一种碱性果胶酶PLA及其基因和应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种碱性果胶酶PLA及其基因和应用。根据本发明的碱性果胶酶PLA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。本发明的碱性果胶酶的最适pH为9.0，在pH7.5-10.0之间有80％以上的酶活。具有良好的pH稳定性，在pH5.0-10.5之间稳定；比活797U/mg；极好的碱性蛋白酶抗性以及易于工业化发酵生产。做为一种新型的酶制剂，在纺织、造纸、洗涤剂、植物纤维加工、茶和咖啡发酵、油提取、含果胶工业废水处理及生物技术等行业都有应用价值。

权利要求

1.一种碱性果胶酶PLA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种碱性果胶酶PLA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种碱性果胶酶基因plA，其特征在于，编码权利要求1或2所述的果胶酶PLA。

4.如权利要求3所述的果胶酶基因plA，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

5.包含权利要求3或4所述果胶酶基因plA的重组载体。

6.包含权利要求3或4所述果胶酶基因plA的重组菌株。

7.一种制备果胶酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用权利要求5重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组果胶酶因的表达；以及

3）回收并纯化所表达的果胶酶PLA。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

9.权利要求1或2所述的果胶酶PLA用于降解果胶的应用。

说明书

一种碱性果胶酶PLA及其基因和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种碱性果胶酶PLA及其基因和应用。

背景技术

[0002] 果胶质是广泛存在于高等植物初生壁和细胞间隙中的一组多糖，在植物的细胞组织中起着“粘合”的作用。构成果胶质的基本单元是不同酯化度的半乳糖醛酸，D-半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键相连接作为主链，并以鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖及其他糖类连接在其主链上作为支链(Thakur BR，et al.Crit Rev Food Sci Nutr.37：47-73，1997)。

[0003] 果胶酶(pectinases)是分解果胶质的多种酶的总称。由于果胶质的化学结构比较复杂.能够催化其分解的果胶酶也是种类繁多。果胶酶根据分解糖苷键的反应性质或降解底物的性质可以分为：果胶水解酶(pectin hydrolases)、果胶裂解酶(pectin lyases，PL)、果胶酯酶(pectin esterases，PE)和原果胶酶(Alkorta I，et al.Process Biochem33：21-28，1998)。果胶酶按其作用最适pH分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。目前研究和应用较多的是酸性果胶酶，其酶作用最适pH在偏酸性范围，主要用于水果榨汁和果汁澄清。碱性果胶酶(Alkaline pectinase)则是指在碱性范围内具有较高活性的果胶酶，一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶(Polygalacturonate lyase，简称PGL)。其最适pH在8.0-10.0，可以在高pH条件下断开果胶聚合物主链，产寡聚半乳糖醛酸。碱性果胶酶是非常重要的工业酶制剂之一，具有不可估量的潜在应用价值。目前，碱性果胶酶在植物药提取、茶和咖啡发酵、油提取，纺织、造纸、洗涤剂、植物纤维加工、含果胶工业废水处理及生物技术等行业的应用越来越受到重视，所以成为人们研究的热点(Jayani RS，et al.Process Biochemistry 40：2931-2944，2005)。

[0004] 碱性果胶酶多由细菌中的杆菌属和假单胞菌属产生(Hayashi K，et al.Phytochemistry 45：1359-1363，1997)， 放 线 菌 (Beg QK，et al.J Ind MicrobiolBiotechnol 24：396-402，2000)和真菌产碱性果胶酶也有报道(Baracat et al.J IndMicrobiol 11：139-142，1993)。不同来源的碱性果胶酶生化性质差异较为明显。
来源于Bacillus licheniformis(Singh SA，et al.Process Biochem.35：411-417，1999)和Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersci(Pietro AD，et al.FEMS Microbiol Lett.145：
295-298，1996)的碱性果胶酶的最适pH为11.0。来源于Bacillus alcalophillusNTT33果胶酶的最适pH为9.5(Zhai C，et al.Enzyme and Microbial Technology.33：173-178，
2003)。来源于Pseudomonas marginalis CFBP 1287的果胶酶的最适pH为8.5-9.0(Membre and Burlot，Appl Environ Microbiol.60：2017-2022，1994)。报道的碱性果胶酶的最适温度在30-70℃之间。一些碱性果胶酶的基因已经被克隆，并且已经大肠杆菌、毕赤酵母等表达系统中进行了表达(Zhai C，et al.Enzyme andMicrobial Technology.33：173-178，
2003；王芸等，微生物学通报，35(3)：341-345，2008)。但碱性果胶酶的表达量仍然很低，由于成本问题，至今未得到广泛应用。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种产碱性果胶酶的菌株Klebsiella sp.Y1。

[0006] 本发明再一目的是提供来源于上述菌株的碱性果胶酶。

[0007] 本发明的再一目的是提供上述果胶酶的基因。

[0008] 本发明的再一目的是提供包含上述果胶酶的重组载体。

[0009] 本发明的再一目的是提供包含上述果胶酶基因的重组菌株。

[0010] 本发明的再一目的是提供一种制备碱性果胶酶的方法。

[0011] 本发明的再一目的是提供上述碱性果胶酶的应用。

[0012] 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的新酶。本发明人筛选到一种天然菌株，其来自于该克雷伯氏菌Klebsiella sp.，它所产生的果胶酶适合于在纺织、造纸、洗涤剂、植物纤维加工、茶和咖啡发酵、油提取、含果胶工业废水处理及生物技术等行业中使用。

[0013] 本发明从上述菌株中获得了一种碱性果胶酶PLA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

[0014] 1 MKIAKITLAL GVLSLFSLNA GAQENERLSS VKQFADVVLD KASDRYGHYS

[0015] 51 PLLANGVDPR TGKQMEWVFP DGKVTVLSNF SAQQNLMRML VGLSNLTGET

[0016] 101 KYKQRVAENI RYYFDHYQDA SGLLLWGGHR FVDLKTLQPQ GPSEKERVHE

[0017] 151 LKNAYPYYDM MFAVDDQATA RFIKAFWNAH VYDWKTLETS RHGEYGKPMG

[0018] 201 ALWQSDFVQQ PPFFATKGLS FLNAGNDLIY SASLLYQYDG DAGALTWAKR

[0019] 251 LAEQYVLPRD KKTGLGVYQF TQPLKRADTS DDSDTHSKYG DRAQRQFGPE

[0020] 301 LGPDALEGNM LLKGRTSTLY SENALMQLAL AKSLGKDGDD LKKWTLDGLK

[0021] 351 AFATYAYDEQ NNTFRPMLAN GTDLSDYALK RDGYYGKKGT VLKAYPAGNE

[0022] 401 FLLSYARAWT LEPDHAIWKV ARGIAKGQGL GDIGEPGGTN RRLNSQTENH

[0023] 451 QPYAIFALID LWQSTGQRDY LTLADRIGAN IINKQRLNGF FVDDPEAEYA

[0024] 501 SIDSIAPYAL LALEAAFRNT PDAVAPFLNG AGFTEGAYRM ADGTVRYSTR

[0025] 551 DDELFRLRPG EQLKPNGKK*

[0026] 其中，该酶基因编码569个氨基酸和一个终止密码子，N端22个氨基酸为其预测的信号肽序列“MKIAKITLALGVLSLFSLNAGA”。

[0027] 因此，成熟的碱性果胶酶PLA的理论分子量为63.8kDa，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示：

[0028] 1 QENERLSSVK QFADVVLDKA SDRYGHYSPL LANGVDPRTG KQMEWVFPDG

[0029] 51 KVTVLSNFSA QQNLMRMLVG LSNLTGETKY KQRVAENIRY YFDHYQDASG

[0030] 101 LLLWGGHRFV DLKTLQPQGP SEKERVHELK NAYPYYDMMF AVDDQATARF

[0031] 151 IKAFWNAHVY DWKTLETSRH GEYGKPMGAL WQSDFVQQPP FFATKGLSFL

[0032] 201 NAGNDLIYSA SLLYQYDGDA GALTWAKRLA EQYVLPRDKK TGLGVYQFTQ

[0033] 251 PLKRADTSDD SDTHSKYGDR AQRQFGPELG PDALEGNMLL KGRTSTLYSE

[0034] 301 NALMQLALAK SLGKDGDDLK KWTLDGLKAF ATYAYDEQNN TFRPMLANGT

[0035] 351 DLSDYALKRD GYYGKKGTVL KAYPAGNEFL LSYARAWTLE PDHAIWKVAR

[0036] 401 GIAKGQGLGD IGEPGGTNRR LNSQTENHQP YAIFALIDLW QSTGQRDYLT

[0037] 451 LADRIGANII NKQRLNGFFV DDPEAEYASI DSIAPYALLA LEAAFRNTPD

[0038] 501 AVAPFLNGAG FTEGAYRMAD GTVRYSTRDD ELFRLRPGEQ LKPNGKK*

[0039] 该果胶酶PLA同时具有好的pH稳定性，在低温(0℃)、常温及较高温下具备高活性、在碱性和中性的范围内均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本发明筛选到的克雷伯氏菌Klebsiella sp.Y1所产生的果胶酶，其最适pH9.0，在pH7.5-10.0的范围内维持80％以上的酶活性；最适温度50℃，在20-60℃之间有85％以上的酶活，在0℃能维持35％以上的酶活。具有良好的pH稳定性，在pH5.0-10.5之间稳定；比活797U/mg；极好的碱性蛋白酶抗性以及易于工业化发酵生产。

[0040] 本发明还提供了编码上述碱性果胶酶的基因。本发明通过PCR的方法分离克隆了这一碱性果胶酶基因plA，基因plA全长1710bp，该酶的全基因序列如SEQ ID NO.3所示：

[0041] 1 ATGAAGATTG CAAAAATCAC TCTGGCATTG GGCGTTCTGA GTCTCTTCTC ACTGAATGCG[0042] 61 GGTGCCCAGG AGAACGAGCG CCTGAGCAGC GTAAAGCAGT TCGCCGACGT CGTGCTGGAC[0043] 121 AAAGCAAGCG ATCGGTACGG GCATTACTCT CCCCTGCTGG CTAATGGCGT GGACCCACGC[0044] 181 ACCGGCAAAC AAATGGAATG GGTATTTCCG GACGGTAAAG TGACCGTGCT GTCGAACTTC[0045] 241 TCTGCCCAGC AAAACTTGAT GCGGATGCTG GTAGGGTTAA GCAACCTGAC TGGCGAAACA[0046] 301 AAATATAAAC AGCGGGTCGC GGAGAATATA CGCTACTACT TTGACCACTA TCAGGATGCA[0047] 361 AGCGGGCTGC TGCTATGGGG AGGGCATCGT TTTGTTGATT TAAAAACGCT GCAGCCTCAA[0048] 421 GGCCCAAGTG AAAAAGAGCG GGTTCATGAA CTTAAGAATG CCTATCCCTA TTACGACATG[0049] 481 ATGTTTGCCG TCGATGACCA GGCGACCGCG CGCTTTATCA AGGCTTTCTG GAATGCCCAT[0050] 541 GTTTACGACT GGAAAACGCT GGAAACCAGC CGCCACGGGG AGTACGGCAA ACCGATGGGC[0051] 601 GCGCTCTGGC AAAGTGATTT TGTCCAACAG CCGCCCTTTT TCGCCACCAA AGGTCTGAGC[0052] 661 TTTCTCAATG CCGGCAACGA CCTGATCTAC TCCGCATCGC TGCTGTATCA ATACGATGGT[0053] 721 GACGCTGGCG CACTGACGTG GGCAAAACGG CTGGCCGAAC AGTACGTTCT GCCGCGAGAT[0054] 781 AAGAAGACCG GGCTGGGCGT ATACCAGTTT ACCCAACCGT TAAAACGCGC CGATACCAGC[0055] 841 GATGACAGCG ACACGCATTC GAAATACGGC GACCGCGCGC AGCGTCAGTT TGGCCCGGAA[0056] 901 CTGGGCCCGG ACGCGCTGGA AGGCAATATG CTGCTTAAGG GCCGAACCAG TACGCTCTAT[0057] 961 TCAGAAAATG CGCTGATGCA GCTTGCCCTG GCAAAATCGC TCGGCAAAGA CGGTGACGAT[0058] 1021 CTCAAAAAAT GGACTCTTGA TGGCCTCAAG GCCTTCGCGA CCTACGCTTA CGATGAGCAG[0059] 1081 AATAATACCT TCCGCCCGAT GCTGGCCAAC GGCACGGATC TCTCCGACTA CGCGTTAAAA[0060] 1141 CGCGATGGCT ATTATGGAAA AAAAGGGACG GTGCTCAAAG CCTATCCGGC GGGAAATGAA[0061] 1201 TTTCTTCTCT CCTATGCCCG CGCCTGGACG CTTGAACCGG ATCATGCCAT CTGGAAGGTC[0062] 1261 GCCCGCGGCA TCGCGAAAGG CCAGGGGTTA GGCGATATCG GTGAACCCGG CGGCACAAAC[0063] 1321 CGCAGGCTGA ATAGCCAAAC GGAGAATCAT CAGCCGTATG CGATTTTCGC GCTTATCGAC[0064] 1381 CTGTGGCAGT CCACCGGGCA GCGGGATTAT TTGACGCTGG CGGATCGCAT CGGCGCGAAC[0065] 1441 ATCATCAACA AGCAGCGCCT CAACGGCTTT TTTGTCGATG ATCCTGAGGC AGAATATGCC[0066] 1501 AGTATCGATA GTATCGCCCC CTATGCGCTT CTCGCCCTGG AAGCCGCCTT CCGCAACACG[0067] 1561 CCGGACGCGG TCGCTCCGTT CCTGAACGGC GCTGGATTCA CGGAAGGCGC TTATCGGATG[0068] 1621 GCTGACGGAA CCGTGCGCTA CTCCACCCGA GATGACGAGC TGTTCAGGCT CAGACCCGGT[0069] 1681 GAGCAGCTGA AACCGAACGG CAAAAAATAA

[0070] 其中，信号肽的碱基序列为：ATGAAGATTG CAAAAATCAC TCTGGCATTG GGCGTTCTGA[0071] GTCTCTTCTC ACTGAATGCG GGTGCC。

[0072] 成熟蛋白理论分子量为63.8kDa。将碱性果胶酶基因plA DNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对。发现与来源于Enterobacter sp.638的果胶裂解酶的核苷酸序列一致性为78.9％，氨基酸序列一致性为85.8％。为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因材料。说明PLA是一种新的碱性果胶酶。这也是第一次从克雷伯氏菌中克隆得到碱性果胶酶基因。

[0073] 本发明还提供了包含上述果胶酶基因的重组plA载体。

[0074] 本发明还提供了包含上述果胶酶基因plA的重组菌株。

[0075] 本发明还提供了一种制备碱性果胶酶的方法，包括以下步骤：

[0076] 1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。

[0077] 2)培养重组菌株，诱导重组果胶酶的表达；以及

[0078] 3)回收并纯化所表达的果胶酶。

[0079] 本发明还提供了上述碱性果胶酶的应用。

[0080] 本发明的碱性果胶酶的最适pH为9.0，在pH7.5-10.0之间有80％以上的酶活。具有良好的pH稳定性，在pH5.0-10.5之间稳定；比活797U/mg；极好的碱性蛋白酶抗性以及易于工业化发酵生产。做为一种新型的酶制剂，在纺织、造纸、洗涤剂、植物纤维加工、茶和咖啡发酵、油提取、含果胶工业废水处理及生物技术等行业都有应用价值。

附图说明

[0081] 图1plA在大肠杆菌中表达的果胶酶的SDS-PAGE分析，1，分子量标准；2。3诱导培养基上清；4，穿透峰5，NTA-0；6，NTA-20；7，NTA-40；8，NTA-60；9，NTA-80；纯化的重组果胶酶。

[0082] 图2本发明重组果胶酶的最适pH值。

[0083] 图3本发明果胶酶的pH稳定性。

[0084] 图4本发明果胶酶最适反应温度。

[0085] 图5本发明果胶酶的热稳定性。

[0086] 图6本发明果胶酶的金属离子抗性

具体实施方式

[0087] 试验材料和试剂

[0088] 1、菌株及载体：宿主大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，载体pET-22b(+)，购自于Novagen公司。

[0089] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。果胶、半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

[0090] 3、培养基：

[0091] (1)诱导选择培养基：0.5％果胶，0.5％蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.1％KH2PO4，0.2％CuSO4，0.1％CaCl2，pH9.0。

[0092] (2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。

[0093] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

[0094] 实施例1克雷伯氏菌果胶酶编码基因plA的克隆

[0095] 克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)来源于广西果汁厂的土样，提取克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)基因组DNA：将在LB培养基中30℃培养了2d的菌液10000rpm离心10min，称取50mg菌泥加500μL无菌水清洗，离心取沉淀的菌体。沉淀的菌体重悬于500μL溶菌酶混合液，37℃温育1h，再补加酶液100μL于45℃继续保温30min，至菌液透明后，加
10％SDS至终浓度2％，搅拌约5min至菌液粘度显著下降，15000rpm离心10min去碎片。上清液分别用等体积酚，酚：氯仿，氯仿依次抽提。取上层溶液加0.6-1倍体积的异丙醇常温沉淀10min。16000rpm离心15min。沉淀用70％乙醇清洗，稍离心，将沉淀抽干后用30μL无菌水溶解，-20℃保存备用。

[0096] 根据发表的果胶裂解酶的序列比对结果找到两个保守氨基酸序列 保 守 序 列 GLF(L)Y(L)WGGH和 RQFGPE，并 设 计 合 成 了 简 并 引 物 PL9-F，
5′-CTGTTYTAYTGGGGYGGRCA-3′；PL9-R，5′-CTCNGGNCCRAAYTGTCG-3′(Y代表C/T，R代表G/A，N代表A/T/C/C)，以克雷伯氏菌Y1的总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：
95℃5min；94℃30sec，53-48℃30sec(其中每个循环后复性温度下降0.5℃)，72℃1min，
10个循环，然后进入第二个循环程序：94℃30sec，48℃30sec，72℃1min，25个循环后；
72℃10min，琼脂糖电泳检测。得到的片段测序。

[0097] 根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1，usp2，usp3(上游特异性引物)，dsp1，dsp2，dsp3(下游特异性引物)见表1。

[0098] 表1果胶酶plA TAIL-PCR特异性引物

[0099]

[0100] 通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后测序。

[0101] 将简并引物得到的核心片段与经TAIL-PCR得到的侧翼序列进行拼接得到plA全长基因。结果表明，该基因为一个长1710bp的基因片段，编码569个氨基酸和一个终止密码子。N端22氨基酸为其信号肽序列。酶蛋白与来源于Enterobacter sp.638的果胶裂解酶的氨基酸序列一致性为85.8％。与来源于Pectobacterium wasabiae WPP163的果胶裂解酶的序列一致性为71％。该编码基因为一个新基因。

[0102] 实施例2果胶酶的酶活性分析

[0103] 酶活性测定方法采用DNS法。在pH9.0，50℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

[0104] 实施例3重组果胶酶的制备。

[0105] 根据测序结果设计引物：

[0106] PLAF(5’-CTGCCATGGCAGGAGAACGAGCGCCTGAGCAGCGTAAAGC-3’，下 划线 为Nco I位点)和PLAR(5’-CTTGCGGCCGCTTATTTTTTGCCGTTCGGTTTCAGCTGCTCAC-3’)，下划线 为Not I位点)，进行PCR扩增。质粒pET22b(+)和基因片断进行双酶切后连接形成载体pET22b(+)-plA，制备BL21(DE3)感受态细胞，将重组质粒pET22b-plA电击转化宿主菌。鉴定阳性重组子，并诱导检测酶活。取含有重组体质粒的BL21(DE3)菌株和含有pET22b(+)空质粒的BL21(DE3)菌株(作对照)，分别接种于3mL LB(加有100μg/mL的氨苄青霉素)培养液中，37℃快速振荡培养过夜。分别取100μL过夜培养液加入含100μg/mL的氨苄青霉素的10mL LB培养液(1％接种量)中，30℃振荡培养约2-3h(OD600达到0.6-0.8)后加入终浓度0.8mmol/L的诱导剂IPTG，30℃180rpm震荡培养8h。培养液12,000rpm离心5min，分别收集培养基上清和沉淀，细胞沉淀用pH9.0的缓冲液重悬，超声破碎后12,000rpm离心10min，收集上清为细胞总蛋白(CTP)。按上述酶活测定方法分别检测培养基上清和CTP酶活。结果重组酶主要分泌到上清，上清中的酶活性为0.12U/ml。经SDS-PAGE电泳检测，可以看见一条明显的特异性条带(图1，LANE2，LANE3)。

[0107] 大肠杆菌诱导产生的果胶酶PLA经Ni-NTA柱纯化(NEB)，比活提高至797U/mg。纯化PLA经SDS-PAGE得到电泳纯的单一条带，分子量约为63kDa与预测分子量相近(图1，LANE 9)。

[0108] 实施例4果胶酶PLA的酶学性质

[0109] 经纯化的果胶酶PLA在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 2.0～8.0的0.1mol/L的McIlvaine缓冲液和pH 9.0～11.0的0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液。纯化的果胶酶PLA在不同pH的缓冲体系，50℃下测定的pH适性结果(图2)表明：PLA的最适作用pH为9.0，在pH7.5-10.0之间有80％以上的酶活。将酶液在不同pH值的缓冲液中于37℃下处理1h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图
3)，PLA在pH范围为5.0-10.5间都很稳定，保持80％以上的酶活。

[0110] 最适温度的测定在pH9.0的0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液体系及不同的温度(0～90℃)下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，PLA的最适作用温度50℃，在30℃和60℃之间，保持85％以上的酶活。在0℃仍然有35％的酶活。温度高于60℃时剩余不到2％的酶活。

[0111] 测定果胶酶在50℃和60℃下分别保温不同时间测定相对酶活力，绘制酶的热稳定性曲线。在50℃下处理10min后酶活剩余约70％，热稳定性较好(图5)。

[0112] 不同金属离子化学试剂对PLA酶活的影响测定如下：

[0113] 在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1和5mmol/L。在50℃、pH9.0条件下测定酶活性。结果(图6)2+ 2+
表明，低浓度的Cu 和β-巯基乙醇及1mmol/L Co 的对果胶酶PLA有明显的激活作用。
2+ 2+ 3+ 2+ 2+ 2+ 2+ + +
5mmol/L的Co ，Ni ，Fe ，Zn ，Mn ，Pb ，Hg ，EDTA和SDS强烈抑制PLA的活性。Li，Na，+ 2+
K 和Mg 对酶活没有影响或有一定的激活作用。

[0114] 用不同浓度(1-20mg/mL)的多聚半乳糖醛酸(PGA)为底物，在pH 9.0的甘氨酸-NaOH反应体系中，50℃下测定酶活性，计算出其在50℃下的Km值。经测定，此果胶酶在50℃下以PGA为底物的表观Km值为13.31mg/ml，最大反应速度Vmax为253.4μmol/min/mg。

[0115] 实施例5果胶酶PLA的底物特异性

[0116] 分别以PGA和酯化程度分别为34％，70％和85％的柑橘果胶为底物测定果胶酶活力。以PLA对PGA的活力为100％，则以34％，70％和85％的柑橘果胶为底物测定果胶酶相对活力分别为92％，23.9％和4.5％。