贻贝酶解多肽及其制备方法和应用

摘要

一种贻贝酶解多肽，其特作在于包含如下氨基酸序列：Asp Leu Tyr。采用如下步骤制备：①取贻贝肉，制成均浆，添加碱性蛋白酶，灭酶后离心，取上层清液；②将上述的清液经过超过滤，收集分子量3K以下的水解液，浓缩并冷冻干燥；③DEAE-SepharoseFF离子柱交换柱色谱分离；④采用Sephadex G-25凝胶柱色谱分离；⑤高效液相色谱纯化。本发明还公开了通过上述步骤制备所得的贻贝酶解多肽在抗前列腺癌上的应用。与现有技术相比，本发明的优点在于：采用最佳的蛋白酶和优选的工艺对贻贝进行酶解纯化，将所得的目标肽应用于抗前列腺癌细胞上产生了很强的细胞抑制增殖作用，为抗前列腺癌提供了一条可行性研究途径。

权利要求

1.一种贻贝酶解多肽，其特征在于包含如下氨基酸序列：

Asp Leu Tyr；并且，贻贝酶解多肽通过如下步骤制得

①取贻贝肉，制成均浆，调节pH值9.5～10，料液比为1∶2～1∶3，添加碱性蛋白酶，加酶量为1500～2000U/g，酶解时间为6～8小时，酶解温度为45～50℃，灭酶后离心，取上层清液；

②将上述的清液经过超滤，收集分子量3K以下的水解液，浓缩并冷冻干燥；

③DEAE-SepharoseFF离子柱交换柱色谱分离，将步骤②中的冷冻干燥后产物通过DEAE-SepharoseFF离子柱交换柱，0.1～1mol/LNaCL梯度洗脱，洗脱速度1～1.5mL/min，蛋白检测仪280nm进行检测，对各洗脱峰分别进行收集，浓缩后冷冻干燥，将干燥后得到的各个峰组分采用MTT法进行抗肿瘤活性实验，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，浓缩并冷冻干燥；

④采用Sephadex G-25凝胶柱色谱分离，将步骤③所得的具有最高抗肿瘤活性的冷冻干燥后产物过Sephadex G-25凝胶柱，流动相为蒸馏水，流速为1.5～2mL/min，蛋白检测仪

280nm进行检测，对各洗脱峰分别进行收集，浓缩后冷冻干燥并用MTT法进行抗肿瘤活性实验；

⑤高效液相色谱纯化，将步骤④中得到的具有最高抗肿瘤活性物质冷冻干燥后，经过反相高效液相柱，色谱柱为Zorbax SB C18(250mm×9.4mm，5μm)；柱温为室温；流动相为乙腈和水，梯度洗脱：0～20min，乙腈浓从0％变化到95％，洗脱速度2.5～3.0mL/min，紫外检测波长220nm。

2.权利要求1所述的贻贝酶解多肽在抗前列腺癌DU-145细胞增殖上的应用。

3.权利要求1所述的贻贝酶解多肽在抗前列腺癌PC-3细胞增殖上的应用。

说明书

贻贝酶解多肽及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种贻贝酶解多肽，本发明还涉及该贻贝酶解多肽的制备方法及其在抗前列腺癌上的应用。

背景技术

[0002] 多肽在生物体内可作为神经递质、白细胞介素和细胞生长因子等活性物质，具有维持生物体生长发育、免疫调节和新陈代谢等活性功能。现有研究表明，来源于生物体的多肽具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗衰老、抗高血压等活性功能，尤其是抗肿瘤活性已受到各国研究人员的关注。目前，有关天然肽和合成肽的抗肿瘤活性已有大量报道，并有部分多肽作为抗肿瘤药物已应用于临床；食物蛋白来源的多肽对于其抗菌、抗氧化、抗高血压活性研究颇多，而对其抗肿瘤活性的相关报道较少。

[0003] 海洋生物蛋白种类繁多，来源广泛，作为活性肽的一个重要来源，已受到越来越多的关注。贻贝作为海洋生物的一个重要组成部分，隶属于海洋软体动物门(Mollusca)双壳纲(Bivalvia)贻贝目(Mytiloida)，在我国北方称海红，江浙称为淡菜，富产于浙江嵊泗周围海域。贻贝富含粗蛋白、脂肪和碳水化合物，此外还含有钙、磷、铁、维生素等多种微量元素。已有研究表明，贻贝提取物具有抗肿瘤、抗氧化、抗凝、降血压、降血脂、提高免疫力等活性功能，可参考专利号为ZL200510110096.8的中国发明专利《厚壳贻贝的提取物、制造方法及其用途》(授权公告号：CN100467030C)，该专利公开了厚壳贻贝的提取物在流感上的应用。类似的还可以参考专利号为ZL200510024391.1的中国发明专利《一种可提高免疫力功能的厚壳贻贝提取物》(授权公告号为CN100486593C)；申请号为200910101136.0的中国发明专利申请公开《厚壳贻贝脂溶性提取物及其制备方法和用途》(公开号：CN101606951A)。但至今未见有关贻贝酶解产物对前列腺癌细胞作用的相关报道。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种贻贝酶解多肽。

[0005] 本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种贻贝酶解多肽的制备方法。

[0006] 本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种贻贝酶解多肽的应用。

[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种贻贝酶解多肽，其特征在于包含如下氨基酸序列：

[0008] Asp Leu Tyr。

[0009] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种贻贝酶解多肽，其特征在于采用如下步骤制备：

[0010] ①取贻贝肉，制成均浆，调节pH值9.5～10，料液比为1∶2～1∶3，添加碱性蛋白酶，加酶量为1500～2000U/g，酶解时间为6～8小时，酶解温度为45～50℃，灭酶后离心，取上层清液；

[0011] ②将上述的清液经过超过滤，收集分子量3K以下的水解液，浓缩并冷冻干燥；

[0012] ③DEAE-SepharoseFF离子柱交换柱色谱分离，将步骤②中的冷冻干燥后产物通过DEAE-SepharoseFF离子柱交换柱，0.1～1mol/LNaCL梯度洗脱，洗脱速度1～1.5mL/min，蛋白检测仪280nm进行检测，对各洗脱峰分别进行收集，浓缩后冷冻干燥，将干燥后得到的各个峰组分采用MTT法进行抗肿瘤活性实验，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，浓缩并冷冻干燥；

[0013] ④采用Sephadex G-25凝胶柱色谱分离，将步骤③所得的具有最高抗肿瘤活性的冷冻干燥后产物过Sephadex G-25凝胶柱，流动相为蒸馏水，流速为1.5～2mL/min，蛋白检测仪280nm进行检测，对各洗脱峰分别进行收集，浓缩后冷冻干燥并用MTT法进行抗肿瘤活性实验；

[0014] ⑤高效液相色谱纯化，将步骤④中得到的具有最高抗肿瘤活性冷冻干燥后产后过反相高效液相柱，色谱柱为Zorbax SB C18(250mm×9.4mm，5μm)；柱温为室温；流动相为乙腈和水，梯度洗脱：0～20min，乙腈浓从0％变化到95％，洗脱速度2.5～3.0mL/min，紫外检测波长280nm。

[0015] 所述的贻贝酶解多肽在抗前列腺癌上的应用。进一步，所述的贻贝酶解多肽在抗前列腺癌DU-145细胞抑制增殖上的应用；所述的贻贝酶解多肽在抗前列腺癌PC-3细胞抑制增殖上的应用。

[0016] 与现有技术相比，本发明的优点在于：采用最佳的蛋白酶和优选的工艺对贻贝进行酶解纯化，将所得的目标肽应用于抗前列腺癌细胞上产生了很强的细胞抑制增殖作用，为抗前列腺癌提供了一条可行性研究途径；整体工艺简单，投入较少，易于推广应用。

附图说明

[0017] 图1为各种蛋白酶的酶解物对DU-145细胞增殖抑制率的柱状图。

[0018] 图2为碱性蛋白酶不同分子量酶解物对DU-145细胞增殖抑制率的柱状图。

[0019] 图3为碱性蛋白酶分子量3K以下组分的DEAE Sepharose FF层析图谱。

[0020] 图4为图3中峰2的Sephadex G-25凝胶层析图谱。

[0021] 图5为图4中峰2-2的RT-HPLC图谱。

[0022] 图6为图5中目标肽的RT-HPLC图谱。

[0023] 图7为正常DU-145细胞形态HE染色后显微照片。

[0024] 图8为贻贝多肽作用24h后DU-145细胞形态HE染色后显微照片。

[0025] 图9为贻贝多肽作用48h后DU-145细胞形态HE染色后显微照片。

[0026] 图10为正常PC-3细胞形态HE染色后显微照片。

[0027] 图11为贻贝多肽作用24h后PC-3细胞形态HE染色后显微照片。

[0028] 图12为贻贝多肽作用48h后PC-3细胞形态HE染色后显微照片。

具体实施方式

[0029] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

[0030] 1材料

[0031] 1.1动物：贻贝(Mytilus edulis)购自舟山市场(经浙江海洋学院赵盛龙教授鉴定)，去壳后，-20℃冷藏备用。

[0032] 1.2细胞株：人前列腺癌细胞DU-145和PC-3均购自中科院上海细胞库。

[0033] 1.3主要试剂：胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、萄聚糖凝胶SephadexG-25和DEAE SepharoseFF阴离子交换柱均购自于北京亚太恒信生物科技有限公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司；F12粉末培养基和MTT均购自美国SIGMA公司；二甲基亚砜购自美国AMRESCO公司；乙腈购自宁波海曙恒隆实验器材有限公司；其余试剂均为分析纯。

[0034] 1.4主要仪器：BSA124S型电子天平(德国，Sartorius AG公司)；DS-1型高速组织捣碎机(上海标本模型厂)；CF16RXII高速冷冻离心机(日立HITACHI公司)；自动部分收集器(BSZ-40-LCD)、蛋白检测仪(HD-21-88)(上海琪特分析仪器有限公司)；SSW型微电脑电热恒温槽(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；依利特P1201型高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)；MSC300超滤杯(超滤膜：3KDa和5KDa)(上海摩速科学器材有限公司)。ZHJH-C1209C型超净工作台(上海智诚分析仪器制造有限公司)；Forma3111型CO2培养箱(美国Thermo公司)；倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

[0035] 2方法

[0036] 2.1酶解工艺流程：选用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶4种蛋白酶分别对贻贝肉进行酶解，各种蛋白酶的酶解条件见表1，酶解过程依次如下：

[0037] 贻贝洗净；去壳取肉；匀浆；0.5mol/LNaOH和0.1mol/LHCl溶液调PH值；加酶水解；灭酶(90℃，加热15min)；离心(5000r/min，20min)；取上清液；冷冻干燥；MTT法抗肿瘤活性初步测定。

[0038] 表1 几种蛋白酶的酶解条件

[0039]

[0040] 2.2细胞培养：人前列腺癌DU-145和PC-3细胞(原购自中科院上海细胞库，由本实验室传代保存)，用含10％小牛血清的F12完全培养基于37℃，5％CO2培养箱中培养至对数生长期。

[0041] 2.3细胞增殖抑制率的测定：采用MTT法进行检测。配制PBS溶液(pH值为7.2)和一定浓度的酶解多肽溶液。取对数生长期的前列腺癌细胞制成悬液，接种至96孔板，每孔200μL，于5％CO2，37℃贴壁4h，然后分别加入酶解多肽溶液，每个浓度设3个平行孔，同时设不加药对照组，置5％ CO2，37℃培养箱中孵育，培养结束加入180μLMTT和20μL PBS继续培养4h，吸弃96孔板的液体，加入150μL的DMSO，充分混合。置酶联免疫检测仪在490nm测吸光度，计算细胞增殖抑制指数(IR)，按下列公式计算。

[0042] IR＝[(对照组A值-药物组A值)/对照组A值]×100％

[0043] 2.4抗肿瘤活性肽的初步分离：取蛋白酶水解贻贝肉得到的上清液，分别用截留分子量为10K、5K和3K的超滤膜进行超滤，得到分子量为10K以上、5K-10K、3K-5K和3K以下的水解液。冷冻干燥后采用MTT法分别测定各组分对前列腺癌细胞的增殖抑制率，初步确定具有较强抗肿瘤活性多肽的分子量范围。对该分子量范围的水解液经超滤进行大量收集，浓缩并冷冻干燥，作进一步的分离纯化。

[0044] 2.5 DEAE-SepharoseFF离子交换柱色谱分离：将上述步骤得到的活性最强部分过DEAE-SepharoseFF离子交换柱，分别用PBS(PH为7.4)、0.1mol/LNaCL、0.3mol/LNaCL、0.5mol/LNaCL和1mol/LNaCL溶液进行阶段洗脱，洗脱速度为1ml/min，蛋白检测仪280nm进行检测，分别收集各洗脱峰，并冷冻干燥。将干燥后得到的各个峰组分采用MTT法进行抗肿瘤活性实验，进一步确定目标肽所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，浓缩并冷冻干燥，作为进一步纯化所用样品。

[0045] 2.6 Sephadex G-25凝胶柱色谱分离：由上述步骤得到的活性最强组分过Sephadex G-25凝胶柱(80cm×2.6cm)，流动相为蒸馏水，流速为2mL/min，蛋白检测仪280nm进行检测，对各洗脱峰分别进行收集，浓缩后冷冻干燥。将干燥后得到的各个峰组分采用MTT法进行抗肿瘤活性实验，确定目标肽所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，浓缩并冷冻干燥，作为高效液相所用样品。

[0046] 2.7高效液相色谱(HPLC)纯化及纯度检测：纯化色谱条件：色谱柱为Zorbax SB C18(250mm×9.4mm，5μm)；柱温为室温；流动相为乙腈和水，梯度洗脱：0～20min，乙腈浓度同0％变化到95％；洗脱速度3.0mL/m in；紫外检测波长220nm。纯度检测色谱条件：色谱柱为Hypersil BDS C18(250mm×4.6mm，5μm)；柱温为室温；梯度洗脱：0～20min，乙腈浓度由0％变化到95％；洗脱速度0.8mL/m in；紫外检测波长220nm。

[0047] 2.8目标肽的氨基酸序列检测。通过检测得到该贻贝酶解多肽，包含如下氨基酸序列：Asp Leu Tyr。

[0048] 2.9细胞形态观察：采用HE染色方法。将DU-145和PC-3细胞接种在带有盖玻片的六孔板上，细胞爬片24h后，加入20mg/ml的目标肽，分别培养24h和48h后，将盖玻片取出，95％酒精固定15min。PBS洗2次，苏木素进行染色，自来水充分水洗，伊红复染，自来水浸洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树封片，光学显微镜下观察并摄片。

[0049] 3结果

[0050] 3.1蛋白酶种类的确定：

[0051] 4种蛋白酶对贻贝肉酶解所得到的酶解物对DU-145细胞均有一定的增殖抑制作用，其中碱性蛋白酶酶解物对DU-145细胞的增殖抑制活性最强，浓度为20mg/ml，作用48h后，抑制率为28.4％(见图1)。碱性蛋白酶水解液经超滤膜超滤后得到的4个组分在浓度为20mg/ml，作用48h后，3K以下组分对DU-145细胞的增殖抑制率最大，为30.3％(见图2)。

[0052] 3.2抗PCa活性肽的分离

[0053] 3K以下组分经DEAE-Sepharose FF离子交换柱洗脱后，共得到4个峰组分(见图3)，其中峰2抗肿瘤活性最强，当浓度为20mg/ml，对DU-145细胞作用48h后，抑制率为41.2％。峰2经Sephadex G-25凝胶柱洗脱后得到3个峰组分(见图4)，其中峰2-2的抗肿瘤活性最强，在浓度为20mg/ml，对DU-145细胞作用48h后，抑制率为46.5％3.3抗PCa活性肽的纯化及纯度测定：峰2-2经Zorbax SB C18纯化后，最终得到1个多肽，即为本实验所纯化的目标肽，见图5。将该肽过Hypersil BDS C18色谱柱检测其纯度，在保留时间约为
15min时出现单一峰，见图6，说明本实验所得到的目标肽纯度较高，为单一组分。

[0054] 3.4目标肽对DU-145和PC-3细胞增殖抑制作用：将目标肽设置5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml和25mg/ml五个浓度组，分别测定作用24h、48h和72h后，对DU-145和PC-3细胞增殖的影响。结果表明，目标肽对DU-145细胞的增殖抑制活性比PC-3细胞强，对两种细胞的增殖抑制活性均呈现时效和量效关系(表2)。

[0055] 表2 贻贝酶解多肽对人前列腺癌DU-145和PC-3细胞增殖的影响(x±s，n＝3)[0056]

[0057] 3.4细胞形态学观察：HE染色如图7至图14所示，正常细胞胞质染色均一，细胞分裂明显，形态饱满，细胞核大小不一，核仁数目多。目标肽作用24h后，细胞质浓缩，胞核开始固缩变小，胞间隙增大。作用48h后，上述改变加剧，胞间隙加大明显，细胞轮廓模糊，胞体急剧缩小，部分细胞质出现空泡，核仁数目减少，凋亡小体形成，染色质颜色加深。细胞形态学观察显示，再次证明目标肽对DU-145和PC-3细胞的作用具有时效关系；凋亡小体形成，说明目标肽的抗肿瘤作用可能是通过诱导细胞凋亡实现的。

[0058] 近些年来，从天然产物中寻找新型、高效、低毒的抗肿瘤药物一直是各国研究的热点。其中，抗肿瘤活性肽由于其多功能性、高敏感性和高稳定性等特征也受到越来越多的关注。本实验首先选取几种蛋白酶对贻贝蛋白进行水解，比较各个酶解物的抗肿瘤活性，发现不同酶解物其抗肿瘤活性也不相同，这应该与酶解物的组成结构有关。据此可以推测，利用酶解方法获取抗肿瘤活性肽时，酶的选择至关重要，在条件允许的前提下，应尽量多选用几种蛋白酶进行活性筛选。其次，在分离纯化获取目标肽的过程中，检测到不同分子量和不同洗脱峰的组分，其抗肿瘤活性也有很大区别，活性最强部分是3K以下的小分子量多肽，而在这一范围内的多肽中，起到活性作用的也主要是某个峰的多肽组分，并且随着分离纯化的进行，多肽的抗肿瘤活性也逐渐增强，其对肿瘤细胞的抑制率由分离纯化前的28.4％增加到47.6％。因此，在制备抗肿瘤活性肽时，进行分离纯化获取纯品也是十分必要的。最后，根据已有研究结果，同一活性肽对不同种系癌细胞的活性功能也不相同，本实验所得到的活性多肽是针对前列腺癌DU-145细胞进行筛选的，虽然该目标肽对PC-3细胞也具有增殖抑制活性，但是活性明显低于前者，所以，在进行抗肿瘤活性肽筛选时，癌细胞种系的选择对于最终得到的目标肽起到关键作用。

[0059] 本研究证实了运用酶解方法可以从贻贝蛋白中提取抗肿瘤活性肽，这种活性肽对前列腺癌细胞具有显著的增殖抑制活性，本实验为食物蛋白来源抗肿瘤药物和保健品的研发奠定了基础，但是对于其抗肿瘤机制及其毒性还有待于进一步研究。