一种功能化离子液体修饰的脂肪酶及其修饰方法

摘要

本发明公开了一种功能化离子液体修饰的脂肪酶及其修饰方法。将含羧基的功能化离子液体、NHS与EDC·HCL按1∶1∶1-3的摩尔比溶于MES，在室温条件下反应1-2h进行活化，将活化后的功能化离子液体与脂肪酶按摩尔比200-1000∶1在0-4℃混合反应2-8h；或者将含氨基的功能化离子液体、NHS、EDC·HCL与脂肪酶按摩尔比100-300∶1∶1-3∶1溶于MES，在0-4℃混合反应3-10h，即得所述的功能化离子液体修饰的脂肪酶。本发明在脂肪酶表面分别引入带有氨基或羧基的功能化离子液体，通过与脂肪酶分子氨基酸残基发生共价结合，影响了酶活性中心的空间结构，强化了脂肪酶的催化性能。

权利要求

1.一种功能化离子液体修饰的脂肪酶，其特征在于所述的功能化离子液体修饰的脂肪酶是通过如下方法使功能化离子液体的有机官能团与脂肪酶的氨基酸残基通过共价结合得到的：将含羧基的功能化离子液体、N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按1:1:1-3的摩尔比溶于吗啉乙磺酸，在25~35℃条件下反应1-2 h进行活化，将活化后的功能化离子液体与脂肪酶按摩尔比200-1000:1在0-4℃混合反应2-8 h；其中，所述的功能化离子液体选自1-甲基-3-羧乙基咪唑氯盐、1-乙基-3-羧乙基咪唑氯盐、

1-甲基-3-羧乙基咪唑六氟磷酸盐或1-丁基-3-羧乙基咪唑四氟硼酸盐。

2. 根据权利要求1所述的功能化离子液体修饰的脂肪酶，其特征在于所述的脂肪酶为猪胰脂肪酶、根霉脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶或洋葱布克氏菌脂肪酶。

3. 一种功能化离子液体修饰脂肪酶的方法，其特征在于通过如下使功能化离子液体的有机官能团与脂肪酶的氨基酸残基通过共价结合：将含羧基的功能化离子液体、N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按1:1:1-3的摩尔比溶于吗啉乙磺酸，在25~35℃条件下反应1-2 h进行活化，将活化后的功能化离子液体与脂肪酶按摩尔比200-1000:1在0-4℃混合反应2-8 h；其中，所述的功能化离子液体选自1-甲基-3-羧乙基咪唑氯盐、1-乙基-3-羧乙基咪唑氯盐、

1-甲基-3-羧乙基咪唑六氟磷酸盐或1-丁基-3-羧乙基咪唑四氟硼酸盐。

4. 根据权利要求3所述的功能化离子液体修饰脂肪酶的方法，其特征在于所述的脂肪酶为猪胰脂肪酶、根霉脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶或洋葱布克氏菌脂肪酶。

说明书

一种功能化离子液体修饰的脂肪酶及其修饰方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物催化技术领域，涉及一种功能化离子液体修饰的脂肪酶及其修饰方法。

背景技术

[0002] 酶是一种特殊的催化剂，在温和的条件下能催化多种反应，以酶为核心的生物技术产业是当今世界备受关注的产业之一(Selection and evolution of enzymes from partially randomized non-catalytic scaffold.Nature，2007，448，828-831.)。未来5年全球工业酶市场将以年均6.3％的速度快速增长，到2013年仅酶产品市场份额将达到70亿美元，市场潜力巨大。脂肪酶(EC3.1.1.3)是工业生产应用中一种常用的、重要的酶，能够在油水界面上催化酯水解或醇解、酯合成、酯交换及立体异构拆分等有机合成反应，在食品、饲料、洗涤、生物能源(生物柴油)、药物手性拆分等传统工业领域应用十分广泛(Lipases for biotechnology.Curr.Opin.Biotechnol.，2002，13，390-397.)。

[0003] 当前关于酶改造的主流方法包括(1)采用基因突变或定向进化改造脂肪酶，获得高的催化性能；(2)固定化技术；(3)化学修饰，一般包括：小分子(醛、脂肪酸)、大分子(葡聚糖)、双功能交联剂(乙二胺)等的修饰，其中聚乙二醇(PEG)是使用最广泛的一种修饰剂。

[0004] 离子液体可以通过改变阴阳离子的结构来改变离子液体的亲水性、疏水性、黏性、熔点、密度等性质，设计合成具有适合某种反应或分离特殊需求的离子液体，因此，离子液体也被称“可设计性溶剂”；同时，离子液体由于具有对环境友好的特性又被称为“绿色”溶剂，已经在有机合成、分离过程、材料合成、催化等领域得到广泛应用(Catalysis in Ionic Liquids.Chem.Rev.，2007，107，2615-2665.)。

[0005] 但是，目前离子液体在酶催化反应中基本上都是作为反应介质使用，其使用量大，成本高。近些年来，专利JP2009207492、JP2009203454、WO2008090156、CN101225427等利用功能化离子液体的“绿色”溶剂和“可设计性溶剂”性质，简化了产物分离的过程，提高了酶的稳定性或者活性，但是同样遇到了离子液体用量过大，不适宜工业化生产的问题。

[0006] 虽然通过化学修饰的方法能够简便、快速的强化酶的催化性能、改变酶学性质，但从这几年的发展趋势中可以看出，化学修饰的相关研究趋于停滞，其主要原因是相关研究一直停留在传统化学修饰剂，不能满足酶分子改造修饰剂多样性的需求。

[0007] 有研究报道(Ionic Liquid-Inspired Cations Covalently Bound to Formate Dehydrogenase Improve its Stability and Activity in Ionic Liquids.ChemCatChem.，2011，3，875-882.)使用羰基二咪唑作为活化剂连接甲酸脱氢酶与含羟基的功能化离子液体，但酶修饰反应时间长达24h，且使用二甲亚砜做溶剂对酶的活性影响较大。本课题组邹彬等使用功能化离子液体修饰载体，寻找合适的载体来固定化酶使得酶活及稳定性提高。
整个过程包括：载体的制备，离子液体合成，离子液体修饰载体，然后再对酶进行固定化，反应的周期长，操作复杂，离子液体与酶的结合方式是通过静电力及氢键相结合。对比于其特征是对载体的改性，本发明的特征是基于酶分子本身的修饰改性，是一种完全不同的方式，操作简单、方式灵活、周期短，其目的均在于提高酶的活性及稳定性。

发明内容

[0008] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种功能化离子液体修饰的脂肪酶。

[0009] 本发明的另一目的是提供该功能化离子液体修饰脂肪酶的方法。

[0010] 一种功能化离子液体修饰的脂肪酶，所述的功能化离子液体修饰的脂肪酶是通过如下任意一种方法使功能化离子液体的有机官能团与脂肪酶的氨基酸残基通过共价结合得到的：

[0011] 方法I：将含羧基的功能化离子液体、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)按1∶1∶1-3的摩尔比溶于吗啉乙磺酸(MES)，在25～35℃条件下反应1-2h进行活化，将活化后的功能化离子液体与脂肪酶按摩尔比200-1000∶1在0-4℃混合反应2-8h；

[0012] 方法II：将含氨基的功能化离子液体、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCL)与脂肪酶按摩尔比100-300∶1∶1-3∶1溶于吗啉乙磺酸(MES)，在0-4℃混合反应3-10h。

[0013] 所述的功能化离子液体修饰的脂肪酶，其特征在于所述的功能化离子液体的阴离子是具有不同亲水性或电负性的极性离子，阳离子是含不同有机官能团的咪唑类离子，有机官能团为羧基或氨基。

[0014] 所述的功能化离子液体修饰的脂肪酶，其特征在于所述的功能化离子液体选自1-甲基-3-羧乙基咪唑氯盐、1-乙基-3-羧乙基咪唑氯盐、氯化1-甲基-3-(3-氨基丙基)咪唑、1-甲基-3-羧乙基咪唑六氟磷酸盐、溴化1-甲基-3-(3-氨基丙基)咪唑或1-丁基-3-羧乙基咪唑四氟硼酸盐。

[0015] 所述的脂肪酶优选猪胰脂肪酶、根霉脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶或洋葱布克氏菌脂肪酶。

[0016] 一种功能化离子液体修饰脂肪酶的方法，通过如下任意一种方法使功能化离子液体的有机官能团与脂肪酶的氨基酸残基通过共价结合：

[0017] 方法I：将含羧基的功能化离子液体、N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐按1∶1∶1-3的摩尔比溶于吗啉乙磺酸，在25～35℃条件下反应1-2h进行活化，将活化后的功能化离子液体与脂肪酶按摩尔比200-1000∶1在0-4℃混合反应2-8h；

[0018] 方法II：将含氨基的功能化离子液体、N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与脂肪酶按摩尔比100-300∶1∶1-3∶1溶于吗啉乙磺酸，在0-4℃混合反应3-10h。

[0019] 其中，所述的功能化离子液体的阴离子是具有不同亲水性或电负性的极性离子，阳离子是含不同有机官能团的咪唑类离子，有机官能团为羧基或氨基；所述的功能化离子液体优选自1-甲基-3-羧乙基咪唑氯盐、1-乙基-3-羧乙基咪唑氯盐、氯化1-甲基-3-(3-氨基丙基)咪唑、1-甲基-3-羧乙基咪唑六氟磷酸盐、溴化1-甲基-3-(3-氨基丙基)咪唑或1-丁基-3-羧乙基咪唑四氟硼酸盐。

[0020] 所述的脂肪酶优选猪胰脂肪酶、根霉脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶或洋葱布克氏菌脂肪酶。

[0021] 本发明的有益效果：

[0022] (1)本发明首次将脂肪酶的化学修饰研究和离子液体中酶催化转化研究相结合，用功能性离子液体对脂肪酶表面进行化学修饰，影响酶活性中心的空间结构、从而达到强化脂肪酶的催化性能目的。

[0023] (2)本发明以N-羟基琥珀酰亚胺与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐联用活化功能化离子液体，大大提高了活化效率，缩短了反应时间，所用试剂对酶活的影响小，减少酶在修饰过程中的损失，降低成本。

[0024] (3)本发明将功能化离子液体活化后用于修饰脂肪酶，充分发挥了功能化离子液体在催化反应中的优点，并克服了现有技术中功能化离子液体作为反应介质时用量大，生产成本居高不下等缺陷。

[0025] (4)本发明中离子液体与脂肪酶通过共价结合减少离子液体用量的同时充分利用离子液体所具有的较强溶解性能，使酶催化的多相反应具有准均相反应的特点，缓解扩散限制对酶催化效率的影响，开发了一种新颖的脂肪酶修饰方法，拓展了离子液体在酶工程领域中的应用。

[0026] (5)本发明提供的功能化离子液体共价结合脂肪酶催化反应，具有良好的耐碱性、耐有机溶剂性等化学稳定性和耐温热稳定性。

[0027] (6)本发明与固定化方式相比，操作简单、方式灵活、周期短、见效快，是一种颇具实用价值的生物工程技术。

附图说明

[0028] 图1功能化离子液体修饰脂肪酶的模拟图。

[0029] 图2PH对离子液体修饰猪胰脂肪酶及游离猪胰脂肪酶的影响图。

[0030] 图3温度对离子液体修饰猪胰脂肪酶及游离猪胰脂肪酶的影响图。

[0031] 图4有机溶剂对离子液体修饰猪胰脂肪酶及游离猪胰脂肪酶的影响图。

具体实施方式

[0032] 实施例1

[0033] 1)1-甲基-3-羧乙基咪唑氯盐的合成：依据Jean Pierre Bazureau等人在(Rateaccelerations of 1，3-dipolar cycloaddition reactions in ionic liquids.Tetrahedron Letters，2000，41：7351-7355.)中的叙述，制备得到1-甲基-3-羧乙基咪唑氯盐，收率78.3％，纯度98.8％。

[0034] 2)功能化离子液体的活化：将0.17g 1-甲基-3-羧乙基咪唑氯盐与0.192g EDC·HCL及0.115gNHS溶于10ml MES，在30℃条件下反应1h。

[0035] 3)酶的修饰：将活化后功能化离子液体与纯化后的猪胰脂肪酶按摩尔比200∶1混合反应，反应温度控制在0-4℃，反应时间4h，超滤离心去除多余的修饰剂，浓缩酶。

[0036] 4)酶活测定：

[0037] 脂肪酶水解三醋酸甘油酯乳化液为探针反应。在温度50℃，PH为7.5，底物三醋酸甘油酯浓度为6.8％时，采用酸碱滴定法测定该酶的活力。修饰酶的表观活性为863lU/g，游离猪胰脂肪酶的表观活性为760lU/g脂肪酶。

[0038] 酶的表观活性计算公式为(以下表观酶活皆用此公式计算)：

[0039] U＝(V-V0)×50/(10×0.02)＝20(V-V0)

[0040] 其中：V——样品耗用的NaOH溶液的体积，ml；

[0041] V0——空白样耗用的NaOH溶液的体积，ml；

[0042] 50——每毫升NaOH溶液含有的NaOH的微摩尔数；

[0043] 10——反应时间，min；

[0044] 0.02——游离酶，g。

[0045] 按照本领域考察酶PH稳定性的常规方法分别考察了1-甲基-3-羧乙基咪唑氯盐修饰的猪胰脂肪酶和游离猪胰脂肪酶在PH6-9范围内的PH稳定性，结果见图2。由图2可看出，游离酶的最佳反应PH为7.5，而本发明所制备的功能化离子液体修饰的猪胰脂肪酶的最佳反应PH也为7.5，没有发生变化但表观酶活力显著提高，且在偏碱性条件下的酶活力仍然很高，可见由本发明所制备的功能化离子液体修饰的猪胰脂肪酶，其PH稳定性较之游离猪胰脂肪酶明显提高，拓宽了酶在不同PH下的使用范围。

[0046] 按照本领域考察酶温度稳定性的常规方法分别考察了1-甲基-3-羧乙基咪唑氯盐修饰的猪胰脂肪酶和游离猪胰脂肪酶在30～65℃范围内的温度稳定性，结果见图3。由图3可看出，游离酶的最佳反应温度为45℃，而本发明所制备的功能化离子液体修饰的猪胰脂肪酶的最佳反应温度为55℃，且表观酶活力显著提高，可见由本发明所制备的功能化离子液体修饰的猪胰脂肪酶，其温度稳定性较之游离猪胰脂肪酶明显提高。

[0047] 按照本领域考察了酶的耐有机溶剂性的常规方法考察了1-甲基-3-羧乙基咪唑氯盐修饰的游离猪胰脂肪酶及游离猪胰脂肪酶，结果如图4。由图4可知本发明所提供的经功能化离子液体修饰的猪胰脂肪酶较之未经修饰的猪胰脂肪酶具有更加优越的耐有机溶剂性，前者在70％浓度的DMF存在下仍然保存最初表观活性100％以上并且在纯DMF溶液中仍然有最初表观活性50％以上，而游离脂肪酶的酶活则一直在下降，在DMF浓度高的情况下已没有多少酶活。

[0048] 实施例2

[0049] 1)1-乙基-3-羧乙基咪唑氯盐的合成：依据Jean Pierre Bazureau等人在(Rate accelerations of 1，3-dipolar cycloaddition reactions in ionic liquids.Tetrahedron Letters，2000，41：7351-7355.)中的叙述，制备得到1-乙基-3-羧乙基咪唑氯盐，收率71.6％，纯度97.6％。

[0050] 2)功能化离子液体的活化：将0.18g 1-乙基-3-羧乙基咪唑氯盐与0.288g EDC·HCL及0.115gNHS溶于10ml MES，在室温条件下反应1.5h。

[0051] 3)酶的修饰：将活化后功能化离子液体与纯化后的根霉脂肪酶按摩尔比300∶1混合反应，反应温度控制在0-4℃，反应时间6h，超滤离心去除多余的修饰剂，浓缩酶。

[0052] 4)与实施例1制备修饰酶的操作条件相同，测得该功能化离子液体修饰根霉脂肪酶的表观活性为1120IU/g脂肪酶，而游离根霉脂肪酶的酶活力为990IU/g脂肪酶。

[0053] 实施例3

[0054] 1)氯化1-甲基-3-(3-氨基丙基)咪唑的合成：依据吴有庭等人在(一种含氨基的咪唑类离子液体化合物及其制备方法，CN100999498)中的叙述，制备得到氯化1-甲基-3-(3-氨基丙基)咪唑，收率82.7％，纯度98.1％。

[0055] 2)酶的修饰：将0.18g氯化1-甲基-3-(3-氨基丙基)咪唑、1.44mg EDC·HCL、0.58mgNHS及0.165洋葱假单胞菌脂肪酶溶于10ml MES，反应温度控制在0-4℃，反应时间
4h，超滤离心去除多余的修饰剂，浓缩酶。

[0056] 3)与实施例1制备修饰酶的操作条件相同，测得该功能化离子液体修饰洋葱假单胞菌脂肪酶的表观活性为2850lU/g脂肪酶，而游离洋葱假单胞菌脂肪酶的酶活为2240lU/g脂肪酶。

[0057] 实施例4

[0058] 1)1-甲基-3-羧乙基咪唑六氟磷酸盐的合成：依据Jean Pierre Bazureau等人在(Rateaccelerations of 1，3-dipolar cycloaddition reactions in ionic liquids.TetrahedronLetters，2000，41：7351-7355.)中的叙述，制备得到1-甲基-3-羧乙基咪唑氯盐，收率78.3％，纯度98.8％。将得到的1-甲基-3-羧乙基咪唑氯盐与KPF6在丙酮中室温搅拌一天得到离子液体.得到产物过滤，洗涤，分液，减压蒸馏蒸出丙酮和水，得到1-甲基-3-羧乙基咪唑六氟磷酸盐。收率58.8％，纯度95.8％

[0059] 2)功能化离子液体的活化：将0.28g 1-甲基-3-羧乙基咪唑六氟磷酸盐与0.192gEDC·HCL及0.115gNHS溶于10ml MES，在30℃条件下反应2h。

[0060] 3)酶的修饰：将活化后功能化离子液体与纯化后的洋葱假单胞菌脂肪酶按摩尔比700∶1混合反应，反应温度控制在0-4℃，反应时间3h，超滤离心去除多余的修饰剂，浓缩酶。

[0061] 4)与实施例1制备修饰酶的操作条件相同，测得该功能化离子液体修饰褶皱假丝酵母脂肪酶的表观活性为1600lU/g脂肪酶，而游离褶皱假丝酵母脂肪酶的酶活为1200lU/g脂肪酶。

[0062] 实施例5

[0063] 1)溴化1-甲基-3-(3-氨基丙基)咪唑的合成：依据吴有庭等人在(一种含氨基的咪唑类离子液体化合物及其制备方法，CN100999498)中的叙述，制备得到溴化1-甲基-3-(3-氨基丙基)咪唑，收率74.2％，纯度97.3％。

[0064] 2)酶的修饰：将0.22g溴化1-甲基-3-(3-氨基丙基)咪唑、1.44mg EDC·HCL、0.58mgNHS及0.165洋葱假单胞菌脂肪酶溶于10ml MES，反应温度控制在0-4℃，反应时间
10h，超滤离心去除多余的修饰剂，浓缩酶。

[0065] 3)与实施例1制备修饰酶的操作条件相同，测得该功能化离子液体修饰南极假丝酵母脂肪酶的表观活性为980lU/g脂肪酶，而游离南极假丝酵母脂肪酶的酶活为780lU/g脂肪酶。

[0066] 实施例6

[0067] 1)1-丁基-3-羧乙基咪唑四氟硼酸盐的合成：依据Jean Pierre Bazureau等人在(Rateaccelerations of 1，3-dipolar cycloaddition reactions in ionic liquids.TetrahedronLetters，2000，41：7351-7355.)中的叙述，制备得到1-丁基-3-羧乙基咪唑氯盐，收率65.1％，纯度97.2％。将得到的1-丁基-3-羧乙基咪唑氯盐与KBF4在丙酮中室温搅拌一天得到离子液体.得到产物过滤，洗涤，分液，减压蒸馏蒸出丙酮和水，得到1-丁基-3-羧乙基咪唑四氟硼酸盐。收率62.7％，纯度96.3％

[0068] 2)功能化离子液体的活化：将0.27g 1-丁基-3-羧乙基咪唑四氟硼酸盐与0.576gEDC·HCL及0.115gNHS溶于10ml MES，在28℃条件下反应2h。

[0069] 3)酶的修饰：将活化后功能化离子液体与纯化后的洋葱假单胞菌脂肪酶按摩尔比800∶1混合反应，反应温度控制在0-4℃，反应时间5h，超滤离心去除多余的修饰剂，浓缩酶。

[0070] 4)与实施例1制备修饰酶的操作条件相同，测得该功能化离子液体修饰洋葱布克氏菌脂肪酶的表观活性为380lU/g脂肪酶，而游离洋葱布克氏菌脂肪酶的酶活为220lU/g脂肪酶。