.0)交联反应体系中，所述药物与所述中性高分子材料发生静电吸附且所述中性高分子材料之间发生交联反应，得到所述复合物。

[0027] 所述交联反应中，具体可以以戊二醛为交联剂。

[0028] 本发明还保护式I所示化合物。n具体可为10-50之间的任一数值，更具体可为15-40之间的任一数值，如15、23或40。

[0029] 本发明中，将带氨基的阳离子树枝状高分子材料进行如下改造：用酰肼基团和乙酰化半乳糖(GalNAc)替代表面的氨基，得到了中性糖基化高分子材料(PAMAM衍生物)。本发明提供的PAMAM衍生物，具有良好的稳定性、安全性和可控性，从而克服阳离子高分子或阳离子脂质材料的局限。本发明提供的PAMAM衍生物具有pH敏感性，在生理条件下呈中性，而在低pH时PAMAM内部的三级胺会质子化变为正电性材料，能够在pH5的条件下通过静电作用与siRNA形成复合物。采用戊二醛为交联剂，将PAMAM衍生物与siRNA的静电复合物进行表面酰肼基团的交联，可以得到具有良好细胞相容性的交联的siRNA递送体系，其性质可以由GalNAc修饰程度和交联条件进行精细调节。体外细胞摄取实验和RNA干扰实验表明，具有合适GalNAc修饰度的交联递送体系可以有效地与人类肝癌细胞HepG2相互作用并特异性地干扰靶基因的表达水平。基于树枝状高分子的中性交联递送系统为设计安全靶向的siRNA递送体系提供了新的思路和方法，为体内的非病毒基因递送系统提供了创新的思路，并在基因治疗领域有着广阔的应用前景。

附图说明

[0030] 图1为GPH-15的核磁分析图谱。

[0031] 图2为GPH-23的核磁分析图谱。

[0032] 图3为GPH-40的核磁分析图谱。

[0033] 图4为中性树枝状高分子材料/siRNA颗粒的交联与靶向输送示意图。

[0034] 图5为不同配比时PAMAM-HYD和GPH与siRNA的复合能力。

[0035] 图6为不同配比时PAMAM-HYD和GPH与siRNA的复合物的zeta电势。

[0036] 图7为不同戊二醛浓度时PAMAM-HYD对siRNA的负载能力；(A)pH5.0；(B)pH7.4。

[0037] 图8为不同戊二醛浓度时PAMAM-HYD/siRNA交联颗粒的粒径。

[0038] 图9为不同树枝状高分子材料在交联体系下对siRNA的负载能力。

[0039] 图10为采用各种树枝状高分子材料交联颗粒对siRNA的包封率。

[0040] 图11为采用各种树枝状高分子材料得到的交联颗粒的粒径。

[0041] 图12为采用各种树枝状高分子材料得到的交联颗粒的zeta电势。

[0042] 图13为不同浓度G5.0PAMAM和PAMAM-HYD的细胞毒性检测。

[0043] 图14为树枝状高分子材料/siRNA交联颗粒的细胞毒性检测。

[0044] 图15为HepG2细胞中特异于荧光素酶的RNA干扰效率的检测。

[0045] 图16为HepG2细胞中阴性对照序列siRNA的干扰效率的检测。

[0046] 图17为细胞对树枝状高分子材料(A-D)和siRNA递送体系(E-H)的摄取；树枝状高分子材料由荧光素标记(绿色)，siRNA由Cy3标记(红色)，细胞核由DAPI染色(蓝)；A和E：PAMAM-HYD；B和F：GPH-15；C和G：GPH-23；D和H：GPH-40。

具体实施方式

[0047] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。统计结果按照平均值±标准误差的形式给出，统计学比较结果由SigmaStat3.5软件根据单因素方差分析中的Newman-Keuls检测给出，显著性水平设为P＜0.05和P＜0.01，分别用*和**标识。

[0048] 实验用水为经过蒸馏和离子交换处理的18兆欧水(格兰特，石家庄，中国)。G4.0聚酰胺-胺(G4.0PAMAM)、G5.0聚酰胺-胺(G5.0PAMAM)、丙烯酸甲酯、N-乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、己二酸二酰肼(ADH)和焦碳酸二乙酯(DEPC)从Sigma-Aldrich(Milwaukee，WI)购买。一水合肼(N2H4·H2O)从Alfa Aesar(Ward Hill，MA)购买。Gene Finder核酸染料从百维信生物公司(厦门，中国)购买。N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素和BCA蛋白检测试剂盒从Pierce(Rockford，IL)购买。荧光素酶表达质粒pGL4.51(luc2/CMV/Neo)载体(简称pGL4.51质粒)、CellTiter AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(MTS)、Glo裂解液TM和Glo 萤光素酶检测系统从Promega(Madison，WI)购买。细胞培养试剂和商用转染试剂Lipofectamine 2000从Invitrogen(Carlsbad，CA)购买。人类肝癌细胞(HepG2)购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。

[0049] 实施例1、合成酰肼化PAMAM和糖修饰的酰肼化PAMAM

[0050] 1、合成酰肼化PAMAM(PAMAM-HYD)

[0051] PAMAM-HYD的制备是以商业化的G4.0PAMAM为起始原料，先合成出G4.5PAMAM，然后再在其表面衍生出酰肼基团，具体步骤如下：

[0052] (1)将G4.0PAMAM溶于甲醇，得到G4.0PAMAM溶液。

[0053] (2)在冰浴搅拌下，缓慢将丙烯酸酯加入到浓度为50mg/ml的G4.0PAMAM溶液中，在37℃水浴中反应48h(G4.0PAMAM与丙烯酸甲酯的摩尔比为1∶640，丙烯酸甲酯过量)，之后在65℃下通过悬蒸去除溶剂和未反应的丙烯酸甲酯，得到G4.5PAMAM，真空干燥后4℃存储。

[0054] (3)将G4.5PAMAM用乙醇溶解成50mg/ml的溶液，与一水合肼在55℃下回流反应24小时(G4.5PAMAM与一水合肼的摩尔比为1∶1280)，得到PAMAM-HYD，通过悬蒸除掉溶剂，用水重新溶解后经截留分子量为10000的透析袋透析后冻干，保存于-20℃。

[0055] 2、合成糖修饰的酰肼化PAMAM(GalNAc-PAMAM-HYD，缩写为GPH)

[0056] GPH的制备的具体步骤如下：

[0057] (1)将PAMAM-HYD用pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液溶解成10mg/ml溶液。

[0058] (2)将步骤(1)的溶液与GalNAc在50℃水浴中反应24小时(PAMAM-HYD与GalNAc的摩尔比为1∶64)，用截留分子量10000的透析袋透析后冻干，通过核磁分析表征GalNAc的修饰度，修饰度为11.8％，根据PAMAM表面GalNAc的平均个数，将该产物命名为GPH-15。

[0059] GPH-15的 核 磁 分 析 图 谱 见 图 1，具 体 数 据 如 下：δ2.1(GalNAc 部分 中 的 -CH3CONH-，3H)，δ2.6(PAMAM-HYD 骨 架 中 的 -NCH2CH2CO-，504H)。

[0060] (3)将步骤(1)的溶液与GalNAc在50℃水浴中反应24小时(PAMAM-HYD与GalNAc的摩尔比为1∶128)，用截留分子量10000的透析袋透析后冻干，通过核磁分析表征GalNAc的修饰度，修饰度为18.4％，根据PAMAM表面GalNAc的平均个数，将该产物命名为GPH-23。

[0061] GPH-23的核磁分析图谱见图2，具体数据如下：δ2.1(GalNAc部分的-CH3CONH-，3H)，δ2.6(PAMAM-HYD骨架的-NCH2CH2CO-，504H)。

[0062] (4)将步骤(1)的溶液与GalNAc在50℃水浴中反应24小时(PAMAM-HYD与GalNAc的摩尔比为1∶192)，用截留分子量10000的透析袋透析后冻干，通过核磁分析表征GalNAc的修饰度，修饰度为31.5％，根据PAMAM表面GalNAc的平均个数，将该产物命名为GPH-40。

[0063] GPH-40的核磁分析图谱见图3，具体数据如下：δ2.1(GalNAc部分的-CH3CONH-，3H)，δ2.6(PAMAM-HYD骨架的-NCH2CH2CO-，504H)。

[0064] 3、GPH的结构分析

[0065] 步骤1和步骤2中以胺基表面的第四代PAMAM为原料，衍生出128个分枝、表面带有酰肼基团和单糖的树枝状高分子材料，如式(I)所示。式(I)所示的树枝状高分子材料中，酰肼基团和三级胺的pKa值都低于7，在生理条件下为中性不带电荷的，可用于构建可交联的siRNA递送系统。乙酰化半乳糖(GalNAc)可用作靶向配体去识别唾液酸糖蛋白(ASGPR)从而促进内吞介导的递送过程。当环境pH变为酸性时，理论上式(I)所示的树枝状高分子材料的酰肼基团和三级胺将吸附质子，从而变成可以通过静电作用结合siRNA的“阳离子”材料。以戊二醛为交联剂，与PAMAM材料表面的酰肼基团反应，可将式(I)所示的树枝状高分子材料与siRNA复合形成的颗粒进行交联，得到在生理条件下呈中性的siRNA递送颗粒，实现对肝癌细胞的靶向递送。树枝状高分子材料与siRNA复合颗粒的交联与靶向输送示意图见图4。

[0066]

[0067] GPH-15、GPH-23和GPH-40中，n分别为15、23或40。

[0068] 实施例2、siRNA的制备

[0069] 设计特异于火蝇荧光素酶序列的siRNA(siLuc；由正义链和反义链组成)：

[0070] 正义链(序列表的序列1)：5’-UGAAGAGCCUGAUCAAAUA dTdT-3’；

[0071] 反义链(序列表的序列2)：3’-dTdT ACUUCUCGGACUAGUUUAU-5’。

[0072] siRNA由广州锐博生物有限公司(广州，中国)合成。

[0073] 设计作为阴性对照的siRNA(siN.C.；由正义链和反义链组成)

[0074] 正义链(序列表的序列3)：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU dTdT-3’

[0075] 反义链(序列表的序列4)：3’-dTdTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5’

[0076] siRNA由广州锐博生物有限公司(广州，中国)合成。

[0077] 实施例3、不同配比时树枝状高分子材料与siRNA的复合能力及复合颗粒的表征[0078] 分别检测实施例1制备的树枝状高分子材料(G4.5PAMAM、PAMAM-HYD、GPH-15、GPH-23或GPH-40)与实施例2制备的siRNA(siLuc)的复合能力，具体步骤如下：

[0079] 1、siRNA用DEPC水溶解成20μM的储液，即siRNA储液，使用时用pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液(或pH7.4-10mM的磷酸缓冲液)稀释为浓度为0.2μM的siRNA溶液。

[0080] 2、将树枝状高分子材料分别溶于pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液(或pH7.4-10mM的磷酸缓冲液)。

[0081] 3、检测游离siRNA浓度

[0082] 通过核酸染料排斥实验(Gene Finder Exclusion Assay)定量分析体系中未被复合的游离siRNA。

[0083] 实验组：将50μl步骤1的siRNA溶液与1μl Gene Finder核酸染料混合，然后与50μl步骤2的溶液混合；设置不同的实验组，使树枝状高分子材料与siRNA的摩尔比分别为0.7∶1、1.3∶1、2.0∶1、2.6∶1或3.3∶1；

[0084] 对照组：将50μl步骤1的siRNA溶液与1μl Gene Finder核酸染料混合，然后与50μl pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液(或pH7.4-10mM的磷酸缓冲液)混合；

[0085] 将实验组和对照组室温孵育20分钟后检测荧光信号。荧光信号强度由SpectraMax M2读板机(Molecular Devices，CA)检测(激发光：488nm；发射光：522nm)。

[0086] 对照组和各个实验组的荧光信号检测结果见表1。

[0087] 表1对照组和各个实验组的荧光信号检测结果

[0088]

[0089] 将各个实验组的荧光信号与相应对照组的荧光信号的比值作为未复合siRNA的相对含量，见图5。在pH 7.4条件下所有树枝状高分子材料都没有表现出与siRNA的复合能力。在pH 5.0的条件下，随着树枝状高分子材料的增加，体系中可检测到的siRNA在逐渐减少，当树枝状高分子材料与siRNA的摩尔比达到3.3时，siRNA的复合效率已接近90％。值得注意的是，树枝状高分子材料在酸性条件下与siRNA的复合能力没有受到糖修饰的影响，说明复合过程并不依赖于PAMAM表面的糖修饰。

[0090] 4、siRNA用DEPC水溶解成20μM的储液，即siRNA储液，使用时用pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液(或pH7.4-10mM的磷酸缓冲液)稀释为浓度为2μM的siRNA溶液。

[0091] 5、检测zeta电势

[0092] 将60μl步骤4的siRNA溶液与60μl步骤2的溶液混合，使树枝状高分子材料与siRNA的摩尔比为1.7∶1，室温孵育20分钟后，用去离子水稀释到1.2ml，用ZetaPALS(Brookhaven Instruments，NY)检测其zeta电势。

[0093] 结果见图6。结果表明：在pH5.0的环境中，树枝状高分子材料与siRNA的混合物表现出明显的正电性，zeta电势在12-15mV的范围内；而在pH 7.4的环境中，这些二元复合物均呈现较弱的负电性。

[0094] 实施例4、基于树枝状高分子材料的递送颗粒的构建及表征

[0095] 为了制备交联的siRNA递送系统，选用戊二醛作为交联剂添加到PAMAM-HYD与siRNA的混合体系，用以交联树枝状高分子表面的酰肼基团。在酸性条件下，三元混合物中，siRNA与树枝状高分子通过静电作用形成复合物，同时复合物中的酰肼基团会被戊二醛所交联，从而将siRNA固定在该复合体系中。交联反应的终止可以通过两个步骤完成：升高pH至中性使静电作用消失，加入过量的ADH来封闭未反应的醛基。

[0096] 分别用实施例1制备的树枝状高分子材料(PAMAM-HYD、GPH-15、GPH-23或GPH-40)与实施例2制备的siRNA制备交联颗粒，具体步骤如下：

[0097] 一、不同戊二醛浓度时PAMAM-HYD对siRNA的负载能力

[0098] 1、siLuc用DEPC水溶解成20μM的储液，即siRNA储液，使用时用pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液(或pH7.4-10mM的磷酸缓冲液)稀释为siRNA溶液。

[0099] 2、将树枝状高分子材料PAMAM-HYD溶于pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液(或pH7.4-10mM的磷酸缓冲液)，得到树枝状高分子材料溶液；将戊二醛溶于pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液(或pH7.4-10mM的磷酸缓冲液)，得到戊二醛溶液。

[0100] 3、将5μl戊二醛溶液与5μl 2μM siRNA溶液混合，然后加入5μl树枝状高分子材料溶液，即为反应体系；设置若干个反应体系，各个反应体系中树枝状高分子材料与siRNA的摩尔比均为1.7∶1，各个反应体系中的戊二醛浓度分别为0.17mM、0.33mM、0.50mM、0.67mM、0.83mM、1.7mM、3.3mM、5.0mM、6.7mM、8.3mM、17mM、33mM、50mM、67mM 或
83mM；同时设置pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液(或pH7.4-10mM的磷酸缓冲液)作为戊二醛溶液的对照，即反应体系中戊二醛浓度为0mM；同时设置2μMsiRNA溶液作为反应体系的对照；将各个反应体系37℃反应1小时，而后加入10倍于戊二醛的ADH来停止交联反应，用
0.2M NaOH水溶液调节反应体系pH至7，取样进行3.5％琼脂糖凝胶电泳，用天能-1600凝胶成像仪(上海天能科技有限公司，中国)进行成像。

[0101] 结果见图7，A为pH5.0条件下反应后样品的电泳图；B为pH7.4条件下部分反应后样品的电泳图。在pH5.0条件下，增加戊二醛在反应体系中的浓度时，电泳可检测到的游离siRNA条带逐渐变弱，在8.3mM以及更高的戊二醛浓度下，siRNA的条带基本消失不见，说明siRNA可以通过交联有效被固定在树枝状高分子体系内部。相比之下，在pH 7.4的条件下，siRNA在反应体系中始终处于游离状态，没有形成戊二醛、siRNA和树枝状高分子的交联颗粒。

[0102] 二、不同戊二醛浓度时PAMAM-HYD/siRNA交联颗粒的表征

[0103] 1、siLuc用DEPC水溶解成20μM的储液，即siRNA储液，使用时用pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液稀释为siRNA溶液。

[0104] 2、将PAMAM-HYD溶于pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液，得到PAMAM-HYD溶液；将戊二醛溶于pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液，得到戊二醛溶液。

[0105] 3、将60μl戊二醛溶液与60μl 2μM siRNA溶液混合，然后加入60μl PAMAM-HYD溶液，即为反应体系；设置若干个反应体系，各个反应体系中树枝状高分子材料与siRNA的摩尔比均为1.7∶1，各个反应体系中的戊二醛浓度分别为0.83mM、8.3mM、83mM或833mM；将各个反应体系37℃反应1小时，而后加入10倍于戊二醛的ADH来停止交联反应，用0.2M NaOH水溶液调节反应体系pH至7，用去离子水稀释10倍后用ZetaPALS(Brookhaven Instruments，NY)在90°检测粒径。

[0106] 结果见图8。通过调节戊二醛的浓度，可以得到微米和纳米尺寸的颗粒。在所检测的浓度范围内，随着戊二醛浓度的升高，交联颗粒的尺寸经历了先增高再降低的变化，在中等戊二醛浓度下(8.3mM)得到了直径4μm左右的颗粒，而在更高戊二醛浓度下(83mM)得到了直径230nm左右的颗粒。

[0107] 三、糖修饰的树枝状高分子GPH对siRNA的负载能力

[0108] 1、siLuc用DEPC水溶解成20μM的储液，即siRNA储液，使用时用pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液稀释为siRNA溶液。

[0109] 2、将树枝状高分子材料(PAMAM-HYD、GPH-15、GPH-23或GPH-40)溶于pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液，得到树枝状高分子材料溶液；将戊二醛溶于pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液，得到戊二醛溶液。

[0110] 3、将5μl 25mM戊二醛溶液与5μl 2μM siRNA溶液混合，然后加入5μl树枝状高分子材料溶液，即为反应体系；反应体系中树枝状高分子材料与siRNA的摩尔比为1.7∶1；同时设置pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液作为戊二醛溶液的对照，即反应体系中戊二醛浓度为0mM；同时设置2μM siRNA溶液作为反应体系的对照；将反应体系在37℃反应1小时，而后加入10倍于戊二醛的ADH来停止交联反应，用0.2M NaOH水溶液调节反应体系pH至7，取样进行3.5％琼脂糖凝胶电泳，用天能-1600凝胶成像仪(上海天能科技有限公司，中国)进行成像。

[0111] 结果见图9。结果表明，在加入戊二醛作为交联剂的情况下，采用各种树枝状高分子材料(PAMAM-HYD、GPH-15、GPH-23或GPH-40)，反应体系中均只有少量的游离siRNA，绝大部分siRNA已经被包封在树枝状高分子材料内部。

[0112] 4、将5μl 25mM戊二醛溶液与5μl 2μM siRNA溶液混合，然后加入5μl树枝状高分子材料溶液，即为反应体系；反应体系中树枝状高分子材料与siRNA的摩尔比为1.7∶1；同时设置pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液作为树枝状高分子材料溶液的对照；将反应体系37℃反应1小时，而后加入10倍于戊二醛的ADH来停止交联反应，用0.2M NaOH水溶液调节反应体系pH至7，用pH7.4-10mM的磷酸缓冲液稀释到100μl，然后加入1μl GeneFinder核酸染料，检测荧光强度。荧光强度由SpectraMax M2读板机(Molecular Devices，CA)检测(激发光：488nm；发射光：522nm)。

[0113] 采用各种树枝状高分子材料的检测结果见表2。将各个实验组的荧光信号与相应对照组的荧光信号的比值作为未复合siRNA(游离siRNA)的相对含量，见表2。

[0114] 表2采用各种树枝状高分子材料的检测结果

[0115]采用的树枝状高分子材料 荧光信号 未复合siRNA的相对含量
对照 565.5 100％
PAMAM-HYD 35.9 6.4％
GPH-15 66.3 11.6％
GPH-23 74.1 13.0％
GPH-40 118.3 20.7％

[0116] siRNA相对包封率(负载率)＝1-未复合siRNA的相对含量。采用各种树枝状高分子材料的siRNA包封率见图10。各种树枝状高分子材料(PAMAM-HYD、GPH-15、GPH-23或GPH-40)对siRNA的负载率在79％到94％的范围内，负载率随着树枝状高分子材料上糖修饰度的增加而降低，很可能是因为糖的修饰减少了可交联的酰肼基团，造成交联程度降低。

[0117] 四、糖修饰的树枝状高分子GPH/siRNA交联颗粒的表征

[0118] 1、siLuc用DEPC水溶解成20μM的储液，即siRNA储液，使用时用pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液稀释为siRNA溶液。

[0119] 2、将树枝状高分子材料(PAMAM-HYD、GPH-15、GPH-23或GPH-40)溶于pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液，得到树枝状高分子材料溶液；将戊二醛溶于pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液，得到戊二醛溶液。

[0120] 3、将5μl 25mM戊二醛溶液(步骤2制备的)与5μl 2μM siRNA溶液(步骤1制备的)混合，然后加入5μl树枝状高分子材料溶液(步骤2制备的)，即为反应体系；反应体系中树枝状高分子材料与siRNA的摩尔比为1.7∶1；将反应体系37℃反应1小时，而后加入10倍于戊二醛的ADH来停止交联反应，用0.2M NaOH水溶液调节反应体系pH至7，用去离子水稀释10倍后用ZetaPALS(Brookhaven Instruments，NY)在90°检测粒径。

[0121] pH5.0条件下，采用各种树枝状高分子材料得到的交联颗粒的粒径见图11。交联颗粒的尺寸随着树枝状高分子材料糖修饰度的提高而降低，采用GPH-23和GPH-40得到的交联颗粒的粒径在200nm左右，远小于采用PAMAM-HYD和GPH-15得到的交联颗粒的粒径。

[0122] 4、将5μl 25mM戊二醛溶液(步骤2制备的)与5μl 2μM siRNA溶液(步骤1制备的)混合，然后加入5μl树枝状高分子材料溶液(步骤2制备的)，即为反应体系；反应体系中树枝状高分子材料与siRNA的摩尔比为1.7∶1；将反应体系37℃反应1小时，而后加入10倍于戊二醛的ADH来停止交联反应，用0.2M NaOH水溶液调节反应体系pH至7，用去离子水稀释10倍后用ZetaPALS(Brookhaven Instruments，NY)检测其zeta电势。

[0123] 采用各种树枝状高分子材料得到的交联颗粒的zeta电势见图12。采用树枝状高分子材料PAMAM-HYD、GPH-15、GPH-23或GPH-40得到的交联颗粒在pH7.4的环境下均呈现为中性或略带负电性的表面，其zeta-potential值都在0-3mV的范围内，与采用阳离子材料G5.0PAMAM得到的颗粒具有明显的差异。因此，构建的交联颗粒可以被认为是生理条件下的中性递送载体。

[0124] 五、用于细胞实验的树枝状高分子材料/siRNA交联颗粒的制备

[0125] 分别用实施例1制备的树枝状高分子材料(PAMAM-HYD、GPH-15、GPH-23或GPH-40)与实施例2制备的siRNA(siLuc或siN.C.)制备交联颗粒，具体步骤如下：

[0126] 1、siRNA用DEPC水溶解成20μM的储液，即siRNA储液，使用时用pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液稀释为siRNA溶液。

[0127] 2、将树枝状高分子材料(PAMAM-HYD、GPH-15、GPH-23或GPH-40)溶于pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液，得到树枝状高分子材料溶液；将戊二醛溶于pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液，得到戊二醛溶液。

[0128] 3、将5μl 25mM戊二醛溶液与5μl 2μM siRNA溶液混合，然后加入5μl树枝状高分子材料溶液(用G5.0PAMAM作为树枝状高分子材料的对照)，即为反应体系；反应体系中树枝状高分子材料与siRNA的摩尔比为1.7∶1；将反应体系37℃反应1小时，而后加入10倍于戊二醛的ADH来停止交联反应，用0.2M NaOH水溶液调节反应体系pH至7，然后在pH7.4-10mM的磷酸缓冲液中透析，得到的产物即为树枝状高分子材料与siRNA的交联颗粒。

[0129] 得到如下八种交联颗粒：

[0130] PAMAM-HYD与siLuc的交联颗粒(siLuc负载率94％)、GPH-15与siLuc的交联颗粒(siLuc负载率88％)、GPH-23与siLuc的交联颗粒(siLuc负载率87％)和GPH-40与siLuc的交联颗粒(siLuc负载率79％)；

[0131] PAMAM-HYD与siN.C.的交联颗粒(siN.C.负载率94％)、GPH-15与siN.C.的交联颗粒(siN.C.负载率88％)、GPH-23与siN.C.的交联颗粒(siN.C.负载率87％)和GPH-40与siN.C.的交联颗粒(siN.C.负载率79％)。

[0132] 实施例5、树枝状高分子材料/siRNA的交联颗粒对目标蛋白的抑制效果[0133] 一、PAMAM-HYD细胞毒性的检测

[0134] 1、将人类肝癌细胞(HepG2细胞)在细胞试验的前一天以1.5×104个/孔的密度接种于96孔板。

[0135] 2、PAMAM-HYD细胞毒性的检测

[0136] PAMAM-HYD组：将实施例1制备的PAMAM-HYD溶解于DMEM培养基(分别设置如下几种浓度：1、5、10、20、30、60或90nmol/mL)，向步骤1的96孔板中每孔加入100μl后孵育24小时，然后将96孔板中每孔均换上新鲜的DMEM培养基，每孔加入20μl MTS试剂(CellTiter AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒的组件)，在37度5％二氧化碳的条件下孵育1小时，用读板机记录490nm处的吸收值。

[0137] 空白组：向96孔板中的空白孔加入100μl DMEM培养基后孵育24小时，然后将96孔板中每孔均换上新鲜的DMEM培养基，每孔加入20μl MTS试剂，在37度5％二氧化碳的条件下孵育1小时，用读板机记录490nm处的吸收值。

[0138] 对照组：向步骤1的96孔板中每孔加入100μl DMEM培养基后孵育24小时，然后将96孔板中每孔均换上新鲜的DMEM培养基，每孔加入20μl MTS试剂，在37度5％二氧化碳的条件下孵育1小时，用读板机记录490nm处的吸收值。

[0139] G5.0PAMAM组：将G5.0PAMAM溶解于DMEM培养基(分别设置如下几种浓度：1、5、10、20、30、60或90nmol/mL)，向步骤1的96孔板中每孔加入100μl后孵育24小时，然后将96孔板中每孔均换上新鲜的DMEM培养基，每孔加入20μl MTS试剂，在37度5％二氧化碳的条件下孵育1小时，用读板机记录490nm处的吸收值。

[0140] 空白组和对照组均设置六个复孔，其它各个处理均设三个复孔，结果见表3。

[0141] 表3各个处理的吸光值结果

[0142]

[0143]

[0144] 相对细胞活性结果(平均值)见图13。在肝癌细胞HepG2的体系中，PAMAM-HYD即使在浓度高达90nmol/ml的情况下也能保证高于80％的细胞成活率。正电性G5.0PAMAM则表现出显著的细胞毒性，在90nmol/ml的浓度下，仅有不足30％的成活率。

[0145] 二、树枝状高分子材料/siRNA交联颗粒的细胞毒性的检测

[0146] 分别采用实施例4的步骤五制备的各种交联颗粒(四种负载siLuc的交联颗粒)进行如下实验：

[0147] 1、将人类肝癌细胞(HepG2细胞)在细胞试验的前一天以1.5×104个/孔的密度接种于96孔板。

[0148] 2、细胞毒性的检测

[0149] 实验组：将交联颗粒溶解于含10％血清的DMEM培养基，使siRNA浓度均为50nmol/L，向步骤1的96孔板中每孔加入200μl后孵育48小时；然后将96孔板中每孔均换上新鲜的DMEM培养基，每孔加入20μl MTS试剂，在37度5％二氧化碳的条件下孵育1小时，用读板机记录490nm处的吸收值。

[0150] siRNA对照组：将实施例2的siRNA(siLuc)溶解于含10％血清的DMEM培养基，使其浓度为50nmol/L，向步骤1的96孔板中每孔加入200μl后孵育48小时；然后将96孔板中每孔均换上新鲜的DMEM培养基，每孔加入20μl MTS试剂，在37度5％二氧化碳的条件下孵育1小时，用读板机记录490nm处的吸收值。

[0151] 空白组：向96孔板中每孔加入200μl含10％血清的DMEM培养基后孵育48小时，然后将96孔板中每孔均换上新鲜的DMEM培养基，每孔加入20μl MTS试剂，在37度5％二氧化碳的条件下孵育1小时，用读板机记录490nm处的吸收值。

[0152] 对照组：向步骤1的96孔板中的对照组每孔加入200μl含10％血清的DMEM培养基(不含材料)后孵育48小时，然后将96孔板中每孔均换上新鲜的DMEM培养基，每孔加入20μl MTS试剂，在37度5％二氧化碳的条件下孵育1小时，用读板机记录490nm处的吸收值

[0153] 空白组的A490nm值为0.28，对照组的A490nm值为1.39，PAMAM-HYD/siRNA交联颗粒组的A490nm值为1.50，GPH-15/siRNA交联颗粒组的A490nm值为1.40，GPH-23/siRNA交联颗粒组的A490nm值为1.36，GPH-40/siRNA交联颗粒组的A490nm值为1.36。

[0154] 相对细胞活性结果(平均值)见图14。所有的实验组都获得了95％以上的细胞成活率，再次证明了树枝状高分子材料/siRNA交联颗粒(负载了siRNA的树枝状高分子材料交联体系)的安全性。

[0155] 三、RNA干扰实验

[0156] 分别采用实施例4的步骤五制备的各种交联颗粒(负载siLuc或siN.C.的交联颗粒)进行如下实验(采用转染试剂Lipofectamine 2000转染pGL4.51质粒)：

[0157] 1、将人类肝癌细胞(HepG2细胞)以1.5×104个/孔的密度接种于96孔板。

[0158] 2、按照lipofectamine说明书的步骤，向步骤1的96孔板中每孔转染0.2μg pGL4.51质粒，培养24小时(使HepG2细胞表达外源报告基因-荧光素酶基因)。

[0159] 3、将交联颗粒溶解于含10％血清的DMEM培养基并加入到步骤2的HepG2细胞中，每孔的交联颗粒加入量为：负载了10pmol siRNA(siLuc或siN.C.)的交联颗粒，培养48小时。

[0160] 4、除掉培养基，用Glo裂解液处理20分钟，荧光素酶基因表达水平用GloTM萤光素酶检测系统检测，细胞的总蛋白量用BCA检测试剂盒检测。

[0161] 设置无处理对照：在步骤3中，将含10％血清的DMEM培养基代替含有交联颗粒的含10％血清的DMEM培养基，其它同上。

[0162] 设置siRNA对照：在步骤3中，将实施例2制备的siRNA(siLuc或siN.C.)代替交联颗粒，剂量相等，其它同上。

[0163] 设置Lipofectamine对照：在步骤3中，借助转染试剂Lipofectamine 2000转染实施例2制备的siRNA(siLuc或siN.C.)，剂量相等，其它同上。

[0164] 在siLuc转染实验中：无处理对照组的荧光素酶基因表达水平为1.13×108RLU/8
mg蛋白，PAMAM-HYD与siLuc的交联颗粒的荧光素酶基因表达水平为1.11×10RLU/mg蛋
7
白，GPH-15与siLuc的交联颗粒的荧光素酶基因表达水平为8.13×10RLU/mg蛋白，GPH-23
7
与siLuc的交联颗粒的荧光素酶基因表达水平为5.26×10RLU/mg蛋白，GPH-40与siLuc
8
的交联颗粒的荧光素酶基因表达水平为1.03×10RLU/mg蛋白，siLuc对照组的荧光素酶基
8
因表达水平为1.03×10RLU/mg蛋白，Lipofectamine对照组的荧光素酶基因表达水平为
7
8.09×10RLU/mg蛋白。

[0165] 分别采用实施例4的步骤五制备的各种交联颗粒(负载siN.C.的交联颗粒)进行步骤1至4的实验，差别仅在于步骤2中每孔转染0.1μg pGL4.51质粒。

[0166] 在siN.C.转染实验中：无处理对照组的荧光素酶基因表达水平为4.06×106RLU/6
mg蛋白，PAMAM-HYD与siN.C.的交联颗粒的荧光素酶基因表达水平为4.03×10RLU/mg
6
蛋白，GPH-15与siN.C.的交联颗粒的荧光素酶基因表达水平为3.65×10RLU/mg蛋白，
6
GPH-23与siN.C.的交联颗粒的荧光素酶基因表达水平为3.48×10RLU/mg蛋白，GPH-40
6
与siN.C.的交联颗粒的荧光素酶基因表达水平为3.71×10RLU/mg蛋白，siRNA对照组的
6
荧光素酶基因表达水平为4.14×10RLU/mg蛋白，Lipofectamine对照组的荧光素酶基因表
6
达水平为3.65×10RLU/mg蛋白。

[0167] 以无处理对照的荧光素酶基因表达水平为1，计算各实验组的荧光素酶基因相对表达水平，结果见图15(siLuc)和图16(siN.C.)。在siLuc转染实验中，交联颗粒组和Lipofectamine对照组的细胞均表现出基因表达的下调效应。特别GPH-23/siRNA交联颗粒组得到了接近60％的基因沉默效率，在含血清的条件下显示出优越于传统商用转染试剂的性能。而在siN.C.转染实验中，处理组与对照组的基因表达水平并没有显著性差异，说明在siLuc实验中看到的荧光素酶基因的表达下调是由siLuc的递送特异地引发的。

[0168] 四、荧光显微镜观察树枝状高分子材料被细胞摄取的效率

[0169] 分别用实施例1制备的树枝状高分子材料(PAMAM-HYD、GPH-15、GPH-23或GPH-40)进行如下实验：

[0170] 1、将树枝状高分子材料(PAMAM-HYD、GPH-15、GPH-23或GPH-40)溶于DPBS，得到树枝状高分子材料溶液；

[0171] 2、将0.1mg/ml N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素水溶液与树枝状高分子材料溶液混合，N-羟基琥珀酰亚胺-荧光素与树枝状高分子材料的摩尔比为2∶1，37℃反应3小时；而后稀释于100μl DMEM培养液，加入到HepG2细胞中，孵育24小时；去除培养基，DPBS洗三次，然后在IX71荧光显微镜(Olympus，日本)下观察。细胞核由DAPI染色(蓝)。

[0172] 见图17的A(PAMAM-HYD)、B(GPH-15)、C(GPH-23)和D(GPH-40)。照片显示GPH-23和GPH-40组的荧光信号要明显强于PAMAM-HYD和GPH-15，表明HepG2细胞对于材料的摄取很可能是依赖于GalNAc与ASGPR的特异性相互作用。

[0173] 五、荧光显微镜观察交联颗粒被细胞摄取的效率

[0174] 1、荧光分子cy3标记的siRNA的制备

[0175] 荧光分子cy3(红色)标记的siRNA(cy3-siRNA)由广州锐博生物有限公司(广州，中国)合成，正义链和反义链的序列同实施例2中siLuc，在正义链的5’端标记荧光分子cy3。

[0176] 2、交联颗粒的制备

[0177] (1)cy3-siRNA用DEPC水溶解成20μM的储液，即cy3-siRNA储液，使用时用pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液稀释为cy3-siRNA溶液。

[0178] (2)将 树枝 状 高分 子 材料(PAMAM-HYD、GPH-15、GPH-23 或GPH-40)溶 于pH5.0-0.2M磷酸缓冲液，得到树枝状高分子材料溶液；将戊二醛溶于pH5.0-0.2M的磷酸缓冲液，得到戊二醛溶液。

[0179] (3)将5μl 25mM戊二醛溶液与5μl 2μM cy3-siRNA溶液混合，然后加入5μl树枝状高分子材料溶液，即为反应体系；反应体系中树枝状高分子材料与cy3-siRNA的摩尔比为1.7∶1；将反应体系37℃反应1小时，而后加入10倍于戊二醛的ADH来停止交联反应，用0.2M NaOH水溶液调节反应体系pH至7，然后在pH7.4-10mM的磷酸缓冲液中透析，得到的产物即为树枝状高分子材料/siRNA交联颗粒。

[0180] 得到如下四种交联颗粒：PAMAM-HYD/cy3-siRNA交联颗粒(siRNA负载率94％)、GPH-15/cy3-siRNA交联颗粒(siRNA负载率88％)、GPH-23/cy3-siRNA交联颗粒(siRNA负载率87％)和GPH-40/cy3-siRNA的交联颗粒(siRNA负载率79％)。

[0181] 3、荧光显微镜观察交联颗粒被细胞摄取的效率

[0182] 分别采用步骤2制备的各种交联颗粒(PAMAM-HYD/cy3-siRNA交联颗粒、GPH-15/cy3-siRNA交联颗粒、GPH-23/cy3-siRNA交联颗粒或GPH-40/cy3-siRNA的交联颗粒)进行如下实验：

[0183] 将交联颗粒(含10pmol cy3-siRNA)与HepG2细胞共同孵育12小时后在IX71荧光显微镜(Olympus，日本)下观察。细胞核由DAPI染色(蓝)。

[0184] 见图17的E(PAMAM-HYD)、F(GPH-15)、G(GPH-23)和H(GPH-40)。照片显示，随着树枝状高分子表面GalNAc修饰度的增加，进入细胞的cy3-siRNA的信号也逐渐增强，其中GPH-23/siRNA交联颗粒转染组的荧光信号最强，与步骤三中的转染实验结果相符。