NF-YA9蛋白及其编码基因在培育脂肪酸含量提高的植物中的应用

摘要

本发明公开了一种NF-YA9蛋白及其编码基因在培育脂肪酸含量提高的植物中的应用。本发明提供的培育转基因植物的方法，为将NF-YA9蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物具有如下等特征：1)所述转基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物；本发明的实验证明，本发明提供了将一个调控植物脂肪酸代谢的转录因子NF-YA9及其编码基因导入拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚生态型中，得到转基因植物，发现该转录因子可用于调控植物体内脂肪酸代谢。

权利要求

1.一种培育转基因植物的方法，为将NF-YA9蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物具有如下1）-5）中的任一一种特征：

1）所述转基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物、所述转基因植物植株的根部或下胚轴均形成胚性细胞、所述转基因植物植株生长受到抑制和所述转基因植物的与脂肪酸合成相关基因表达水平高于所述目的植物；

2）所述转基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物；

3）所述转基因植物植株生长受到抑制；

4）所述转基因植物植株的根部或下胚轴均形成胚性细胞；

5）所述转基因植物的与脂肪酸合成相关基因表达水平高于所述目的植物； 所述NF-YA9蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1； 所述脂肪酸为C16：0、C18：0、C18：1、C18：2、C18：3和/或C20：1；

所述目的植物为拟南芥；

所述与脂肪酸合成相关基因为登录号为At2g43710的FAB2，登录号为At3g12120的FAD2，登录号为At2g29980的FAD3和登录号为At4g34520的FAE1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于： 所述NF-YA9蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2或序列表中的序列3。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于： 所述转基因植物植株生长受到抑制体现在所述转基因植物的株高或子叶大小均小于所述目的植物； 所述转基因植物植株的根部或下胚轴均有胚性细胞体现在所述转基因植物植株的根部或下胚轴均大于所述目的植物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于： 所述NF-YA9蛋白的编码基因通过重组载体导入目的植物； 所述重组载体为如下1）或2）：

1)将所述NF-YA9蛋白的编码基因插入PER10中得到的载体；

2)将所述NF-YA9蛋白的编码基因插入pBA002中得到的载体。

说明书

NF-YA9蛋白及其编码基因在培育脂肪酸含量提高的植物

中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种NF-YA9蛋白及其编码基因在培育脂肪酸含量提高的植物中的应用。

背景技术

[0002] 脂肪酸是生物体内主要的能量储存形式，其主要衍生物甘油三脂(triacylglycerol，TAG)可在动物的脂肪组织、植物种子或果实中大量储藏。其中，植物油作为食用油和一种重要的可再生能源物质而备受关注。甘油三脂是脂肪酸和甘油化合而成的天然高分子化合物。甘油三脂合成的过程包括脂肪酸在质体中的从头合成过程、在内质网中的修饰过程和甘油三脂的组装过程。在植物体内，脂肪酸的从头合成(FAS)是在质体内进行的。脂肪酸合成的前体是乙酰CoA(acetyl-CoA)。它首先在乙酰CoA羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase，ACCase)作用下合成丙二酰CoA(malonyl-CoA)，然后脂肪酸合成酶以丙二酰CoA为底物进行连续的聚合反应，以每次循环增加两个碳的频率合成酰基碳链，最后合成16至18碳的饱和脂肪酸。在质体内合成的游离脂肪酸被活化后运输到内质网，进行进一步的修饰(去饱和，脱氢，延长等)，最后形成甘油脂和膜脂。植物种子中TAG的生物合成是在内质网中进行的。TAG合成的前体是甘油-3-磷酸和脂酰CoA，合成的过程共需要三种酰基转移酶和一种磷酸水解酶，分别是甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)，溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT)，二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)和磷脂磷酸水解酶(PAPase)(Barron等，Biochim Biophys Acta，60：329-337)。TAG的极性很低，因此能够使油脂在脂肪体内不断积累。

[0003] 目前，已发现的参与植物脂肪酸代谢调控的转录因子有WRI1、LEC1、FUS3和LEC2 等 (Focks 等，1998，Plant Physiology，18：91-101；Santos Mendoza 等，2005，FEBS Letter，579：4666-4670；Wang 等，2007，Planta，226：773-783；Mu 等，2008，Plant Physiology，148：1042-1054)。其中，WRI1编码一个AP2/EREB转录因子蛋白，它可能是植物体内由蔗糖向TAG转化的一个关键的调节因子(Cernac等，2004，Plant Journal，40：575-585)。LEC1属于能结合启动子中顺式作用元件CCAAT盒的一类转录因子，调控胚胎的发生与种子成熟，同时可能对胚胎形成过程中胚胎储存物的积累进行调控(Lotan等，
1998，Cell，1998，93(7)：1195-1205；To 等，2006，The Plant Cell，18(7)：1642-1651)。
过量表达LEC1能大幅度增加转基因拟南芥幼苗中的脂肪酸含量(Mu等，2008，Plant Physiology，148：1042-1054)。FUS3和LEC2都是编码了一个B3家族的转录因子，它们都是胚胎发育过程中的重要调控基因(Reidt等，2000，Plant Journal，21：401-408；Stone等，
2001，Proc Natl Acad Sci 98：11806-11811)。fus3和lec2突变体的种子中，油脂含量都显著降低(Wang等，2007，Planta，226：773-783；Santos Mendoza等，2008，Plant Journal，
54：608-620)；过量表达FUS3和LEC2，都能使转基因植物体内的油脂含量增加(Santos Mendoza等，2005，FEBS Letter，579：4666-4670；Wang等，2007，Planta，226：773-783)。上述研究表明，在植物种子成熟过程中油脂积累的调控很大程度上是依赖胚胎发生过程中的重要调控因子来调控的。

[0004] 在拟南芥基因组中，编码转录因子的基因占了很大一部分，至少有1500个，占整个基因组的5％以上(Riechmann等，2000，Science，290：2110-2113)。这些转录因子大多属于大的基因家族，有的基因家族又包括许多亚族，而且有些转录因子家族是植物所特有的。对转录因子的研究结果表明，一个转录因子可能对一类相关性状的很多基因实施调节控制，从而有效改变植物的相关特性。CCAAT盒是一个广泛存在于基因启动子上的顺式作用元件，与CCAAT序列结合的转录因子又称为nuclear factor Y(NF-Y)或CCAAT binding factor(CBF)。NF-Y是一个由三种不同亚基构成的异源三聚体复合物，它特异性地识别DNA上的CCAAT序列，并与之结合，从而调节基因的表达。NF-Y的三种不同亚基分别属于3个亚族：NF-YA(又称为HAP2或CBF-B)，NF-YB(又称为HAP3或CBF-A)和NF-YC(又称为HAP5或CBF-C)。NF-YB和NF-YC的核心结构域在序列上与组蛋白H2A和H2B有很高的同源性。NF-YB/NF-YC形成一个紧密结合的异源二聚体复合物，NF-YA再结合在这个复合物的表面，形成异源三聚体复合物。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

[0006] 本发明提供的方法，为将NF-YA9蛋白的编码基因导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物具有如下1)-5)中的任一一种特征：

[0007] 1)所述转基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物、所述转基因植物植株的根部或下胚轴均形成胚性细胞、所述转基因植物植株生长受到抑制和所述转基因植物的与脂肪酸合成相关基因表达水平高于所述目的植物；

[0008] 2)所述转基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物；

[0009] 3)所述转基因植物植株生长受到抑制；

[0010] 4)所述转基因植物植株的根部或下胚轴均形成胚性细胞；

[0011] 5)所述转基因植物的与脂肪酸合成相关基因表达水平高于所述目的植物；

[0012] 所述NF-YA9蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1。

[0013] 在上述方法中，所述NF-YA9蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列2或序列表中的序列3；

[0014] 所述脂肪酸为C16:0、C18:0、C18:1、C18:2、C18:3和/或C20:1。

[0015] 在上述方法中，所述转基因植物植株生长受到抑制体现在所述转基因植物的株高或子叶大小均小于所述目的植物；

[0016] 所述转基因植物植株的根部或下胚轴均有胚性细胞体现在所述转基因植物植株的根部或下胚轴均大于所述目的植物；

[0017] 所述与脂肪酸合成相关基因为FAB2、FAD2、FAD3或FAE1基因。

[0018] 在上述方法中，上述NF-YA9蛋白的编码基因通过重组载体导入目的植物；

[0019] 上述重组载体为如下1)或2)：

[0020] 1)将所述NF-YA9蛋白的编码基因插入PER10的XhoI和SpeI位点间得到的载体；

[0021] 2)将所述NF-YA9蛋白的编码基因插入pBA002的XhoI和SpeI位点间得到的载体。

[0022] 在上述方法中，上述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。

[0023] 在上述方法中，所述双子叶植物为拟南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕榈树、橄榄树、蓖麻、马铃薯或烟草；所述单子叶植物为水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高梁或草坪草。在本发明的实施例中具体用的是拟南芥。

[0024] 本发明的另一个目的是提供一种重组载体。

[0025] 本发明提供了一种重组载体，为如下1)或2)：

[0026] 1)将所述NF-YA9蛋白的编码基因插入PER10的XhoI和SpeI位点间得到的载体；

[0027] 2)将所述NF-YA9蛋白的编码基因插入pBA002的XhoI和SpeI位点间得到的载体。

[0028] 本发明的实验证明，本发明提供了将一个调控植物脂肪酸代谢的转录因子NF-YA9及其编码基因导入拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚生态型中，得到转基因植物，发现该转录因子可用于调控植物体内脂肪酸代谢，实验证明，NF-YA9转基因拟南芥体内，不仅脂肪酸含量得到显著提高，而且参与脂肪酸合成的酶FAE1和参与脂肪酸修饰的酶FAB2，FAD2以及FAD3的相应基因的表达也都受其调控。本发明的转录因子及其编码基因对于植物脂肪酸代谢分子机制的研究，以及通过生物技术来提高植物(特别是油料作物)的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，在农业领域具有广阔的应用和市场前景。本发明在研究过程中，发现了NF-YA9在植物种子发育过程中对油脂积累的调控作用。通过以NF-YA9为靶点基因的遗传操作可以有效地提高转基因植物体内的脂肪酸含量。

附图说明

[0029] 图1为NF-YA9的基因结构框架图

[0030] 其中，黑色方框表示外显子，灰色方框表示5‘和3’非编码区，直线表示内含子。ATG和TAA分别表示基因的起始密码和终止密码。

[0031] 图2为pER10-NF-YA9转基因植物萌发一周后的表型

[0032] 图3为pBA-NF-YA9转基因植物萌发10天后的表型

[0033] 图4为pER10-NF-YA9转基因植物萌发一周后的苏丹红染色

[0034] 图5为pBA-NF-YA9转基因植物萌发10天后的苏丹红染色

[0035] 图6为GS-MS检测脂肪酸含量

[0036] 图7为脂肪酸合成相关基因在野生型和转基因植物中的表达水平

具体实施方式

[0037] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0038] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0039] 实施例1、转NF-YA9拟南芥的获得及表型鉴定

[0040] 一、转NF-YA9拟南芥的获得

[0041] 1、调控植物脂肪酸代谢的转录因子基因NF-YA9的克隆

[0042] 设计引物序列如下：

[0043] P1(上游引物)：5’-CCCTCGAGATGGGAATTGAAGACATGCA-3’

[0044] P2(下游引物)：5’-AACCCGGGTTTAATGGCTAGACGAGCTT-3’

[0045] 用植物总RNA提取试剂盒(购自天根生物公司，目录号：DP432)并参照试剂盒说明书提取野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana，Columbia生态型，购自美国拟南芥生物资源中心，The Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC，产品编号为TMCS28166。以下简称为野生型拟南芥)2周幼苗的总RNA，然后用SuperScript II Reverse Transcriptase试剂盒(购自全式金生物公司，目录号：AH301-02)并参照试剂盒说明书反转录合成其第一链cDNA，再以所合成的cDNA为模板，在引物P1和P2的引导下进行PCR扩增，得到PCR产物。

[0046] 反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收长度约912bp的目的片段并对其进行纯化，将其与经过同样酶切得到的pBluescript SK载体片段(可购自默克公司，产品目录号为ST212205)连接，再将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞(购自全式金生物公司，目录号：CD201-03)，筛选阳性克隆，将其接种于含50mg/L氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12小时，提质粒，得到含有回收片段的重组质粒，命名为SK-NF-YA9，对其进行测序，测序结果表明PCR产物的基因具有序列表中的序列2的核苷酸序列，由912个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-912位碱基，其编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质。其中，序列表中序列2自5’端第507-567位碱基编码蛋白-蛋白相互作用结构域，自5’端第603-663位碱基编码DNA结合结构域。

[0047] 上述基因对应的基因组序列具有序列表中序列3的核苷酸序列，由2195个碱基组成，自5′端第114-116位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第117-440位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端第441-705位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第706-784位碱基为该基因组基因的第二个内含子，自5′端第785-873位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5′端第874-975位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5′端第976-1050位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5′端第1051-1402位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5′端第1403-1567位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5′端第1568-1673位碱基为该基因组基因的第五个内含子，自
5′端第1674-1988位碱基为该基因组基因的第六个外显子自5′端第1-113位碱基为该基因组基因的5’非编码区(UTR)，自5′端第1989-2195位碱基为该基因组基因的3’非编码区。该基因的框架结构见图1，将该基因命名为Nuclear Factor YA9(简称NF-YA9)，将其编码蛋白命名为Nuclear Factor YA9(简称NF-YA9)。

[0048] 2、含NF-YA9的植物诱导表达载体的构建

[0049] 用限制性内切酶Xho I和Spe I对上述1构建的含有NF-YA9的质粒SK-NF-YA9进行双酶切，对双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收长度约912bp的NF-YA9基因片段并对其进行纯化，然后连接到与经相同酶双酶切的载体PER10连接，得到连接产物。

[0050] PER10是一个有雌二醇诱导的植物表达载体，记载在 Applications of Chemical-Inducible Expression Systems in Functional Genomics and Biotechnology，Nam-Hai Chua，Methods in Molecular Biology，323(III)，329-342，2006，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

[0051] 将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含50mg/L潮霉素的5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养16小时，提质粒，对重组质粒用限制性内切酶Xho I和Spe I进行双酶切鉴定，结果经酶切获得了912bp DNA片段，与预期结果相符，再用引物P1和P2做进一步的PCR鉴定，结果经PCR扩增得到了912bp的DNA片段，也与预期结果一致，再将该质粒送去测序，结果为将序列表中的序列2插入PER10的Xho I和Spe I酶切位点间得到的载体，表明得到了插入序列及位置正确的含有的植物表达载体，命名为PER10-NF-YA9。

[0052] 3、转NF-YA9拟南芥的获得

[0053] 将步骤2构建的植物表达载体PER10-NF-YA9用电激法转化农杆菌GV3101感受态细胞(购自BIOVECTOR CO.，LTD，产品货号：BIOVECTOR-375)，将其涂布于含50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平的LB抗性平板上在28℃、150rpm下培养16小时，挑取长出的农杆菌单菌落经过用引物P1和P2的PCR鉴定，结果经PCR扩增得到了912bp的DNA片段，说明为阳性重组农杆菌，命名为GV3101/PER10-NF-YA9。

[0054] 再将GV3101/PER10-NF-YA9接种于含50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平的20mLLB液体培养基中在28℃、150rpm下振荡培养2天，然后，再按2％的接种量菌将菌液接种于含50mg/L壮观霉素和50mg/L利福平的300mL LB液体培养基中在28℃、150rpm下振荡培养
18小时。培养结束后，5000rpm离心20分钟收集菌体，再将菌体溶于250mL含有5％蔗糖的侵染液中，慢慢摇匀。最后，将菌液转于250mL烧杯中，将已去掉花和果荚的野生型拟南芥倒置于烧杯中5分钟，得到T0代转NF-YA9植物。

[0055] 将上述阳性T0代转NF-YA9植物进行常规培养，收获种子，所得种子经50mg/L卡那霉素筛选后得到20株T1代转NF-YA9植物。经过自交，得到大约500株T2代转NF-YA9植物。

[0056] 二、转NF-YA9拟南芥的表型鉴定

[0057] 1、转PER10-NF-YA9植物的鉴定

[0058] 将步骤一获得的编号为#1和#2的T2代转NF-YA9拟南芥(PER10-NF-YA9)的T2代种子播在含10μM雌激素(17-β-Estradiol，Sigma，产品货号E8875)的MS培养基上(1/2MS，1％蔗糖，0.8％琼脂)培养10天的幼苗提取全苗的RNA，以野生型拟南芥作为对照。反转录获得cDNA，用P1(上游引物)：5’-CCCTCGAGATGCAATCAAAACCGGGAAG-3’P2(下游引物)：5’-AACCCGGGTGGTGCACCAGAAGAATTCA-3’进行RT-PCR，检测了NF-YA9基因在T2代转基因植物中的表达水平，以野生型拟南芥为对照，以Actin7为内参，内参的引物为ACTIN7F：
5‘-GGAACTGGAATGGTGAAGGCTG-3’和ACTIN7B：5‘-CGATTGGATACTTCAGAGTGAGGA-3’。结果如图2A所示，为RT-PCR技术检测NF-YA9基因的表达水平，从图中看出，与野生型拟南芥相比，编号为#1和#2的T2代转PER10-NF-YA9拟南芥中NF-YA9基因的表达水平均具有不同程度地升高，说明编号为#1和#2的T2代转PER10-NF-YA9拟南芥为阳性的过表达拟南芥。

[0059] 2.转PER10-NF-YA9植物的表型分析

[0060] 将上述鉴定为阳性的编号为#1和#2的T2代转NF-YA9拟南芥(PER10-NF-YA9)的种子播在含10μM雌激素(17-β-Estradiol，Sigma，产品货号E8875)的MS培养基上(1/2MS，1％蔗糖，0.8％琼脂)(其中，MS盐、琼脂和蔗糖购自北京西美杰科技有限公司，产品货号M531、A7848和S391，)置于温室中在22℃、光照强度80-120μE-2S-1条件下培养16小时，以野生型拟南芥作为对照。

[0061] 10天后，观察T2代转NF-YA9拟南芥和野生型植株的生长情况，结果如图2B所示，可以看出，T2代转NF-YA9拟南芥在诱导培养基上生长10天时有明显的生长抑制表型，具体表现为NF-YA9过表达植株矮小、子叶变小或不能正常发育、顶端分生组织的发育完全受阻，根的生长发育异常。同时，在T2代转NF-YA9拟南芥的下胚轴和根部形成明显的胚性组织，主要表现为根部和下胚轴颜色变绿，明显膨大变粗。

[0062] 三、NF-YA9组成型表达转基因拟南芥的获得

[0063] 1、构建NF-YA9基因组成型过量表达的重组表达载体

[0064] 将上述一得到的SK-NF-YA9经过XhoI和SpeI酶切得到酶切产物与经过同样酶切的植物诱导表达载体pBA002(记载在A GFP-mouse talin fusion protein labels plant actin filaments in vivo and visualizes the actin cytoskeleton in growing pollen tubes，Benedikt Kost，Pius Spielhofer，Nam-Hai Chua，The Plant Journal，16(3)，393-401，1998，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得)连接，连接产物转化大肠杆菌，得到克隆，在含有50毫克/升壮观酶素的LB平板上37度培养16小时，最后筛选得到具有抗壮观酶素抗性的克隆，提取该克隆的质粒，送去测序，结果为将序列2插入pBA002的XhoI和SpeI酶切位点间得到的质粒，该质粒命名为pBA-NF-YA9。

[0065] 2、转pBA-NF-YA9拟南芥的获得

[0066] 将上述获得的pBA-NF-YA9转化农杆菌GV3101(购自Biovector Co.，LTD，产品货号：Biovector-375)，然后用花侵染转化方法转化野生型拟南芥Col-0(购自美国拟南芥生物资源中心，The Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC，产品编号为CS28166，以下简称野生型拟南芥)的花序，通过除草剂Basta(50mg/L)筛选出12株T1代转pBA-NF-YA9拟南芥，经过扩繁，得到约300株T2代转pBA-NF-YA9拟南芥。

[0067] 3、转pBA-NF-YA9拟南芥的表型分析

[0068] 分别将编号为#2和#6的T2代转pBA-NF-YA9拟南芥的种子播种后在MS培养基(1/2MS，1％蔗糖，0.8％琼脂)(其中，MS盐、琼脂和蔗糖购自北京西美杰科技有限公司，产品货号M531、A7848和S391，)上22度24小时光照培养7天，观察植物的生长发育表型。结果表明，用组成型启动子驱动NF-YA9过量表达，对于苗期植物的生长没有明显影响，但在幼苗的下胚轴处有明显的胚性组织形成，具体表现为下胚轴明显膨大变粗，颜色更绿(图3)。

[0069] 实施例2、转NF-YA9拟南芥的脂肪酸代谢检测及其机制研究

[0070] 一、苏丹红染色指示转NF-YA9拟南芥体内脂肪酸含量的变化

[0071] 苏丹红是一种能够与种子特有的中性脂特异结合的染料，植物材料着色的深浅可以指示植物体内中性脂的含量高低。将由实施例1的一得到T2代转NF-YA9拟南芥(PER10-NF-YA9)与野生型拟南芥分别浸泡于1％苏丹红(Fat Red 7B)(Sigma，产品货号201161-8)，室温(25℃)染色6小时，用去离子水清洗3遍，每遍30s，染色结果如图4所示，在编号为#1和#2的T2代转NF-YA9拟南芥的根部和下胚轴处，苏丹红着色的程度明显高于野生型植物，说明转基因植物体内形成胚性细胞，且胚性细胞中的种子特异的脂肪酸的积累量明显高于野生型。

[0072] 按照上述方法将由实施例1的一得到T2代转pBA-NF-YA9拟南芥进行苏丹红染色，结果如图5所示，在T2代转pBA-NF-YA9拟南芥的根部和下胚轴处，苏丹红的着色程度明显高于野生型的下胚轴，说明由于NF-YA9基因的过量表达导致种子特异的中性脂肪酸在下胚轴部位积累。

[0073] 二、GC-MS方法检测转NF-YA9拟南芥经诱导后体内各种脂肪酸组分的含量变化情况

[0074] 分别取由实施例1的一得到编号为1(#1)和2(#2)的T2代转NF-YA9拟南芥和野生型拟南芥在诱导培养基(含10μM雌激素，17-β-Estradiol，Sigma，产品货号E8875，的MS培养基上(配方为1/2MS，1％蔗糖，0.8％琼脂))中萌发后生长10天，各取0.1克植物整株幼苗，在液氮中研磨成干粉，然后转移到带密封盖的试管中，加入3mL甲醇(含2.5％(V/V)浓硫酸)，在80℃水浴加热90分钟，再加入4.5mL 0.9％NaCl水溶液和1mL正己烷，混匀，4000rpm离心10分钟，收集正己烷相。真空抽干，用100ul乙酸乙酯溶解，取1ul上样，用PerkinElmer公司的TurboMass GC/MS仪分析各种脂肪酸组分的含量变化情况，所用GC柱为30m×0.25mmBPX-70柱，GC升温程序为：初始温度120℃，保持1分钟，再以每分钟10℃的速率升至150℃，然后以每分钟4℃的速率升温至230℃，保持10分钟，以C17:0的三酯酰甘油(Sigma，货号：201161-8)作内标。

[0075] 根据样品质谱出现的时间和分子量可以确定组分，根据质谱峰图的面积与内标的面积相比，可以计算含量。脂肪酸含量的计算公式是：样品含量＝(样品峰图面积/内标峰图面积)X内标含量/样品重量。

[0076] 结果如图6所示，编号为1(#1)、2(#2)的T2代转NF-YA9拟南芥和野生型拟南芥的C16:0的含量分别为0.56μg/mg、1.13μg/mg、0.80μg/mg；

[0077] 编号为1(#1)、2(#2)的T2代转NF-YA9拟南芥和野生型拟南芥的C18:0的含量分别为0.14μg/mg、0.50μg/mg、0.20μg/mg；

[0078] 编号为1(#1)、2(#2)的T2代转NF-YA9拟南芥和野生型拟南芥的C18:1的含量分别为0.12μg/mg、1.21μg/mg、0.54μg/mg；

[0079] 编号为1(#1)、2(#2)的T2代转NF-YA9拟南芥和野生型拟南芥的C18:2的含量分别为0.55μg/mg、2.12μg/mg、1.27μg/mg；

[0080] 编号为1(#1)、2(#2)的T2代转NF-YA9拟南芥和野生型拟南芥的C18:3的含量分别为1.0μg/mg、2.48μg/mg、1.24μg/mg；

[0081] 编号为1(#1)、2(#2)的T2代转NF-YA9拟南芥和野生型拟南芥的C20:1的含量分别为0μg/mg、1.90μg/mg、0.32μg/mg。

[0082] 从上述可以看出，与野生型拟南芥相比，编号为1(#1)和2(#2)的T2代转NF-YA9拟南芥经诱导后脂肪酸的各个组分含量都明显上升，其中，C16:0分别升高了100.4％和42％；C18:0分别升高了266.8％和43.2％；C18:1分别升高了913.3％和353.4％；C18:2分别升高了286.5％和131.5％；C18:3分别升高了148.7％和24.5％。尤其值得注意的是，种子油脂中特有的C20:1在10天的野生型幼苗中是检测不到的，但在转基因植物中，该组分的含量分别达到了1.90μg/mg和0.32μg/mg。

[0083] 上述结果表明，NF-YA9是脂肪酸合成的正向调控因子，过量表达该基因可以显著提高植物体内的脂肪酸含量。

[0084] 三、NF-YA9调控脂肪酸合成的分子机制研究

[0085] 分别由实施例1的一得到的编号为#1 T2代转NF-YA9拟南芥(PER10-NF-YA9)在诱导培养基中萌发后生长10天的提取全苗的RNA，反转录获得cDNA，分别用如下引物进行扩增，以野生型拟南芥(Col-0)为对照。

[0086] FAD2 F1(5‘-ATGGGTGCAGGTGGAAGAAT-3’)

[0087] FAD2 B1(5‘-CCAGGAGAAGTAAGGGACGA-3’)

[0088] FAD3 F1(5‘-CATAAGCGGCGTGCATTTTG-3’)

[0089] FAD3 B1(5‘-ACGAAAGCAGCTAAACATGT-3’)

[0090] FAB2 F1(5‘-CGCTGTGCATAAGCATTCTC-3’)

[0091] FAB2 B1(5‘-TTGGGGCCGGAGCTGAGAGC-3’)

[0092] FAE1 F1(5‘-CGTTAAGCTCCTTTACCGTT-3’)

[0093] FAE1 B1(5‘-TCTGTCTCTTCACGTGACGC-3’)

[0094] UBQ5 F1(5‘-CTTCAGCAGCCGTTGCCTCA-3’)

[0095] UBQ5 B1(5‘-CTGGTAAACGTAGGTGAGTCC-3’)

[0096] 进行RT-PCR，检测了与脂肪酸合成相关基因在野生型和NF-YA9转基因植株中的表达水平，以UBQ5为内参。

[0097] 结果如图7所示，从图中看出，与野生型拟南芥相比，在编号为#1 T2代转NF-YA9拟南芥(PER10-NF-YA9)中与脂肪酸合成相关基因，包括FAB2(At2g43710)，FAD2(At3g12120)，FAD3(At2g29980)和FAE1(At4g34520)的表达水平均有明显地升高，说明NF-YA9调控脂肪酸的合成与积累是通过诱导脂肪酸合成相关基因的表达实现的。