抑制植物病毒的人工miRNA及其构建和用途

摘要

本发明涉及抑制植物病毒的人工miRNA及其构建和用途。本发明首次根据侵染植物的病毒中基因沉默抑制子的核酸序列，设计出了沉默效果优异的寡核苷酸。这些寡核苷酸导入到植物体内后，在病毒侵染植物时，能够在植物体内形成miRNA，从而特异性结合到病毒基因沉默抑制子的mRNA的相应部位，影响mRNA的转录作用，从而达到抑制病毒的效果。并且，本发明的寡核苷酸是基于比对不同病毒亚型来源的病毒基因沉默抑制子而定位到的最为保守的位置来优化和设计的，基于这些位置设计的寡核苷酸，在导入植物体内后具有较广谱的抗相关病毒的效果。

权利要求

1.一种分离的或人工构建的寡核苷酸，所述的寡核苷酸选自：(i)SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:4任一所示序列的寡核苷酸；或(ii)与(i)限定的任一序列互补的寡核苷酸。

2.一种构建物，所述的构建物含有权利要求1所述的寡核苷酸，且其在导入植物细胞、组织或器官后，能够表达权利要求1中(i)所述的寡核苷酸的miRNA；

所述的构建物含有至少一组式I所示的结构：Seq正向-X-Seq反向 式I；

式I中，

Seq正向为权利要求1所述的寡核苷酸序列；

Seq反向为与Seq正向互补的寡核苷酸序列；

X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。

3.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述构建物中含有：选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的序列；和选自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的序列。

4.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述的构建物是表达载体。

5.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，式I所示的结构在转入植物细胞后，形成式II所示的二级结构： 式II，

式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，||表示在Seq正向和Seq反向之间的互补的关系。

6.权利要求1所述的寡核苷酸或权利要求2-5任一项所述的构建物的用途，所述寡核苷酸或构建物用于制备抗病毒的试剂；或所述寡核苷酸或构建物用于制备提高植物抗病毒能力的试剂；所述的病毒是：芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus.)或黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus.)。

7.一种提高植物抗病毒能力的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：(a)提供权利要求2-5所述的任一构建物；

(b)将(a)中所述的构建物导入到植物中；

所述的病毒是：芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus.)或黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus.)。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的将构建物导入到植物的方法包括：(1)提供携带权利要求2-5所述的任一构建物的农杆菌；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物。

9.一种miRNA，其是SEQ ID NO:37-SEQ ID NO:40任一所示核苷酸序列的miRNA。

说明书

抑制植物病毒的人工miRNA及其构建和用途

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及抑制植物病毒的人工miRNA及其构建和用途。

背景技术

[0002] 白菜类蔬菜主要包括结球类大白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensis)和不结球类小白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis)。小白菜简称青菜，北方称油菜，其适应性强，生长快，产量高，营养好，消费量居各类蔬菜之首，是我国长江流域各省普遍栽培的一种大众化蔬菜。小白菜种类和品种繁多，生长期短，适应性广，高产，省工，易种，可周年生产供应。产品鲜嫩、营养丰富，为广大消费者所喜爱。其年产量占蔬菜总产量的30％-40％，对补充蔬菜淡季、实现周年均衡供应贡献很大。大白菜和小白菜特性都为喜凉性，一年四季均可生产，生长最适温度为15～20℃。近年来，为了适应市场的需要，集约栽培是白菜类蔬菜生产的主要特点。为了保证白菜类蔬菜一年四季的均衡生产和供应，小白菜常需一年四季采用不同的方式进行生产。

[0003] 十字花科蔬菜中，大白菜、小白菜、油菜、萝卜、甘蓝等都可受病毒侵染，造成病毒病，其中大白菜病毒病是白菜类蔬菜危害最严重的三大病害之一。能够侵染大白菜并导致严重病毒病害发生的主要病原病毒有三种，即芜菁花叶病毒(TuMV，Turnip mosaic virus.)、黄瓜花叶病毒(CMV，Cucumber mosaic virus.)和烟草花叶病毒(TMV，Tobacco mosaic virus.)。TuMV是一种曲线条状病毒，长680-750nm，在十字花科蔬菜以及菠菜、芥菜等蔬菜和杂草上都可存在，它的体外存活期只有2-4天，稀释终点为1000-10000倍，致死温度55-60℃。在幼苗中的潜育期受温度影响，偏低时潜育期长，偏高时潜育期短，在9-14天之间，靠蚜虫作介体进行汁液传播。在华北和东北地区，当露地没有白菜和其他寄主生长时，窖藏的白菜及其他十字花科蔬菜以及它们的种株上可以有病毒继续存在，成为第二年春暖花开季节菜田的初侵染来源。有温室及塑料大棚的地区，则成为病毒随越冬寄主循环传播的初侵染来源。四季常青的南方地区，病毒不存在越冬问题，一年四季循环侵染。以往主要在春冬季生产小白菜，开始在较炎热的夏秋季采取各种栽培方式种植小白菜，无疑在其生育期内，尤其是春末、夏季和早秋往往会受到病毒病的侵害。高温季节栽培小白菜在20天以后即可分批上市，但高温障碍往往使小白菜植株产生病毒病，常常导致产量低、品质差，市场价格上扬，供不应求，不能满足居民的消费需求。

[0004] 大白菜和小白菜原产我国，国外对白菜类蔬菜的育种研究较少，从日本、韩国及我国台湾地区引进的品种抗病性差，不适宜在我国夏季生长和推广。国内所选育的品种主要为秋季栽培品种，白菜类蔬菜抗病毒病基因库窄，抗病白菜品种选育仅局限于白菜材料之间的筛选，选出的品种抗病性不够理想。鉴于上述情况，我国育种家采用传统的育种方法广泛开展抗病白菜类蔬菜品种的选育工作，引进抗病基因，扩大资源来源途径，一定程度提高了白菜类蔬菜抗病能力，在生产上已经发挥了作用。然而，病毒本身变异性强，地域性不同会产生许多新的生理小种，以前推出的抗病品种在一定程度上丧失抗病性。且有地域性限制，不能将耐病品种广泛推广到其他地区。因此对白菜类蔬菜病毒病症状的发生发展变化规律进行深入的研究，建立易于操作，结果稳定，效率较高的具有广泛推广性的抗病毒病筛选方法和技术是白菜类蔬菜抗病育种工作亟需解决任务。与白菜抗病密切相关的性状属于数量性状，对其数量性状的基因型进行选择是非常困难的。针对分子育种，这种难度不仅表现在可利用与辅助选择的DNA标记不多，且QTL(Quantitative Traits Loci，数量性状位点)在数目和作用上变化较大。因此，在白菜基因组测序工作尚未完成，功能基因组研究方兴未艾的情况下，遗传育种学家需要寻找一种快速、敏感、高效的，在植株水平上各性状和DNA定性分析技术，以及植株水平上表型和基因表达变化的定量分析技术，用以白菜类蔬菜抗病育种研究。

[0005] 近年来分子生物学研究发展迅速，基因工程技术是20世纪90年代中期以来影响最为深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术。目前，基因技术已广泛应用于药物筛选、农业、疾病诊断和治疗、中药物种鉴定、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防等许多领域。关于基因技术在植物中应用的报道并不少，主要集中在拟南芥、草莓、牵牛花等方面。

[0006] 植物病毒病的种类很多，分布很广，对农作物的危害严重。通常，植物病毒病的症状是植株形态异常，植物生长和发育呈现系统性受阻。以大白菜为例，幼苗期受害时，心叶初期产生明脉，病叶皱缩变脆、扭曲畸形，重病株明显矮缩，不包心，叶片硬脆、皱缩成团，根系不发达。长期以来，病毒是如何造成植物的系统性侵染一直是困扰植物保护学家的科学难题。有趣的是，这些病毒病症状与模式植物拟南芥dicer-likel(dcll)、hyponastic leaves(hyll)、serrate(se)和agonautel(agol)等突变体的表型非常相似。在高等植物中，DCL1、HYL1和SE蛋白参与miRNA的生物加工，AGO1蛋白是基因沉默(gene silencing)的关键蛋白。这些蛋白的功能是保持植物体内的基因沉默反应，保证植物正常的生长发育。基因缺失或突变都会影响下游靶基因的沉默反应，引起类似于植物病毒病症状的形态反应。一般情况下，正常的植物基因沉默具有抗病毒和减轻病毒危害的作用。近年来的研究发现，病毒病症状与miRNA合成途径突变体的相似性在分子水平上是有联系的。在病毒基因组中存在着RNA沉默的抑制子(suppressor)，该抑制子会干扰植物DCL1、HYL1、SE或AGO1蛋白或有关miRNA的功能，使植物基因沉默途径受损，并引起一系列形态反应。

[0007] miRNA(21-24nt)是基因组和蛋白质组之间的信使分子，在生物体内行使多种调控功能。在植物中，miRNA主要参与基因组稳定化、基因沉默和生物防卫等过程。在DCL1、HYL1和HEN1的共同作用下，前体miRNA(pre-miRNA)经剪切加工产生成熟的miRNA，而成熟的miRNA在RISC(miRNP/RNA-induced silencing complex，miRNP/RISC)作用下可以与靶基因mRNA上的互补序列相结合，使靶基因mRNA降解而抑制其表达。AGO1蛋白参与RISC沉默复合体的作用过程。最新的统计数据表明，拟南芥有46个miRNA家族和117个miRNA基因[Small RNA-directed epigenetic natural variation in arabidipsis thaliana.PLOS genetics(2008)4：e1000056]。随着miRNA诊断技术的提高，还将有新的miRNA被不断发现。

[0008] 在植物体内，pre-miRNA经剪切加工产生成熟的miRNA，而后者以序列互补的方式降解靶基因的mRNA。利用植物miRNA加工的特性，有些实验室构建了抗病毒病的人工miRNA载体。其原理是，将植物pre-miRNA序列中内源的成熟miRNA用病毒的沉默抑制子(如P1/HC-Pro)片段取而代之，构建pre-miRNA的基因表达载体，在农杆菌的介导下转入植物，在植物体内产生人工miRNA，降解病毒基因沉默抑制子的mRNA，解除病毒基因沉默抑制子对植物基因沉默的阻断作用，以达到病毒病症状无法出现的目的。这种抗病毒病的新策略在植物抗病育种中有广阔的应用前景。2006年，Niu等利用P1/HC-Pro的pre-miR165载体创建了拟南芥的转基因植物，使P1/HC-Pro人工miRNA成功表达[Niu，Q.W.，Lin，S.S.，Reyes，J.L.，Chen，K.C.，Wu，H.W.，Yeh，S.D.and Chua，N.H.(2006)Expression of artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance.Nat Biotechnol，24，1420-1428]。该miRNA引起P1/HC-Pro的mRNA降解，所筛选的植株对某些TuMV和TYMV病毒的株系表现出较强的抗性。目前，人工miRNA抗病毒病的研究还停留在模式植物拟南芥上，而且抗病毒的对象限制在一些病毒的美洲株系。另一方面，影响人工miRNA生物加工、成熟和靶基因沉默的因素很多，需要对整个人工miRNA体系进行改进和优化，以提高转基因植物抗病毒病的效率。更重要的是，如何将人工miRNA体系应用于农作物和经济作物，使之成为植物抗病育种的有效途径。

[0009] 长期以来，育种学家通过有性杂交的方法培育抗病毒性状的优良品种，而栽培学家为了生产优质蔬菜产品设法减轻病毒病的危害。然而，由于学科发展水平和研究手段的制约，也由于病毒病症状复杂的遗传现象，人们很难依据传统的遗传学理论来判断这些症状的遗传规律。反映在育种实践上，育种学家常常被复杂的抗病毒机制所困扰。要提高大白菜抗病毒育种的进度，培育新一代抗病品种，就必须发展新的抗病毒育种新技术。

发明内容

[0010] 本发明的目的在于提供抑制植物病毒的人工miRNA及其构建和用途。

[0011] 在本发明的第一方面，提供一种分离的或人工构建的寡核苷酸，所述的寡核苷酸选自：

[0012] (i)SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4任一所示序列的寡核苷酸；或

[0013] (ii)与(i)限定的任一序列互补的寡核苷酸。

[0014] 在本发明的另一方面，提供一种构建物，所述的构建物含有所述的寡核苷酸，且其在导入植物细胞、组织或器官后，能够表达所述的寡核苷酸所对应的miRNA。

[0015] 在另一优选例中，所述构建物中含有：

[0016] 选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的序列(对应于黄瓜花叶病毒(CMV))；和[0017] 选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的序列(对应于芜菁花叶病毒(TuMV))。

[0018] 在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。

[0019] 在另一优选例中，所述的表达载体是pBSK载体。

[0020] 在另一优选例中，所述的构建物含有至少一组式I所示的结构：

[0021] Seq正向-X-Seq反向 式I；

[0022] 式I中，

[0023] Seq正向为所述的寡核苷酸序列；

[0024] Seq反向为与Seq正向基本上互补的寡核苷酸序列；

[0025] X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。

[0026] 在另一优选例中，式I所示的结构在转入植物细胞后，形成式II所示的二级结构：

[0027] 式II，

[0028] 式II中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述，

[0029] ||表示在Seq正向和Seq反向之间的基本上互补的关系。

[0030] 在另一优选例中，所述的间隔序列的长度是5-500个核苷酸(nt)；更佳地是10-300nt；更佳地是50-200nt；更佳地是80-150nt；更佳地是120-140nt，如130nt。

[0031] 在另一优选例中，所述的构建物含有：

[0032] (Seq正向1-X-Seq反向1)(Seq正向2-X-Seq反向2) 式III；

[0033] 式III中，

[0034] Seq正向1为选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的序列；

[0035] Seq正向2为选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的序列；

[0036] Seq反向1和Seq反向2为分别与Seq正向1和Seq正向2基本上互补的寡核苷酸序列。

[0037] 式III所示的结构在转入植物细胞后，形成两个茎环结构。

[0038] 在本发明的另一方面，还提供所述的寡核苷酸的用途，用于制备抗病毒的试剂；或用于制备提高植物抗病毒能力的试剂。

[0039] 在本发明的另一方面，还提供所述的构建物的用途，用于制备抗病毒的试剂；或用于制备提高植物抗病毒能力的试剂。

[0040] 在本发明的另一方面，还提供一种提高植物抗病毒能力的方法，所述的方法包括步骤：

[0041] (a)提供所述的构建物；

[0042] (b)将(a)中所述的构建物导入到植物(包括植物细胞、组织或器官)中。

[0043] 在另一优选例中，所述的构建物导入植物中后，表达所述的寡核苷酸所对应的miRNA，所述miRNA抑制病毒基因的表达；进而提高植物抗病毒能力。

[0044] 在另一优选例中，所述的将构建物导入到植物的方法包括：

[0045] (1)提供携带权利要求2-6所述的任一构建物的农杆菌；

[0046] (2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物细胞或组织或器官。

[0047] 在另一优选例中，所述方法还包括：

[0048] (3)选择出转入所述构建物的植物细胞或组织或器官；

[0049] (4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

[0050] 在另一优选例中，所述的病毒是：芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus.，TuMV)或黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus.，CMV)。

[0051] 在另一优选例中，所述的病毒基因选自：芜菁花叶病毒的基因沉默抑制子HC-Pro；黄瓜花叶病毒基因沉默抑制子2b。

[0052] 在本发明的另一方面，还提供一种植物，其体内表达所述的寡核苷酸所对应的miRNA；或其体内包括所述的构建物。本发明还包括所述植物的后代(子代)植物。

[0053] 在本发明的另一方面，还提供一种miRNA，一种miRNA，其是SEQ ID NO：37-SEQ ID NO：40任一所示核苷酸序列的miRNA。

[0054] 在本发明的另一方面，还提供一种植物细胞或组织(所述植物细胞或组织为非植物繁殖材料)，它是选自下组：

[0055] (a)用所述的构建物转化或转染的细胞；或

[0056] (b)含有所述的miRNA的细胞。

[0057] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

[0058] 图1、载体pRS300质粒图谱。

[0059] 图2、人工miRNA克隆示意图。

[0060] 图3、不同来源的大白菜TuMV的HC-Pro序列对比。

[0061] 图4、不同来源的大白菜CMV的2b序列对比。

[0062] 图5、HC-Pro序列预测的二级结构。

[0063] 图6、CMV的2b序列预测的二级结构。

[0064] 图7、miRNA的RT-PCR原理示意图。

[0065] 图8、转基因植株表达miRNA的RT-PCR电泳图。其中，泳道amiR2b1-1、amiR2b1-2、amiR2b1HP1-1、amiR2b1HP1-2为以CMV-2b1RT-PCR引物进行PCR扩增的扩增产物的电泳结果，重复进行2次；泳道amiR2b2-1、amiR2b2-2为以CMV-2b2RT-PCR引物进行PCR扩增的扩增产物的电泳结果，重复进行2次；泳道amiRHP1-1、amiRHP1-2、amiR2b1HP1-1、amiR2b1HP1-2为以TuMV-HcPro1RT-PCR引物进行PCR扩增的扩增产物的电泳结果，重复进行2次；泳道amiRHP2-1、amiRHP2-2为以TuMV-Hc Pro2RT-PCR引物进行PCR扩增的扩增产物的电泳结果，重复进行2次。

具体实施方式

[0066] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次根据侵染植物的病毒中基因沉默抑制子的核酸序列，设计出了沉默效果优异的寡核苷酸。这些寡核苷酸导入到植物体内后，在病毒侵染植物时，能够在植物体内形成miRNA，从而特异性结合到病毒基因沉默抑制子的mRNA的相应部位，影响mRNA的转录作用，从而达到抑制病毒的效果。并且，本发明的寡核苷酸是基于比对不同病毒亚型来源的病毒基因沉默抑制子而定位到的最为保守的位置来优化和设计的，基于这些位置设计的寡核苷酸，在导入植物体内后具有较广谱的抗相关病毒(涵盖该病毒的不同亚型)的效果。

[0067] 术语

[0068] 如本文所用，所述的“植物(或作物)”包括任何种类的植物，只要该植物适合进行基因的转化操作(转基因操作)，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。例如但不限于：十字花科芸薹属的大白菜、小白菜，十字花科鼠耳芥属植物，禾本科的水稻，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。

[0069] 如本文所用，除非另外说明，所述的“病毒”是侵染植物的病毒，其基因组中包括基因沉默抑制子的核酸序列。例如，所述的病毒是：芜菁花叶病毒(TuMV)或黄瓜花叶病毒(CMV)。

[0070] 如本文所用，术语“RNA干扰(RNA interference，RNAi)”是指一些双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因的表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为RNA干预或者干涉。

[0071] 如本文所用，所述的“微小RNA(miRNA)”是指一种RNA分子，通常为20-23nt。所述的miRNA能够特异性结合到病毒基因沉默抑制子的mRNA的相应部位，影响mRNA的转录作用，从而达到抑制病毒的效果。

[0072] 如本文所用，除非另外说明，所述的“寡核苷酸”是指一种DNA序列，其对应于所述的miRNA。所述的寡核苷酸在导入植物细胞、组织或器官后，能够表达其所对应的miRNA。

[0073] 如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；
如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多7个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多6个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多5个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多4个不匹配的核苷酸，如具有0、1、2、3、4个不匹配的核苷酸。如本文所用，“互补”的序列通常是指将5’-3’方向的序列转换为其3’-5’方向的序列(如5’ATCG
3’→GCTA)，然后再取其互补序列(如GCTA→5’CGAT3’)。

[0074] 如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

[0075] 如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

[0076] 基本原理

[0077] 在本发明中，所述的RNA干扰的基本原理是：以植物作为媒介，通过转基因的方法让植物体内表达针对于病毒基因的miRNA(较佳地为高丰度地表达所述miRNA)，当病毒侵染植物并进入植物细胞后，其可接触到植物细胞内存在的miRNA，所述miRNA可在mRNA水平上干扰病毒基因(如基因沉默抑制子基因)的表达，从而抑制病毒的复制。

[0078] 人工miRNA

[0079] 本发明人通过分别对来源于病毒(包括芜菁花叶病毒(TuMV)或黄瓜花叶病毒(CMV))不同亚型的基因沉默抑制子的核酸序列进行序列比对，找出保守性的位置，基于这些位置来设计获得了本发明的寡核苷酸。所述的寡核苷酸的序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4任一所示。

[0080] 此外，本发明还提供了在严格条件下能够与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4所限定的序列杂交的寡核苷酸，且其对应的miRNA与病毒内基因沉默抑制子mRNA的至少一部分序列互补；或者，与SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4任一所示序列有95％以上同源性的寡核苷酸，且其对应的miRNA与病毒内基因沉默抑制子mRNA的至少一部分序列互补。

[0081] 根据本发明所提供的寡核苷酸序列，可设计出在被导入植物中后可被植物加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物。因此，本发明提供了一种分离的或人工构建的构建物，所述的构建物可被植物细胞转录成miRNA前体，所述的miRNA前体可在植物体内被加工成所述的miRNA。根据本发明提供的寡核苷酸来设计所述的构建物是本领域技术人员可了解的，通常可使该构建物包含一个内含子序列(与两侧序列不互补)，两端连接上互补的基因序列，导入细胞后，能产生“颈-环”结构，并且“颈”状部分能够在植物体内被植物加工成约21-23nt的miRNA，这种miRNA能特别有效的抑制目的基因的表达。RNA的碱基(A、U、C、G)与DNA的碱基(A、T、C、G)的对应形式或互补方式是本领域已知的。

[0082] 作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有至少一个式I所示的结构：

[0083] Seq正向-X-Seq反向 式I，

[0084] 式I中，

[0085] Seq正向为选自SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：4任一所示的寡核苷酸序列；

[0086] Seq反向为与Seq正向基本上互补的寡核苷酸序列；

[0087] X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补。

[0088] 式I所示的结构在转入植物细胞后，形成式II所示的二级结构：

[0089] 式II。

[0090] 式II所示的结构在植物体内进一步被剪切、加工形成miRNA，从而发挥基因沉默的作用。

[0091] 所述的构建物可以制备成在导入体内后形成多于1个茎环结构的形式，例如，可以包含2个或2个以上的茎环结构，这些茎环结构“颈”状部分(即由Seq正向和Seq反向相互作用形成)中互补的寡核苷酸序列可以分别是：选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的序列(对应于黄瓜花叶病毒(CMV))；和选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的序列(对应于芜菁花叶病毒(TuMV))。这样的构建物在导入到植物体内后，获得的转基因植物可以对抗多种病毒，如同时对抗黄瓜花叶病毒和芜菁花叶病毒。

[0092] 提高植物抗病毒能力

[0093] 本发明还提供一种提高植物抗病毒能力的方法，所述的方法包括步骤：(a)提供所述的构建物；(b)将(a)中所述的构建物导入到植物中，从而表达其中包括的所述的寡核苷酸所对应的miRNA，所述miRNA抑制病毒基因的表达，进而提高植物抗病毒能力。

[0094] 用重组DNA转化植物可用本领域技术人员熟知的常规技术进行，具体视植物种类的不同而定。例如，可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株。

[0095] 通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的寡核苷酸或与其互补的序列。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

[0096] 包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主可以是任何适合于携带所述表达载体并能够将所述表达载体传递给植物细胞的宿主。优选的，所述的宿主为农杆菌。

[0097] 作为一种优选的实施方式，所述的将构建物导入到植物的方法包括：

[0098] (1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的构建物；

[0099] (2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物细胞或组织或器官；

[0100] (3)选择出转入所述构建物的植物细胞或组织或器官；

[0101] (4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

[0102] 本发明还提供一种植物，其体内表达所述的寡核苷酸所对应的miRNA；或其体内包括所述的多核苷酸构建物。所述的植物由前述的转基因方法制备获得。

[0103] 本发明的主要优点在于：

[0104] (1)本发明巧妙地将RNA干扰技术应用到转基因抗病毒植物上，开发新型的转基因抗病毒植物，对农业的发展具有重大的意义。

[0105] (2)通过对不同病毒亚型来源的病毒基因沉默抑制子的序列比较，找到了适合于进行miRNA干扰的靶位点。从而，通过本发明的方法制备的转基因抗病毒植株能够抵抗不同病毒亚型的病毒的侵染。

[0106] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0107] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

[0108] I.试验材料与方法

[0109] 材料

[0110] 拟南芥Col及大白菜99Bre种子：获自上海农业科技种子有限公司。

[0111] 1.植物组织总RNA提取

[0112] 试剂：TaKaRa RNAiso Reagent抽提试剂盒。

[0113] 步骤：

[0114] a)将材料于液氮中充分研磨，以100mg材料1ml抽提缓冲液的量加入样品中，充分混匀，室温静置10分钟。

[0115] b)13000rpm离心5分钟，将上清转入新的离心管中，加入200μl氯仿，充分混匀，室温静置10分钟使其分层。

[0116] c)13000rpm离心5分钟，小心吸取上清于新的离心管中。

[0117] d)加入等体积异丙醇，混匀后室温静置10分钟。

[0118] e)13000rpm离心5分钟，弃上清后用1ml 75％(v/v)乙醇洗一次。

[0119] f)7800rpm离心5分钟，弃上清后低速离心，用枪头吸去残留液体，室温晾干，待RNA刚刚干燥后加入适量的无RNase的水，65℃10分钟充分溶解后存于-70℃。

[0120] 2.人工miRNA表达载体构建的引物

[0121] CMV-2b1(相对于SEQ ID NO：36中第21-41位)

[0122] 人工miRNA对应的DNA序列：5’TGGAGTTCGACGTTTGTCATT 3’(SEQ ID NO：1)。

[0123] 设计的引物：

[0124] I miR-s 5’gaTGGAGTTCGACGTTTGTCATTtctctcttttgtattcc 3’(SEQ IDNO：5)；

[0125] II miR-a 5’gaAATGACAAACGTCGAACTCCAtcaaagagaatcaatga 3’(SEQ ID NO：6)；

[0126] III miR*s 5’gaAACGACAAACGTCCAACTCCTtcacaggtcgtgatatg 3’(SEQID NO：7)；

[0127] IV miR*a 5’gaAGGAGTTGGACGTTTGTCGTTtctacatatatattcct 3’(SEQID NO：8)。

[0128] TuMV-Hc Pro1(SEQ ID NO：35中第643-663位)

[0129] 人工miRNA所对应的DNA序列：5’TCTCTCACCCCATATGAAATT 3’(SEQ ID NO：2)。

[0130] 设计的引物：

[0131] I miR-s 5’gaTCTCTCACCCCATATGAAATTtctctcttttgtattcc 3’(SEQ IDNO：9)；

[0132] II miR-a 5’gaAATTTCATATGGGGTGAGAGAtcaaagagaatcaatga 3’(SEQID NO：10)；

[0133] III miR*s 5’gaAACTTCATATGGGCTGAGAGTtcacaggtcgtgatatg 3’(SEQID NO：11)；

[0134] IV miR*a 5’gaACTCTCAGCCCATATGAAGTTtctacatatatattcct 3’(SEQ IDNO：12)。

[0135] CMV-2b2(SEQ ID NO：36中第110-130位)

[0136] 人工miRNA所对应的DNA序列：5’TCTCGCTGGGACTTTTGTAAC 3’(SEQ ID NO：3)。

[0137] I miR-s：5’gaTCTCGCTGGGACTTTTGTAACtctctcttttgtattcc 3’(SEQID NO：13)；

[0138] II miR-a：5’gaGTTACAAAAGTCCCAGCGAGAtcaaagagaatcaatga 3’(SEQ ID NO：14)；

[0139] III miR*s：5’gaGTCACAAAAGTCCGAGCGAGTtcacaggtcgtgatatg 3’(SEQ ID NO：15)；

[0140] IV miR*a：5’gaACTCGCTCGGACTTTTGTGACtctacatatatattcct 3’(SEQID NO：16)。

[0141] TuMV-Hc Pro2(SEQ ID NO：35中第602-622位)

[0142] 人工miRNA所对应的DNA序列：5’TGTCGCACATTAGTGTTGGGT 3’(SEQ ID NO：4)。

[0143] I miR-s：5’gaTGTCGCACATTAGTGTTGGGTtctctcttttgtattcc 3’(SEQID NO：17)；

[0144] II miR-a：5’gaACCCAACACTAATGTGCGACAtcaaagagaatcaatga 3’(SEQ ID NO：18)；

[0145] III miR*s：5’gaACACAACACTAATCTGCGACTtcacaggtcgtgatatg 3’(SEQID NO：19)；

[0146] IV miR*a：5’gaAGTCGCAGATTAGTGTTGTGTtctacatatatattcct 3’(SEQID NO：20)。

[0147] 对应于pRS300的引物

[0148] 引物A：5’CTG CAA GGC GAT TAA GTT GGG TAA C 3’(SEQ ID NO：21)；

[0149] 引物B：5’GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG GAA ACA G 3’(SEQ IDNO：22)。

[0150] 3.半定量RT-PCR的引物

[0151] CMV-2b1反转录引物：

[0152] 5’＞GTCGTATCCAGTGCGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACaatgaca＜3’(SEQ ID NO：23)。

[0153] CMV-2b2反转录引物：

[0154] 5’＞GTCGTATCCAGTGCGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACgttacaa＜3’(SEQ ID NO：24)。

[0155] TuMV-Hc Pro1反转录引物：

[0156] 5’＞GTCGTATCCAGTGCGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACaatttca＜3’(SEQ ID NO：25)。

[0157] TuMV-Hc Pro2反转录引物：

[0158] 5’＞GTCGTATCCAGTGCGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACacccaac＜3’(SEQ ID NO：26)。

[0159] CMV-2b1RT-PCR引物：

[0160] 正向：5’＞TGGAGTTCGACGTTTGTCAT＜3’(SEQ ID NO：27)；

[0161] 反向：5’＞TCGTATCCAGTGCGGGTCCG＜3’(SEQ ID NO：28)。

[0162] CMV-2b2RT-PCR引物：

[0163] 正向：5’＞TCTCGCTGGGACTTTTGTAA＜3’(SEQ ID NO：29)；

[0164] 反向：5’＞TCGTATCCAGTGCGGGTCCG＜3’(SEQ ID NO：30)。

[0165] TuMV-Hc Pro1RT-PCR引物：

[0166] 正向：5’＞TCTCTCACCCCATATGAAAT＜3’(SEQ ID NO：31)；

[0167] 反向：5’＞TCGTATCCAGTGCGGGTCCG＜3’(SEQ ID NO：32)。

[0168] TuMV-Hc Pro2RT-PCR引物：

[0169] 正向：5’＞TGTCGCACATTAGTGTTGGG＜3’(SEQ ID NO：33)；

[0170] 反向：5’＞TCGTATCCAGTGCGGGTCCG＜3’(SEQ ID NO：34)。

[0171] 试剂：

[0172] AMV反转录酶(TAKARA)；

[0173] RNase抑制剂(TAKARA)；

[0174] DNase I(RNase free)(TAKARA)。

[0175] 步骤：

[0176] a)分别提取植株(拟南芥或大白菜)叶片的总RNA，用DNase I(RNase free)处理30分钟之后酚氯仿抽提，沉淀，吹干，无RNase的水溶解。

[0177] b)测OD260及电泳定量后，取1μg总RNA，按说明书操作，42℃反应1小时，94℃5分钟以使反转录酶失活。

[0178] c)一倍稀释反转录产物后各取1μl做PCR。PCR反应条件：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，25-28个循环；72℃5min。为校正用于RT-PCR反应的模板量，以Ubiquitin和Actin的引物进行平行PCR反应作为内对照。

[0179] 4.CTAB法植物组织总DNA的提取

[0180] 试剂：

[0181] 2×CTAB缓冲液(100ml)：10ml 1M Tris pH 8.0；4ml 0.5M EDTA pH8.0；8.19g NaCl；2g CTAB；1g PVP K30定容至100ml。

[0182] 1×CTAB缓冲液(100ml)：5ml1M Tris pH 8.0；2ml 0.5M EDTA pH8.0；1g CTAB定容至100ml。

[0183] 高盐TE(100ml)：1ml 1M Tris pH 8.0；200μl 0.5M EDTA pH8.0；5.844gNaCl定容至100ml。

[0184] 10％(w/v)CTAB(50ml)：5g CTAB；2.045g NaCl定容至50ml。

[0185] 步骤：

[0186] a)取5g植物材料液氮中研磨粉末后转入40ml离心管中。

[0187] b)加入15ml 65℃预热的2×CTAB缓冲液(1∶1)，上下混匀后于65℃温育10min，其间不断上下颠倒几次。

[0188] c)加入1倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀后11000rpm离心5min。

[0189] d)吸取上清至新的离心管中，补入1/10体积10％CTAB，然后加入1倍体积的氯仿∶异戊醇，混匀后离心5min。

[0190] e)取上清，重复d)步骤2-3次，最后一次离心后将上清转入新的离心管，加入大于2倍体积的沉淀缓冲液(1×CTAB)，温和的混匀，于室温下放置30min。

[0191] f)离心并收集沉淀，将沉淀重悬于65℃的5ml高盐TE中，此时可加一些Rnase，37℃温育30min。

[0192] g)11000rpm离心10min后将上清转移至新的1.5ml离心管中。

[0193] h)加入2倍体积无水乙醇，混匀后于-20℃放置30min，离心，弃上清，用70％乙醇洗涤后晾干，溶于100μl TE中。

[0194] 5.冻融法农杆菌感受态细胞的制备及转化

[0195] a)从28℃培养48小时的新鲜平板中挑取GV3101单菌落，转到20ml LB液体培养基(rif 50mg/l，GM 5050mg/l)中，于28℃250rpm振荡培养过夜(不可太浓)。(下面全部操作均在无菌条件下进行)。

[0196] b)冰浴20分钟后，将菌液分装5ml的离心管(每管4ml)中，冰浴10分钟。

[0197] c)4000rpm(5-10℃)离心10分钟，弃上清液。

[0198] d)每管加入1ml充分预冷的20mM CaCl2以重悬菌体。冰浴10分钟。

[0199] e)4000rpm(5-10℃)离心10分钟，弃上清。

[0200] f)每管加入300μl 20mM CaCl2(视菌体浓度而定)，合并后分管于1.5ml的离心管中。

[0201] g)每管加入1μl质粒，冰浴5分钟，再放入液氮中4-5分钟。

[0202] h)37℃放5分钟，每管加入400μl LB培养基于28℃温育2小时使细菌复苏，并表达相应的抗生素抗性基因。

[0203] i)各取200μl体积涂板，室温放置一会儿，于28℃培养。

[0204] 6.浸花法转化拟南芥及筛选

[0205] 试剂：

[0206] 转化缓冲液(1L)：大量元素(50×)：10ml；微量元素(1000×)：0.5ml；CaCl2(100×)：5ml；铁盐(200×)：2.5ml；有机(100×)：10ml；蔗糖：50g；6-BA(1mg/ml)：10μl；Silwet L-77：
400μl(真空抽滤则用200μl)；用KOH调至pH5.8，定容1L。

[0207] 筛选培养基平板：3％(w/v)蔗糖MS0固体培养基(pH5.8)加入卡那霉素(Kan)至50mg/l。

[0208] 步骤：

[0209] a)当拟南芥抽苔后茎高约5厘米时可以进行转化，若待转化的植株结实率低则要在植株打顶4天后进行。

[0210] b)转化前，将已授粉的花和角果去除掉。并使土壤吸水过夜。

[0211] c)将已培养过夜的农杆菌1∶100稀释于大瓶培养基中，28℃培养24小时后，4℃5000rpm离心20分钟，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于原菌液的两倍体积的转化缓冲液中，使OD600在0.8左右。

[0212] d)拟南芥的地上部分完全浸入菌液中30秒，取出平放，覆盖保鲜膜和报纸，黑暗下过夜，次日移入人工气候室正常竖直培养。收种子后干燥2周。

[0213] e)种子经无菌消毒后铺于含50mg/l Kan的Ms0固体平板中，经4℃春化两天后移到组培室，卡那抗性苗移到土中继续生长。

[0214] f)取叶片提取基因组DNA经PCR检测得到阳性苗，再经两代筛选得到转基因的纯系，用于进一步分析。

[0215] 7.高压渗透法转化大白菜及筛选

[0216] 试剂：

[0217] 转化缓冲液(1L)：大量元素(50×)：10ml；微量元素(1000×)：0.5ml；CaCl2(100×)：5ml；铁盐(200×)：2.5ml；有机(100×)：10ml；蔗糖：50g；6-BA(1mg/ml)：10μl；Silwet L-77：
真空抽滤用200μl；用KOH调至pH5.8，定容1L。

[0218] 筛选培养基平板：3％蔗糖MS0固体培养基(pH5.8)加入卡那霉素(Kan)至50mg/l。

[0219] 步骤：

[0220] a)当白菜植株抽苔后就可以进行转化。

[0221] b)转化前，将已授粉的花和角果去除掉，并使土壤吸水过夜。

[0222] c)将已培养过夜的农杆菌1∶100稀释于大瓶培养基中，28℃培养24小时后，4℃5000rpm离心20分钟，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于原菌液的两倍体积的转化缓冲液中，使OD600在0.8左右。

[0223] d)白菜的地上部分完全浸入菌液中，真空渗透5分钟，间歇2分钟，再次真空渗透5分钟，然后取出平放，覆盖保鲜膜和报纸，黑暗下过夜，次日移入人工气候室正常竖直培养。收种子后干燥2周。

[0224] e)种子经无菌消毒后铺于含50mg/l Kan的Ms0固体平板中，经4℃春化30天后移到组培室，卡那抗性苗移到土中继续生长。

[0225] f)取叶片提取基因组DNA经PCR检测得到阳性苗，再经两代筛选得到转基因的纯系，用于进一步分析。

[0226] 8.植物病毒接种方法(人工磨擦接种)

[0227] 1)供试植物叶面先用自来水冲洗干净，晾干后均匀地撒上摩擦剂(金刚砂或硅藻土)。

[0228] 2)剪取小块病毒病样本的叶片放在研钵中，加入少量磷酸盐缓冲液，研碎成糊状。

[0229] 3)用食指或研棒蘸取少量病叶汁液，在供接种的植物叶面轻抹2-3次，注意摩擦要轻。不要来回擦，应单向地从叶基向叶尖方向抹，接种叶用手掌或手指托住，不要用力过大，更不能弄破叶片。

[0230] 4)接种后即可用洗瓶将叶面的病汁液和摩擦剂冲洗干净。注意：一定要将摩擦剂冲洗掉，否则将影响日后的症状观察。

[0231] 5)用铅笔在接种过的叶片尖端刺一小孔作为接种叶的记号。

[0232] 6)各组要用一盆植物作空白对照，即用缓冲液代替病叶汁液做接种。

[0233] 7)用铅笔写好标签后插入花盆中。

[0234] 8)接过种的植物要放在有光照的温室中培养，观察记载发病情况。

[0235] 9)症状记载：感病表型为接种叶片及新叶出现褪绿，枯斑及坏死；抗病表型为接种叶片及新叶没有出现褪绿，枯斑及坏死。

[0236] II.实施例

[0237] 实施例1、抗病毒miRNA的精细设计

[0238] 本发明人收集了56个来源不同的芜菁花叶病毒TuMV基因组序列，对其沉默抑制子HC-Pro的全长序列进行对比分析，同时也收集了11个来源不同的黄瓜花叶病毒CMV基因组序列，对其基因沉默抑制子2b的全长序列进行对比分析。序列对比部分结果见图3和图4。通过序列比对分析，从基因沉默抑制子HC-Pro和2b序列中分别选取出保守性强的小片段作为可能的候选人工miRNA靶序列。

[0239] 为了更有效设计人工miRNA植物表达载体，基于TuMV的HC-Pro全长序列(SEQ ID NO：35)以及CMV的2b全长序列(SEQ ID NO：36)，本发明人对这两个基因沉默抑制子的二级结构进行了分析，分别见图5和图6。在上述同源对比基础上，针对没有特殊二级结构的序列区域进行进一步筛选，选择保守性强同时不产生特殊二级结构的区域作为人工miRNA靶位，来有效设计人工miRNA表达载体。

[0240] 经过大量的比较和试验，结果获得如下SEQ ID NO：1-4所示的与人工microRNA核苷酸序列相对应的DNA序列。尽管SEQ ID NO：1-4根据SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36中相应的区段而设计，但相对于SEQ ID NO：35和SEQ IDNO：36中相应的位点存在个别碱基位点的调整，这是参考来源于多数TuMV或CMV病毒的HC-Pro或2b序列同源性对比结果而进行调整的，即针对多数来源保守序列设计人工miRNA序列。

[0241] CMV-2b1(相对于SEQ ID NO：36中第21-41位)

[0242] 人工miRNA所对应的DNA序列：5’TGGAGTTCGACGTTTGTCATT 3’(SEQ ID NO：1)。

[0243] 相应的人工microRNA核苷酸序列为：5’UGGAGUUCGACGUUUGUCAUU3’(SEQ ID NO：37)。

[0244] TuMV-Hc Pro1(SEQ ID NO：35中第643-663位)

[0245] 人工miRNA所对应的DNA序列：5’TCTCTCACCCCATATGAAATT 3’(SEQ ID NO：2)。

[0246] 相应的人工microRNA核苷酸序列为：5’UCUCUCACCCCAUAUGAAAUU3’(SEQ ID NO：38)。

[0247] CMV-2b2(SEQ ID NO：36中第110-130位)

[0248] 人工miRNA所对应的DNA序列：5’TCTCGCTGGGACTTTTGTAAC 3’(SEQ ID NO：3)。

[0249] 相应的人工microRNA核苷酸序列为：5’UCUCGCUGGGACUUUUGUAAC3’(SEQ ID NO：39)。

[0250] TuMV-Hc Pro2(SEQ ID NO：35中第602-622位)

[0251] 人工miRNA所对应的DNA序列：5’TGTCGCACATTAGTGTTGGGT 3’(SEQ ID NO：4)。

[0252] 相应的人工microRNA核苷酸序列为：5’UGUCGCACAUUAGUGUUGGGU3’(SEQ ID NO：40)。

[0253] 实施例2、人工miRNA植物表达载体构建

[0254] 参考The Plant Cell(2006)，Vol.18，1121-1133中提供的方法。

[0255] 人工miRNA表达载体构建利用载体pRS300(获自德国马普发育生物学研究所，载体自带pre-miR319a)为模板，其图谱见图1。

[0256] 克隆方法如图2所示，主要路线是以定点突变的方式用人工miRNA置换存在于载体pRS300的pre-miR319a中的miR319成熟小片段，构建抗病毒人工miRNA的植物基因表达载体：

[0257] 1)将前述“人工miRNA核苷酸序列所对应的DNA序列”中每一个序列分别输入到网上设计工具WMD-Web MicroRNA Designer(http://wmd.weigelworld.org/cgi-bin/mirnatools.pl？page＝4)中，产生下列构建人工microRNA表达载体构建引物组合，引物I：microRNA forward(miR-s)，II：microRNA reverse(miR-a)，III：microRNA*forward(miR*s)，IV：microRNA*reverse(miR*a)，结合引物A和B按照表1所示匹配引物组合依次做PCR(a)，(b)，(c)和(d)。针对PCR(a)，(b)，(c)反应条件为首先94℃，2分钟，然后为30个循环的
94℃，15秒，60℃，30秒，68℃，50秒，使用高保真的KOD plus酶(Takara，大连)。针对PCR(d)反应条件为首先94℃，2分钟，然后为30个循环的94℃，15秒，60℃，30秒，68℃，1分钟40秒，使用高保真的KOD plus酶(Takara，大连)。

[0258] 表1.人工miRNA载体构建PCR引物组合

[0259]正向引物 反向引物 模板
(a) A IV pRS300
(b) III II pRS300
(c) I B pRS300
(d) A B (a)+(b)+(c)的PCR产物

[0260] 2)PCR(d)片段包含了PCR(a)，(b)和(c)片段，然后用Kpn I和Xba I分别双酶切PCR(d)片段和载体pRS300。

[0261] 3)将双酶切的PCR片段及载体用T4DNA连接酶连接，筛选阳性克隆。结果，获得5个过表达植物载体，分别含有如图2右所示的构建物amiR-2b1、amiR-2b2、amiR-HC Pro1、amiR-HC Pro2以及amiR-2b1/HC Pro1(将构建物amiR-2b1和amiR-HC Pro1头尾串联在一个载体中表达)。

[0262] 4)利用冻融法将构建的人工miRNA载体转入GV3101农杆菌(购自Invitrogen)中。

[0263] 实施例3、拟南芥转基因植株表型

[0264] 通过同源序列对比和二级结构分析，本发明人分别选择了基因沉默抑制子HC-Pro和2b序列中的4个小片段作为人工miRNA靶位，构建了5个过表达植物载体，分别含有构建物amiR-2b1、amiR-2b2、amiR-HC Pro1、amiR-HC Pro2以及一个联合构建物amiR-2b1和amiR-HC Pro1的amiR-2b1/HC Pro1，并转化到拟南芥和大白菜中。为了鉴定人工miRNA功能，对转基因植株T2代及T3代进行筛选后，选取阳性转基因植株进行抗病性检验，即接种病毒(CMV和TuMV病毒株来自浙江大学植物病毒实验室)给植株，观察植株对于病毒的抵抗能力，结果见表2和表3。以野生型拟南芥(WT-Col)作为对照。

[0265] 表2.拟南芥转基因植株抗病毒病

[0266]

[0267] 其中，抗病性的计算方式是：(接种植株数-感病植株数)/接种植株数。

[0268] 表3.拟南芥转基因植株抗病毒病

[0269]

[0270]

[0271] 实施例4、白菜转基因植株表型

[0272] 本发明人利用高压渗透法将5个过表达植物载体，分别是amiR-2b1、amiR-2b2、amiR-HC Pro1、amiR-HC Pro2以及一个联合2b和HC Pro的amiR-2b1/HC Pro1，转化到大白菜中。鉴定人工miRNA功能，对转基因植株T2代及T3代进行筛选后，选取阳性转基因植株进行抗病毒(CMV和TuMV来自浙江大学植物病毒实验室)性检验，见表4和表5。以野生型白菜(WT-Bre)作为对照。

[0273] 表4.白菜转基因植株抗病毒病表型

[0274]

[0275]

[0276] 表5.白菜转基因植株抗病毒病表型

[0277]

[0278] 实施例5、检测人工miRNA在拟南芥转基因植株中表达

[0279] 利用RT-PCR，采用茎环反转录引物对miRNA进行特异RT-PCR，检测miRNA在植物体内表达。试验原理如图7。

[0280] 利用茎环反转录引物(如前述试验材料与方法“3.半定量RT-PCR的引物”中所列的反转录引物)，可将表达的miRNA反转录成cDNA；以该cDNA为模板，结合正反向引物(即前述试验材料与方法“3.半定量RT-PCR的引物”中所列的RT-PCR引物)进行RT-PCR，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检验，结果如图8，抗性平板阳性的转基因植株中，miRNA获得表达。

[0281] 结论

[0282] 上述结果表明，人工miRNA能够有效控制大白菜病毒病，可以用于改进白菜类作物抗病毒病能力。

[0283] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。