针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法及其应用

摘要

本发明涉及一种针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法和应用，是利用对亚细亚镰刀菌的一对特异性引物对样本提取的DNA进行PCR扩增，再对扩增产物进行电泳凝胶成像分析，其中：所述的一对特异性引物为：上游引物SEQIDNO.1和下游引物SEQIDNO.2；对PCR扩增产物进行电泳凝胶成像分析中，根据172bp处是否出现特异条带来判断样本是否与亚细亚镰刀菌相关；所述的一对特异性引物是基于亚细亚镰刀菌相关序列扩增多态性SRAP标记，SRAP标记的序列为SEQIDNO.3，其大小为172bp。本发明可以用于对亚细亚镰刀菌的鉴别，或用于监控亚细亚镰刀菌对农作物或饲料的污染。

权利要求

1.一种针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法，是利用对亚细亚镰刀菌的一对特异性引物对样本提取的DNA进行PCR扩增，再对扩增产物进行电泳凝胶成像分析，其特征在于：一对特异性引物为：上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；对PCR扩增产物进行电泳凝胶成像分析中，根据172bp处是否出现特异条带来判断样本是否与亚细亚镰刀菌相关；

所述的一对特异性引物是基于亚细亚镰刀菌相关序列扩增多态性SRAP标记，SRAP标记的序列为SEQ ID NO.3，其大小为172bp。

2.根据权利要求1所述的针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法，其特征在于：DNA是通过改良CTAB法或改良SDS法从样本中提取的。

3.根据权利要求1所述的针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法，其特征在于：所述样本提取的DNA是指从农作物籽粒或饲料样本中提取的农作物或饲料DNA。

4.根据权利要求3所述的针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法，其特征在于：所述的农作物是指麦类农作物。

5.根据权利要求1所述的针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法，其特征在于：所述样本提取的DNA是指：病原菌基因组样本提取的DNA。

6.根据权利要求1～5之一所述的针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法，其特征在于：PCR扩增，反应体系20μL，包括DNA 10-20ng，2μL 10×buffer，1.6μL2.5mmol/L dNTP，

1.2μL 25mmol/L MgCl2，2.5μmol/L上游及下游引物各2μL，1.0U Taq酶，ddH2O补齐至

20μL；PCR扩增条件为第一循环95℃预变性5min；然后95℃变性45sec，60℃退火30sec，

72℃延伸45sec，共35个循环；最后一个循环为72℃延伸10min，扩增产物4℃保存。

7.根据权利要求6所述的针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法，其特征在于：所述的电泳是指：在2％琼脂糖凝胶中用1×TAE缓冲液电泳30min，电压为4-5V/cm的条件下凝胶成像。

8.一种如权利要求1所述检测方法的应用，其特征在于：用于对亚细亚镰刀菌的鉴别，或用于监控亚细亚镰刀菌对农作物或饲料的污染。

9.根据权利要求8所述检测方法的应用，其特征在于：所述的用于对亚细亚镰刀菌的鉴别是指：从病原菌基因组样本中提取的DNA，当电泳后的凝胶成像中172bp处存在特异条带，该病原菌为亚细亚镰刀菌。

10.根据权利要求8所述检测方法的应用，其特征在于：所述的用于亚细亚镰刀菌对农作物污染的监控是指：从农作物籽粒或饲料样本中提取的农作物或饲料DNA，当电泳后的凝胶成像中172bp处存在特异条带，该农作物籽粒或饲料样本已经被亚细亚镰刀菌污染。

说明书

针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法及其应用，属于作物病害诊断和病原菌鉴定的技术领域。

背景技术

[0002] 由镰刀菌(Fusarium spp.)引起的小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是一种广泛流行的世界性病害，主要发生于温暖湿润地区，是影响小麦高产、稳产和优质的重要因素之一。19世纪90年代以来，北美、欧洲、亚洲等地大麦、小麦赤霉病灾情严重。我国南方长江中下游冬麦区发生严重，随着全球性气候变暖、耕作制度以及耕作方式的改变，小麦赤霉病正向黄淮麦区、北方麦区以及西南和西北麦区扩展(Ma等，2008)，几乎蔓延到所有小麦种植区。2003年，长江中下游地区60-80％的麦区感染赤霉病，减产超过20％。2005年，江苏省赤霉病的发生面积为1800万亩左右，占全省总种植面积的72％。全国农业技术推广服务中心预报2011年赤霉病在全国流行面积为6500万亩。

[0003] 小麦赤霉病的发生与流行还带来巨大的食品安全性隐患。镰刀菌可以产生单端孢霉烯毒素(trichothecene)，人畜食用受赤霉病真菌毒素污染的面粉会发生呕吐、腹泻及食欲不振等急、慢性中毒症状，严重者可导致死亡(陆维忠等，2001)。据美国估计，因此类毒素污染所造成的直接经济损失仅1991～1996年间就高达三亿美元。我国、欧盟和美国、加拿大均要求面粉、面包、饼干等食品中DON毒素的限量标准为1000μg/kg(1ppm)(Buerstmayr等，2009；GB 16329-1996)。因此，明确我国小麦赤霉病致病菌的种类与产毒类型，对开展小麦赤霉病防治与抗病育种都有重要的实践意义。

[0004] 自20世纪40年代中国首次报道小麦赤霉病以来，国内外研究认为，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)是小麦赤霉病的主要致病菌之一，也是中国小麦赤霉病的优势致病菌。近年来的研究表明，F.graminearum是一个含有许多特定种系的复合种(Fg Complex)，O’Donnell通过系统发生学分析，将FgComplex划分成13个特定的正式命名的种。根据该项研究结果，目前中国小麦赤霉病的主要致病菌为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和亚细亚镰刀菌(Fusariumasiaticum)。其中亚细亚镰刀菌在长江中下游麦区、南方麦区和西南麦区均为优势致病菌，并且不断向黄淮麦区、北方麦区迁移(Zhang，2010)。研究还表明，产生3ADON毒素的亚细亚镰刀菌群日益扩展，并具有更强的致病力，危害性更大(Zhang，2010)。因此，快速、准确鉴定检测亚细亚镰刀菌，有利于针对性地加强对小麦赤霉病的防治。

[0005] 传统的镰刀菌鉴定方法主要通过形态学，如大分子生孢子、小分生孢子、原膜孢子等的形态来鉴定。但形态学鉴定方法繁琐，没有统一的规范标准，并且需要丰富的实践经验。随着遗传与分子生物学技术的迅速发展，营养体亲合群(Vegetative compatibility group VCG)，分子标记也成为鉴定镰刀菌的主要技术手段。与常规的形态鉴定法相比，分子标记能准确、快速地从混合群体中鉴定出不同病菌类型，为准确、快速分析病菌的群体分布、特点和鉴定诊断提供新方法。

[0006] Nicholson等(1998)找到了一对鉴定禾谷镰刀菌Fg Complex的标记Fg16F/R，但在扩增来自不同地区的禾谷镰刀菌株时得到6种PCR产物，不能有效地区分菌株的种类。Qu等(2008)利用该对引物，并结合AFLP标记，鉴定出Fg16F/R扩增类型5和AFLP扩增类型B的菌株为亚细亚镰刀菌。由于AFLP标记操作繁琐，且涉及到酶切和两次PCR扩增等步骤，难以在实际检测中推广应用。Yang等(2008)利用氨连接酶基因的单核苷酸多态性(SNP)设计了4个引物试图来区分Fg complex中的七个种，其中鉴定亚细亚镰刀菌需要扩增出536bp、388bp、311bp、162bp等4条不同大小的条带，并且还需要通过条带的强弱进行辅助判断，并不能真正满足快速简易检测的要求。

[0007] 目前，一种针对所有亚细亚镰刀菌具有特异性的引物，未见报道。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于：针对目前对亚细亚镰刀菌的鉴定方法过于复杂，或只能针对个别亚细亚镰刀菌，在预防亚细亚镰刀菌对农作物和饲料污染，以及在鉴别病原菌等一系列实际应用中存在明显的局限性的实际问题，提供一种由新的特异性引物组成的针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法及其应用。

[0009] 本发明的目的是这样实现的：一种针对亚细亚镰刀菌的分子检测方法，是利用对亚细亚镰刀菌的一对特异性引物对样本提取的DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳凝胶成像分析，其特征在于：所述的一对特异性引物为：上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；对PCR扩增产物进行电泳凝胶成像分析中，根据172bp处是否出现特异条带来判断样本提取的DNA是否与亚细亚镰刀菌相关；

[0010] 所述的一对特异性引物是基于亚细亚镰刀菌相关序列扩增多态性SRAP标记，SRAP标记的序列为SEQ ID NO.3，其大小为172bp。

[0011] 在本发明中：DNA是通过改良CTAB法或改良SDS法从样本中提取的。

[0012] 在本发明中：所述样本提取的DNA是指从农作物籽粒或饲料样本中提取的农作物或饲料DNA。

[0013] 在本发明中：所述的农作物是指麦类农作物。

[0014] 在本发明中：所述样本提取的DNA是指：病原菌基因组样本提取的DNA。

[0015] 在本发明中：PCR扩增，反应体系20μL，包括DNA 10-20ng，2μL 10×buffer，1.6μL 2.5mmol/L dNTP，1.2μL 25mmol/L MgCl2，2.5μmol/L上游及下游引物各2μL，1.0 U Taq酶，ddH2O补齐至20μL；PCR扩增条件为第一循环95℃预变性5min；然后95℃变性
45sec，60℃退火30sec，72℃延伸45sec，共35个循环；最后一个循环为72℃延伸10min，扩增产物4℃保存。

[0016] 在本发明中：所述的电泳是指：在2％琼脂糖凝胶中用1×TAE缓冲液中电泳30min，电压为4-5V/cm的条件下凝胶成像。

[0017] 一种上述检测方法的应用，其特征在于：用于对亚细亚镰刀菌的鉴别，或用于监控亚细亚镰刀菌对农作物或饲料的污染。

[0018] 在所述检测方法的应用中：所述的用于对亚细亚镰刀菌的鉴别是指：从病原菌基因组样本中提取的DNA，当电泳后的凝胶成像中172bp处存在特异条带，该病原菌为亚细亚镰刀菌。

[0019] 在所述检测方法的应用中：所述的用于亚细亚镰刀菌对农作物污染的监控是指：从农作物籽粒或饲料样本中提取的农作物或饲料DNA；当电泳后的凝胶成像中172bp处存在特异条带，该农作物籽粒或饲料样本已经被亚细亚镰刀菌污染。

[0020] 本发明的优点在于：1.一对特异性引物能够针对目前所知的各中亚细亚镰刀菌都能够扩增一个特异性产物，对鉴定亚细亚镰刀菌具有特殊的意义。2.采用一对引物进行PCR扩增，操作步骤少，操作方法简单；3.PCR扩增产物为一个特异性产物，不需要通过几个产物或者多条条带来鉴定菌株，利用本方法，能扩增出产物的即为亚细亚镰刀菌，扩增不出的即为其他菌株，测定结果简单明了；

[0021] 4.本方法所需的DNA量较少，10-20ng的DNA即可检测到结果，以确保从麦穗、种子、饲料中检测出亚细亚镰刀菌。附图说明：

[0022] 图1：对已知种型的菌株的PCR扩增鉴定结果，其中：M：分子量标准50bp；1-5泳道为公知的亚细亚镰刀菌株的DNA；6-10泳道为公知的禾谷镰刀菌株(非亚细亚镰刀菌株)的DNA。

[0023] 图2：对中国采集菌株的PCR扩增鉴定结果，其中：M：分子量标准100bp；1-20泳道为采集的镰刀菌株样本的DNA。

[0024] 图3：对不同小麦产区麦粒受亚细亚镰刀菌污染的鉴定结果，其中：M：分子量标准100bp；1-20泳道为小麦籽粒样本的DNA。

具体实施方式

[0025] 实施例1：

[0026] 根据已确定的42个亚细亚镰刀菌和30个非亚细亚镰刀菌，通过相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)标记，对亚细亚镰刀菌和非亚细亚镰刀菌进行扩增和比对分析。所扩增出的SRAP标记是基于基因序列中内含子与外显子的SRAP多态性标记，这种多态性标记往往代表的是基因之间的多态性(也就是差异)。我们从近400个标记中找到只在亚细亚镰刀菌中能够扩增，而在非亚细亚镰刀菌中不能够扩增的SRAP标记，SRAP标记的序列为SEQ ID NO.3，其大小为172bp。通过对这个标记进行测序，并在NCBI的GeneBank里进行比对，发现这是一个新的基因，只在亚细亚镰刀菌中存在，目前在其他镰刀菌的序列中都没有找到同源序列。我们针对这个标记，重新进行了引物设计。

[0027] 设计针对亚细亚镰刀菌的分子具有特异性的引物对(委托上海生工公司合成)：

[0028] 上游引物SEQ ID NO.1

[0029] 5′-TGAGTCCAAACCGGATAGCAAGGTA-3′，

[0030] 下游引物SEQ ID NO.2

[0031] 5′-GACTGCGTACGAATTTGCACTTCCT-3′。

[0032] 对特异性引物的验证：

[0033] 已知菌株的来源

[0034] 亚细亚镰刀菌株：w316，w346，B156，B592，B755(湖北省农业科学院植保土肥研究所喻大昭研究员提供)。

[0035] 禾谷镰刀菌(非亚细亚镰刀菌株)菌株：Fg820，M101，M83，M129，G12(荷兰国际植物研究所Lee博士提供)。

[0036] 对已知种型菌株的PCR扩增鉴定过程：

[0037] 1.菌株DNA样本的提取

[0038] 分别挑取各菌株的菌丝在PDA培养基(去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml)上，24℃培养3天，挑取新鲜菌丝用液氮冻干并研磨粉碎，用改良CTAB法(Zhang，2004)提取DNA。适量菌丝中加入200μL CTAB提取缓冲液(80mM Tris-HCl，117M NaCl，16.7mM EDTA，16.7mg/ml CTAB)，65℃温浴40min，加入200μL氯仿-异戊醇(24∶1)抽提液振荡混匀，12000rpm离心5min，上清液加入120μL异丙醇沉淀DNA，ddH2O溶解DNA。取10-20ng DNA加入到PCR反应体系中。

[0039] 2.PCR扩增反应及扩增程序

[0040] 反应体系20μL，包括DNA 10-20ng，2μL 10×buffer，1.6μL 2.5mmol/L dNTP，1.2μL 25mmol/L MgCl2，2.5μmol/L上游及下游引物各2μL，1.0U Taq酶，ddH2O补齐至
20μL；PCR扩增条件为第一循环95预变性5min；然后95℃变性45sec，60℃退火30sec，
72℃延伸45sec，共35个循环；最后一个循环为72℃延伸10min，完成扩增，扩增产物4℃保存。

[0041] 3.PCR扩增产物的鉴定

[0042] 泳道分配：

[0043] M：分子量标准50bp

[0044] w316，w346，B156，B592，B755依次列入1-5泳道；

[0045] Fg820，M101，M83，M129，G12依次列入6-10泳道。

[0046] 取8μL PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中用1×TAE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm，电泳分离30min，经溴化乙锭染色后用凝胶成像系统分析扩增产物的大小判断结果，实验结果见图1。

[0047] 表1 本发明所采用的已知种型的镰刀菌菌株

[0048]

[0049]

[0050] 由图1可见，利用本发明的特异性引物，以已知种型的菌株为模板，PCR扩增结果在1-5泳道扩增出亚细亚镰刀菌特异性条带172bp，而在6-10泳道扩增不出亚细亚镰刀菌特异性条带，与已知表1的结果吻合。

[0051] 此外，我们还对已收集分离的831个镰刀菌菌株中都进行了验证，发现这对引物确实只能在亚细亚镰刀菌中的有扩增产物。因此我们认为这对引物确实可以用于亚细亚镰刀菌的鉴定。

[0052] 实施例2：

[0053] 利用特异性的引物对采集的镰刀菌菌株进行分型。

[0054] 镰刀菌菌株采集自中国7个省、自治区，发明人在试验中将它们分别定义为：0901，0914，0919，0920，0922，0923，0924，0925，0950，0968，0978，0938，0943，0956，0966，
0822，K11，2E22，2041，0825，与各菌株对应的采集地均记载在表2中。

[0055] 菌株DNA的样本提取采用改良SDS方法，适量菌丝中加入200μL提取缓冲液(4％SDS，100mM Tris-HCl，10mM EDTA)，65℃温浴30min后迅速移入冰浴中30min，加入200μL氯仿-异戊醇(24∶1)抽提液振荡混匀，12000rpm离心5min，上清液加入120μL异丙醇沉淀DNA，ddH2O溶解DNA。取10-20ng DNA加入到PCR反应体系中。

[0056] 对菌株的DNA进行的PCR扩增反应及扩增程序、PCR产物的鉴定同实施例1。在泳道分配中，0901，0914，0919，0920，0922，0923，0924，0925，0950，0968，0978，0938，0943，0956，0966，0822，K11，2E22，2041，0825依次位于1-20泳道，M：分子量标准100bp。与采集的镰刀菌菌株相对应的鉴定结果见图2。

[0057] 表2 对采集的镰刀菌菌株进行分型结果

[0058]

[0059] 利用本发明的特异性引物，以中国采集的菌株为模板，由PCR扩增结果由图2可见：位于1-11泳道的0901，0914，0919，0920，0922，0923，0924，0925，0950，0968，0978扩增出亚细亚镰刀菌特异性条带172bp，本发明将其鉴定为亚细亚镰刀菌；位于12-20泳道的0938，0943，0956，0966，0822，K11，2E22，2041，0825扩增不出亚细亚镰刀菌特异性条带，本发明将其鉴定为非亚细亚镰刀菌。

[0060] 对上述各菌株样本的DNA还同步采用了英国John Innes Centre的PCR检测方法(见Nicholson等，1998)和湖北省农科院的多重PCR检测方法(见Yang等，2008)进行同步试验，获得的结果完全一致。

[0061] 实施例3：

[0062] 对小麦受亚细亚镰刀菌污染的监控。

[0063] 小麦麦粒分别采集自中国的江苏省泰州和武进麦区，安徽省六安麦区，河南省商城和潢川麦区，湖北省襄樊麦区的病麦粒和健康麦粒。

[0064] 麦粒的DNA提取

[0065] 小麦麦粒分别采集自中国的江苏省泰州和武进麦区，安徽省六安麦区，河南省商城和潢川麦区，湖北省襄樊麦区。取健康麦粒或病麦粒，用液氮冻干并研磨粉碎，用改良CTAB法(Zhang，2004)提取DNA(同实施例1)。取40-50ng DNA加入到PCR反应体系中。

[0066] 对小麦样本的DNA进行PCR扩增反应及扩增程序、PCR产物的鉴定同实施例1。

[0067] 在泳道分配中，1-9泳道为病小麦样本的DNA，它们依次分别源于江苏泰州、江苏武进、安徽六安A、河南商城A、河南潢川、湖北襄樊A、安徽六安B、河南商城B和湖北襄樊B，其中A与B表示为同一地区采集的不同批次的病小麦；10-20泳道为健康小麦样本的DNA，其中：10-12泳道源于江苏泰州；13-15泳道源于安徽六安；16-18泳道源于河南商城；19-20泳道源于湖北襄樊。M：分子量标准100bp。与采集的小麦样本的DNA相对应的鉴定结果见图3。

[0068] 由图3可见，在已知病小麦的电泳图中，1-6泳道扩增出亚细亚镰刀菌特异性条带172bp，7-9泳道未扩增出亚细亚镰刀菌特异性条带172bp，说明与1-6泳道的病小麦受到亚细亚镰刀菌污染；在健康小麦的泳道中，均扩增不出亚细亚镰刀菌特异性条带。

[0069] 对上述小麦样本的DNA还同步采用了英国John Innes Centre的PCR检测方法(见Nicholson等，1998)和湖北省农科院的多重PCR检测方法(见Yang等，2008)进行同步试验，结果是：已知1-9泳道的病小麦均受到镰刀菌的污染，其中，与1-6泳道对应的病小麦为亚细亚镰刀菌污染的病小麦，其余的病小麦(7-9泳道对应的病小麦)为非亚细亚镰刀菌污染的病小麦，获得的结果与本发明完全一致。

[0070] 可见，本发明可以用于鉴定亚细亚镰刀菌对小麦的污染。

[0071] 本实施例只要用饲料样本或其它农作物替代小麦样本，就可以用于鉴定饲料或其它农作物中是否存在亚细亚镰刀菌的污染。

[0072] 以上各实施例不是对本发明的限制，只要利用本发明设计的特异性引物，结合本领域的基本常识，对样本提取的DNA进行PCR扩增，再对扩增产物进行电泳凝胶成像分析，根据电泳凝胶成像中172bp处是否出现特异条带来判断样本是否与亚细亚镰刀菌相关，均属于本发明的保护范畴。