猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光定量PCR检测的引物及试剂盒

摘要

本发明涉及猪圆环病毒II型(PCV2)实时荧光定量PCR检测的引物及试剂盒，属于生物技术领域。本发明利用试剂盒及荧光定量PCR的原理，建立了猪圆环病毒II型(PCV2)的实时荧光定量PCR的检测方法。本试剂盒具有特异性强，灵敏度高，重复性好，操作简单，检测速度快并且可以实现高通量检测的优点。

权利要求

1.一种猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光定量PCR检测的引物对，其序列为：

5’-GTATTCAAAGGGCACAGAG -3’和5’-TACTATCAAGCGAACCACA -3’。

2.权利要求1所述的引物对在制备猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，其特征在于该试剂盒包括：（1）阳性对照标准品：为含有猪圆环病毒Ⅱ型PCV2 ORF2序列的克隆质粒

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pMD-18T-ORF2，质粒的最终浓度为1×10 拷贝数/μl；

（2）阴性对照：提取猪圆环病毒Ⅱ型PCV2阴性的猪的血液、组织的DNA，通过普通PCR检测结果为阴性的样品作为阴性对照品；

（3）PCR反应液：每个反应的反应液包括提取的模板DNA，权利要求1所述的引物对，SYBR GreenⅠ荧光染料溶液，Taq酶，ddH2O。

说明书

猪圆环病毒Ⅱ型实时荧光定量PCR检测的引物及试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及猪圆环病毒II型(PCV2)实时荧光定量PCR检测的引物及试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 猪圆环病毒II型(Porcine circovirus 2，PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)，包括猪皮炎与肾炎综合症(PDNS)、增生性坏死性肺炎(PNP)、猪呼吸道综合症(PRDC)等疾病，主要的临床特点为进行性消瘦，衰弱及呼吸困难和淋巴结肿大，有时可见腹泻，苍白，黄疸。该病的发病率及死亡率差异很大，急性暴发时死亡率可达15％以上；主要的病理变化为淋巴细胞缺失，淋巴样组织的细胞浸润、间质性肺炎、不同程度的肝炎及间质性肾炎。目前PCV2已经在全世界广泛流行，我国的PMWS抗体阳性率随猪的年龄的增长而上升。王忠田等和孙泉云等对国内规模化猪场的血清学调查表明，我国规模化猪场中已经广泛存在PCV2的感染，该病的发生会引起混合感染，给我国的养猪业造成很大的经济损失。 [0003] 目前国内对该病毒的实验室检测方法主要包括有：(1)多重PCR检测：该方法可对PCV2进行检测和定型。该方法灵敏度较高，特异性强，但是不能够检测极低病毒含量的临床样品。(2)定量竞争性PCR检测：该方法可以通过PCR的产物量来推断其原始的病毒的核酸含量，可以用于病毒含量的检测。该方法特异性高，但是存在检测灵敏度不高的问题。(3)间接荧光免疫试验：该实验方法可以对PCV进行检测和定型，该方法敏感性不高，不能有效检测低病毒含量的样品，并且在结果判断上容易受荧光抗体质量及操作人员主观意识影响较大。(4)免疫组织化学技术检测：该技术可以检测到病毒在细胞组织内存在的部位。检测的敏感性高，但是容易受所使用的抗体质量及操作技术的影响。(5)酶联免疫吸附试验：该方法是血清学检验的主要方法，通过检测机体特异性抗体来指示病毒感染的阳性率。该方法的局限性在于不能够准确检测到病毒含量即病毒载量。(6)原位核酸杂交试验：通过检测PCV2的核酸的量来指示器官 受感染病毒含量的程度。该方法具有很高的敏感性，特异性也极高。但是操作上需要转膜需要一定的时间，操作不够简便。

发明内容

[0004] 本发明的目的是建立一种猪圆环病毒II型(PCV2)SYBR Green I实时荧光定量PCR检测的引物对，SYBR Green I是一种DNA结合染料，可以实现对起始模板的定性和定量。

[0005] 本发明的另一目的是提供该引物对在制备猪圆环病毒II型(PCV2)实时荧光定量PCR检测试剂盒中的应用，该试剂盒可用于动物及动物源性食品猪圆环病毒II型(PCV2)含量的检测，检测方法简便快捷，重复性好，敏感度高，特异性强，可以实现大通量样品的检测。

[0006] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

[0007] 本发明提供一种猪圆环病毒II型(PCV2)实时荧光定量PCR检测的引物对，其序列为：引物P1(上游)：5’-GTATTCAAAGGGCACAGAG-3’和引物P2(下游)：5’-TACTATCAAGCGAACCACA-3’。

[0008] 本发明的上述引物对是按照如下方法设计的：(1)根据PCV2病毒的基因组序列，以ORF2序列为目的序列，找到其保守序列区；(2)将该保守序列区与PCV1的基因序列进行比较，选取一段与该序列差异最大的区域进行引物设计；(3)特异性引物的设计，引物设计主要满足以下几个要求：A、所设计的引物序列的GC含量要控制在45％～60％；B、两个引物的Tm值不要相差超过5℃；C、引物的5’端避免是AAA或者TTT的连续序列；以提高引物与序列的结合能力；D、所设计的引物扩增的目的片段的大小最好在300bp之内。 [0009] 本发明的引物对可用于制备猪圆环病毒II型(PCV2)实时荧光定量PCR检测试剂盒，从而对猪圆环病毒II型(PCV2)进行病毒含量的检测，该试剂盒包括：(1)阳性对照标12
准品：为含有PCV2ORF2序列的克隆质粒pMD-18T-ORF2，质粒的最终浓度为1×10 copies/μl；(2)阴性对照：提取PCV2阴性的猪的血液、组织的DNA，通过普通PCR检测结果为阴性的样品作为阴性对照品；(3)PCR反应液：每个反应的反应液包括提取的模板DNA，引物，SYBRGreen I荧光染料溶液(SYBR Green I荧光染料，dNTP，反应缓冲液)，Taq酶，ddH2O。 [0010] 其中，阳性标准对照品为实验室构建的含有PCV2ORF2序列的克隆质粒 pMD-18T-ORF2，PCV2ORF2序列来源于GeneBank，找到ORF2的保守序列区，在保守序列区设计一对特异性引物，克隆载体pMD-18-T。大量制备一批质粒，测定质粒的浓度，然后对该质
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粒进行纯度测量，纯度合格的质粒进行定量，使最终浓度为1×10 copies/μl，制备一大批定量的质粒，放-20℃保存；阴性对照采用无PCV2的样品，同时无PCV1，按照常规的DNA提取方法提取样品的核酸，可为任一PCV1或PCV2阴性的猪，用PCR方法及荧光定量的方法检测结果均为阴性的样品合格，制备一批，-20℃保存。

[0011] 用本发明的引物对制备的猪圆环病毒II型(PCV2)实时荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂盒可用于动物及动物源性食品猪圆环病毒II型(PCV2)含量的检测，检测方法简便快捷，重复性好，敏感度高，特异性强，可以实现大通量样品的检测，可对动物及动物源性食品中的猪圆环病毒II型进行实时荧光定量PCR检测。

附图说明

[0012] 图1阳性对照标准样品10倍稀释的梯度标准曲线结果：A1～A10：分别是1010～1
10copies/μl。

[0013] 图2标准曲线的熔解曲线图，熔解曲线的峰值出现在一个位置，结果成立。 [0014] 图3不同稀释度标准样品的反应曲线图。

[0015] 图4该荧光定量PCR方法的特异性检测的反应曲线图：检测样品分别为：大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，猪伪狂犬病毒，猪圆环病毒II型，猪繁殖与呼吸障碍综合症，猪瘟病毒，猪细小病毒。结果表明用该引物进行的荧光定量PCR反应，特异性强，除PCV2之外其他的几个病原体未出现Ct值并且无典型扩增曲线出现，均为阴性结果。 [0016] 图5临床样品的重复性检测结果，结果表明该方法的重复性好，同一个样品的三个重复结果差异不显著。

[0017] 图6阳性对照和阴性对照的反应曲线图，该结果是每次试验中的阳性对照和阴性对照反应曲线图。每次试验均保证阳性对照阴性对照出现这样的结果就判定结果成立。 具体实施方式

[0018] 实施例1

[0019] (1)检测样品的采集与处理：采集需要检测的临床样品，包括血清，病 变组织及动物源性的食品样品。样品采集过程中要注意无菌采样。样品进行详细编号。 [0020] A：血样采集：用一次性注射器采取前腔静脉采血的方式采集血液3ml左右，然后放于室温1h，再放于4℃过夜，直至血液凝集，采用3000rpm离心，收集血清，待提取核酸进行检测。

[0021] B：组织采样方法：采集病变组织进行检测，剖检猪只发现病变部位采用无菌的方式采集一块病变比较明显的组织，装到无菌平皿中，待检测。

[0022] C：组织的处理：采用组织研磨器对组织进行处理。用无菌的剪子、镊子取待检样品3g于组织研磨器中，加入无菌的PBS混匀，充分研磨。然后3000rpm离心5min，转入EP管中待提取核酸用。所有采集的样品处理之后应该尽快进行核酸的提取和检测以免不能够正确的反映实验结果。所有的样品的处理要进行详细的记录和编号。

[0023] (2)样品核酸(DNA)的提取：根据常规核酸提取的方式进行DNA提取或者用实验室常用的试剂盒进行DNA的提取。

[0024] (3)合成引物，制备PCR反应液：按照以下比例加入反应液。

[0025] 模板 2μl

[0026] SYBR Green I Solution 12.5μl

[0027] 引物P1(10μm/μl)(上游) 0.5μl

[0028] 引物P2(10μm/μl)(下游) 0.5μl

[0029] dd H2O 9.5μl

[0030] Total 25μl

[0031] (4)反应条件的设置

[0032] 变性时间95℃，5s

[0033] 退火温度60℃，20s，30个循环。

[0034] 按照Bio-Rad公司的荧光定量PCR仪的说明书要求进行相关的设置，进行样品孔道的设置及按照上述反应条件进行设置。运行机器，反应开始。反应结束后根据软件最后得出结果以及结果判定标准进行判定。

[0035] (5)结果的判定：每次试验的过程中都要加入阳性对照标准样品及阴性对照。阳性和阴性结果如出现图6的结果结果判定成立，即阳性结果出现典型的扩增曲线，并且标2
准曲线的绘制如图1，E＞95％并且r ＞0.95(越接近1越好)； 阴性对照结果未出现扩增曲线，无Ct值。每次样品要做3个重复，三个结果误差差异不显著，取平均值为最后结果。

[0036] 1)阳性：当Ct值＜30，并且出现和阳性对照标准品类似的典型S形扩增曲线，表明结果为阳性。根据标准曲线从软件中同时可以得出该病毒的含量(copies/μl)。 [0037] 2)阴性：无Ct值，并且不出现典型的扩增曲线，判定结果为阴性。 [0038] 3)有效判定原则：当结果出现Ct值，但是Ct值＞30，需要进行重新测定。注意在操作的过程中一定要避免气溶胶的交叉污染发生。根据再次重复的结果进行最后的判定。 [0039] 实施例2特异性研究

[0040] 动物及动物源性食品中会混合感染多种病毒及细菌，因此该方法的建立必须能够特异的检测PCV2，因此本发明同时检测了常见的猪病毒及细菌，确定该方法的特异性。 [0041] 实验结果见附图4，其中曲线1-3为PCV2的检测结果，其他病原菌的检测结果全为阴性。

[0042] 实施例3敏感性研究

[0043] 将阳性质粒样品进行10系列稀释，检测范围为1011～100copies/μl。结果表明，10 1
该方法的检测范围为10 ～10copies/μl，在此范围的病毒含量的样品可以得出可靠的结果，在此范围之外的结果不能够准确判定，即该方法的敏感性可以检测到10个拷贝的病
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毒含量的样品。而常规的定量PCR方法的检测敏感性为10 个拷贝。