一种鉴别绿盖裘氏牛肝菌的特异引物及鉴别方法

摘要

本发明是一种鉴别绿盖裘氏牛肝菌的特异引物及鉴别方法。特异引物为CVf和CVr，其DNA序列为：CVf：CTTACCGAACGGAMGGGATAACACC；CVr：AGAAGCAAAGNACAGGAAAAGCATA。通过提取混合牛肝菌样品的总DNA，运用特异引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，达到鉴别混合牛肝菌样品中是否混有食毒不清的绿盖裘氏牛肝菌。本发明方法不需要对PCR产物测序，具有快速和准确的特点，一般从拿到牛肝菌混合样品到出鉴定结果仅需2-3小时。

权利要求

1.一种鉴别绿盖裘氏牛肝菌的特异引物，其特征在于特异引物对是CVf和CVr，其DNA序列为：CVf：CTT ACC GAA CGG AMG GGA TAA CAC CCVr：AGA AGC AAA GNA CAG GAA AAG CAT A 。

2.用权利要求1所述的特异引物鉴别绿盖裘氏牛肝菌的方法，其特征在于按以下步骤进行：（1）牛肝菌样品DNA提取；

（2）以上述DNA为PCR扩增的模板，用特异引物对CVf和CVr进行PCR扩增；

（3）取上述（2）的PCR扩增产物在质量浓度为1%的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外透射仪检测扩增片段有无及大小，鉴别牛肝菌中是否混有食毒不清的绿盖裘氏牛肝菌。

3.根据权利要求2所述的特异引物鉴别绿盖裘氏牛肝菌的方法，其特征是：所述步骤（2）中PCR扩增条件是：94℃变性5 min，然后进入连续35个循环，每个循环条件为：94℃变性1 min，55℃退火0.4 min，72℃延伸0.4 min，循环结束后于72℃延伸5 min。

说明书

一种鉴别绿盖裘氏牛肝菌的特异引物及鉴别方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种绿盖裘氏牛肝菌（Chiua virens (W. F. Chiu) Yan C. Li & Zhu L. Yang）的PCR 鉴别方法及其特异引物，属于利用分子生物学方法鉴别食毒不清牛肝菌技术领域。

背景技术

[0002] 云南多元的立体气候和复杂的生境孕育了丰富的野生菌资源，这些资源在增加山区农户家庭收入中有重要的作用，有的偏远地区，野生菌的收入约占家庭年收入1/3-1/2。在野生菌资源中牛肝菌资源是分布最广、种类最多、形态相似性较高、形态学鉴定相对较难、资源量最大的类群。牛肝菌类群真菌组织呈肉质，易生虫和腐烂，所以为了便于储藏和携带，牛肝菌常常被加工成干片销售，而牛肝菌经加工成干片后形态变化大，导致品质高的和品质低的混淆，有毒种和可食种或食毒不清的种混淆，导致野生食用菌产品混淆严重，品质层次不齐，给消费者人生安全带来潜在危害。

[0003] 绿盖裘氏牛肝菌（C. virens）在云南分布区域广、产量高、可食性不清楚，采集者和中间贸易商常常将其加工成干片混于其它可食或品质较高的牛肝菌中销售，偶有造成中毒事件发生。而目前鉴别绿盖裘氏牛肝菌的方法主要是形态学分类法。要从混杂的商品牛肝菌中准确鉴别出食毒不清的绿盖裘氏牛肝菌需要有一定大型真菌分类学基础，但消费者往往不具备这方面的知识，因此，一方面导致中毒事件的发生，另一方面，纵容了不法经销商。目前，国内对绿盖裘氏牛肝菌的研究主要集中的形态分类及系统学研究方面，应用其特异引物对该菌进行快速鉴别或检测的研究未见报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种绿盖裘氏牛肝菌鉴别的PCR方法及其特异引物，是对绿盖裘氏牛肝菌或混合牛肝菌进行快速鉴别的方法。

[0005] 每一个物种都有其独有的遗传物质DNA，它不会随环境及表型变化而变化。随着分子生物学的快速发展，在细胞外进行物种特有DNA片段或序列操作成为了现实，即运用物种的特异引物，通过PCR扩展，并应用琼脂糖凝胶电泳检测其特有片段，实现物种的快速鉴别成为现实。

[0006] 一种鉴别绿盖裘氏牛肝菌的特异引物CVf和CVr，其DNA 序列为： [0007] CVf： CTT ACC GAA CGG AMG GGA TAA CAC C

[0008] CVr： AGA AGC AAA GNA CAG GAA AAG CAT A

[0009] 用上述一对特异引物鉴别绿盖裘氏牛肝菌的方法按以下步骤进行：

[0010] 1）牛肝菌样品DNA提取；

[0011] 2）以上述DNA为模板，用特异引物CVf和CVr进行PCR扩增反应，扩增条件：94℃变性5 min，然后进入35个循环（94℃变性1 min，55℃退火0.4 min，72℃延伸0.4 min），循环结束后于72℃延伸5 min；

[0012] 3）取上述PCR扩增产物在质量浓度为1%的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外透射仪检测扩增片段有无及大小，鉴别牛肝菌中是否混有食毒不清的绿盖裘氏牛肝菌。

[0013] 本发明的方法采用一对特异引物，通过PCR反应即能有效地鉴别混合牛肝菌中是否混有绿盖裘氏牛肝菌。本发明方法不需要对PCR产物测序，具有快速和准确的特点，一般从拿到牛肝菌混合样品到出鉴定结果仅需2-3小时。

附图说明

[0014] 图1为 应用特异引物PCR扩增牛肝菌混合样品产物的DNA片段琼脂糖凝胶电泳图，表1为图1序号注释。

[0015] 表1序号 A B M
样品 表2表3DNAMark

[0016] （注：表2与表3 混合牛肝菌样品物种目录的区别在于表2中有L134和L536 Chiua virens，而表3中没有。Mark 的分子量为2000）。

具体实施方式

[0017] 实施例：

[0018] 1）混合牛肝菌样品采集及物种目录，如表2和表3所示。

[0019] 表2 混合牛肝菌样品物种目录采集号 学名
L036 Suillusbovinus
L123 Tylopilusmicrosporus
L134 Chiuavirens
L163 Heimioporusretisporus
L182 Boletusbicolor
L199 Strobilomycesconfusus
L311 Retiboletusgriseus
L316 Boletusviolaceo-fuscus
L518 Boletusluridus
L520 Tylopiluseximius
L536 Chiuavirens
L571 Boletusaestivalis
L665 Phylloporusrhodoxanthus
L725 Leccinumvesipelle
L753 Boletusappendiculatus
L754 Boletussubtomentosus
L1024 Boletussinicus
L1046 Boletusbrunneissimus

[0020] 表3 混合牛肝菌样品物种目录采集号 学名
L036 Suillusbovinus
L123 Tylopilusmicrosporus
L163 Heimioporusretisporus
L182 Boletusbicolor
L199 Strobilomycesconfusus
L311 Retiboletusgriseus
L316 Boletusviolaceo-fuscus
L518 Boletusluridus
L520 Tylopiluseximius
L571 Boletusaestivalis
L665 Phylloporusrhodoxanthus
L725 Leccinumvesipelle
L753 Boletusappendiculatus
L754 Boletussubtomentosus
L1024 Boletussinicus
L1046 Boletusbrunneissimus

[0021] 2）DNA提取：（CTAB法）选取没有虫蛀的牛肝菌样品，取适量菌肉放入2μL离心管中，向离心管中加入液氮后将菌肉磨碎成粉末状；向装有菌肉粉末的离心管中加入700μL65℃预热的CTAB提取缓冲液，轻轻振荡混匀后放于65℃水中水浴30min，水浴期间轻轻振荡2-3次；水浴30min后将离心管取出，向离心管中加入230μL 5MKAc后将离心管放入
0℃碎冰中冰浴20min；取出离心管并向离心管中加入930μL氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心10min），取上清装入2μL离心管中，向离心管中加入上清液2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇，混匀，-20℃静置约30min后离心（8000rpm，4℃离心8min），倒弃上清液，留沉淀，用500μL 80%乙醇和500μL无水乙醇各漂洗沉淀1次，晾干，向离心管中加入500μL TEbuffer 溶液和20μL RNAase（1mg/mL），37℃温浴1h后加入520μL酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和520μL氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次（10,000rpm，
4℃离心10min），取离心管中的上清液转入另一个新的2μL离心管中，向离心管中加入上清液2/3倍体积的异丙醇轻摇，沉淀过夜；取出离心管离心（10,000rpm，4℃离心10min），弃上清液，留沉淀，沉淀用500μL 80%乙醇漂洗1次，晾干，溶于30ulTEbuffer溶液中，-20℃保存备用。

[0022] 3）PCR扩增反应：以上述DNA为模板，用特异引物CVf和CVr进行PCR扩增反应，特异引物CVf和CVr的其DNA 序列为：

[0023] CVf： CTT ACC GAA CGG AMG GGA TAA CAC C

[0024] CVr： AGA AGC AAA GNA CAG GAA AAG CAT A

[0025] 扩增条件：94℃变性5 min，然后进入35个循环（每个循环为：94℃变性1 min，55℃退火0.4 min，72℃延伸0.4 min），循环结束后于72℃延伸5 min。 [0026] 4）将PCR产物在质量浓度为1%的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外透射仪检测扩增片段，如能检测到分子量为428bp的单一DNA条带，即说明混合牛肝菌样品中混有绿盖裘氏牛肝菌；若没检测到分子量为428bp的单一DNA条带，即说明混合牛肝菌样品中没混有绿盖裘氏牛肝菌。