辅助鉴定抗白粉病植物的方法及其专用引物

摘要

本发明公开了一种辅助鉴定抗白粉病植物的方法及其专用引物。本发明提供的专用引物包括序列表的序列1和序列2所示DNA组成的Xcfd50引物对，还可包括序列表的序列3和序列4所示DNA组成的XMag633引物对。本发明提供的专用引物可用于辅助鉴定白粉病抗病植物。应用本发明提供的引物组合物和方法，可以辅助鉴定白粉病抗性植物，具有操作简便、成本低廉、可以实现早期选育的优点。本发明的引物组合物和方法可以用于植物遗传育种，对于培育抗白粉病植物新品种具有重大价值。

权利要求

1.引物对甲在制备辅助鉴定白粉病抗病小麦的试剂盒中的应用；所述引物对甲是由序列表的序列1所示单链DNA和序列表的序列2所示单链DNA组成的引物对。

2.引物对甲和引物对乙在制备辅助鉴定白粉病抗病小麦的试剂盒中的应用；所述引物对甲是由序列表的序列1所示单链DNA和序列表的序列2所示单链DNA组成的引物对；

所述引物对乙是由序列表的序列3所示单链DNA和序列表的序列4所示单链DNA组成的引物对。

3.一种辅助鉴定白粉病抗病小麦的试剂盒，包括引物对甲；所述引物对甲是由序列表的序列1所示单链DNA和序列表的序列2所示单链DNA组成的引物对。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括引物对乙；所述引物对乙是由序列表的序列3所示单链DNA和序列表的序列4所示单链DNA组成的引物对。

5.引物对甲在辅助鉴定白粉病抗病小麦中的应用；所述引物对甲是由序列表的序列1所示单链DNA和序列表的序列2所示单链DNA组成的引物对。

6.引物对甲和引物对乙在辅助鉴定白粉病抗病小麦中的应用；所述引物对甲是由序列表的序列1所示单链DNA和序列表的序列2所示单链DNA组成的引物对；所述引物对乙是由序列表的序列3所示单链DNA和序列表的序列4所示单链DNA组成的引物对。

7.一种辅助鉴定白粉病抗病小麦的方法，包括步骤甲；

所述步骤甲包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，用引物对甲进行PCR扩增；如果PCR扩增产物中具有两条特异性片段，待测小麦为候选的白粉病抗病小麦；如果PCR扩增产物中不具有所述两条特异性片段，待测小麦为候选的白粉病感病小麦；所述两条特异性片段中的一条为505-515bp，另一条为485-495bp；所述引物对甲是由序列表的序列1所示单链DNA和序列表的序列2所示单链DNA组成的引物对。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法还包括步骤乙；

所述步骤乙包括如下步骤：以待测小麦的基因组DNA为模板，用引物对乙进行PCR扩增；如果PCR扩增产物中具有一条特异性片段，待测小麦为候选的白粉病抗病小麦；如果PCR扩增产物中不具有所述一条特异性片段，待测小麦为候选的白粉病感病小麦；所述一条特异性片段为565-575bp的DNA片段；所述引物对乙是由序列表的序列3所示单链DNA和序列表的序列4所示单链DNA组成的引物对。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：如果同一所述待测小麦在所述步骤甲和所述步骤乙中的鉴定结果一致，该待测小麦为进一步确定的候选的白粉病抗病小麦或进一步确定的候选的白粉病感病小麦。

说明书

辅助鉴定抗白粉病植物的方法及其专用引物

技术领域

[0001] 本发明涉及一种辅助鉴定抗白粉病植物的方法及其专用引物。

背景技术

[0002] 小麦是我国的重要粮食作物，与国家粮食安全、国民经济发展、社会稳定和人民生活水平的提高有着密切的关系。小麦白粉病是一种世界性的小麦病害。随着矮杆和半矮秆小麦品种的推广和水肥条件的改善，种植密度的加大，造成麦田郁闭，使得白粉病在我国造成的危害日益严重，发病面积和范围不断扩大，已由次要病害上升为主要病害，对我国的粮食生产及安全造成了严重威胁。

[0003] 选育并推广抗病品种已被公认为是防治小麦白粉病最为经济、有效和安全的途径，而选育抗病品种的关键在于不断发掘和有效利用新的抗源。培育含有多个抗白粉病基因的小麦品种是拓宽抗谱、提高抗性和维持抗性的有效途径之一。因此，发掘新的抗病基因及其紧密连锁的分子标记，及时开展新抗病基因的定位工作，对于分子辅助育种具有重要意义。

[0004] SSR标记又称微卫星(Microsatellite)标记，是由一组1～6个核苷酸串联在一起的、重复次数介于5～10之间的简单重复序列。它们普遍存在于高等生物中，并随机分布于整个基因组中，由于其重复次数不同而形成DNA序列的多态性。每个SSR座位的两侧一般是相对保守的单拷贝序列，因此这种串联重复序列的多态性可以十分容易地通过两端的保守序列设计特异引物进行PCR扩增检测。

[0005] SSR分子标记技术具有以下特点：(1)位点多、数量丰富，覆盖整个染色体组；(2)每个位点均有许多等位形式，多态性高；(3)多数是共显性标记，能够区分纯合及杂合基因型，从而提供单个位点上较完整的遗传信息；(4)对模板DNA的质量要求不高，DNA用量少，易于利用PCR技术分析；(5)操作简单，结果重复性好；(6)多数SSR标记染色体位置已知，可以方便地应用到基因定位、外源遗传物质鉴定等研究中。小麦SSR标记具有小麦近缘种属间、属内的可转移性，即大部分根据普通小麦的序列信息设计的SSR引物也可以在小麦的近缘种属中发挥作用，扩增出正常的DNA片段。

[0006] Li等(2009)利用SSR标记对来自野生二粒小麦材料IW2的抗白粉病基因进行分析，发现该抗白粉病基因位于SSR标记Xbarc84和Xwmc687之间，遗传距离分别为3.2cM和2.0cM，利用中国春缺体-四体系、双端体系、缺失系材料将该基因定位于染色体3BL上，将抗白粉病基因命名为Pm41。Hua等(2009)利用SSR标记对来自于野生二粒小麦的普通小麦抗白粉病品系P63中进行分析，发现该抗白粉病基因位于SSR标记Xwmc257和Xgwm148之间，遗传距离分别为16cM和6.7cM，并将该基因定位于染色体2BS上，该抗白粉病基因被命名为Pm42。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种辅助鉴定抗白粉病植物的方法及其专用引物。

[0008] 本发明提供了引物对甲(Xcfd50引物对)在制备辅助鉴定白粉病抗病植物的试剂盒中的应用；所述引物对甲是由序列表的序列1所示单链DNA和序列表的序列2所示单链DNA组成的引物对。所述植物为小麦。所述小麦具体可为小麦材料87-1、小麦材料IW132、小麦材料农大212、小麦材料农大211、以小麦材料87-1与小麦材料IW132为初始亲本获得的后代(包括杂交后代、回交后代)、所述后代与小麦材料农大212(或小麦材料农大211)的杂交后代及其自交子代。

[0009] 本发明还保护所述引物对甲和引物对乙(XMag633引物对)在制备辅助鉴定白粉病抗病植物的试剂盒中的应用；所述引物对乙是由序列表的序列3所示单链DNA和序列表的序列4所示单链DNA组成的引物对。所述植物为小麦。所述小麦具体可为小麦材料87-1、小麦材料IW132、小麦材料农大212、小麦材料农大211、以小麦材料87-1与小麦材料IW132为初始亲本获得的后代(包括杂交后代、回交后代)、所述后代与小麦材料农大212(或小麦材料农大211)的杂交后代及其自交子代。

[0010] 本发明还保护一种辅助鉴定白粉病抗病植物的试剂盒，包括所述引物对甲。所述试剂盒还可包括所述引物对乙。

[0011] 本发明还保护所述引物对甲在辅助鉴定白粉病抗病植物中的应用。

[0012] 本发明还保护所述引物对甲和所述引物对乙在辅助鉴定白粉病抗病植物中的应用。

[0013] 本发明还保护一种辅助鉴定白粉病抗病植物的方法，包括步骤甲；所述步骤甲包括如下步骤：以待测植物的基因组DNA为模板，用所述引物对甲进行PCR扩增；如果PCR扩增产物中具有两条特异性片段，待测植物为候选的白粉病抗病植物；如果PCR扩增产物中不具有所述两条特异性片段，待测植物为候选的白粉病感病植物；所述两条特异性片段中的一条为505-515bp，另一条为485-495bp。

[0014] 所述方法还可包括步骤乙；所述步骤乙包括如下步骤：以待测植物的基因组DNA为模板，用所述引物对乙进行PCR扩增；如果PCR扩增产物中具有一条特异性片段，待测植物为候选的白粉病抗病植物；如果PCR扩增产物中不具有所述一条特异性片段，待测植物为候选的白粉病感病植物；所述一条特异性片段为565-575bp的DNA片段。

[0015] 所述植物为小麦。所述小麦具体可为小麦材料87-1、小麦材料IW132、小麦材料农大212、小麦材料农大211、以小麦材料87-1与小麦材料IW132为初始亲本获得的后代(包括杂交后代、回交后代)、所述后代与小麦材料农大212(或小麦材料农大211)的杂交后代及其自交子代。

[0016] 将所述步骤甲和所述步骤乙的鉴定结果可进行相互验证。如果同一所述待测植物在所述步骤甲和所述步骤乙中的鉴定结果一致，该待测植物为进一步确定的候选的白粉病抗病植物或进一步确定的候选的白粉病感病植物。如果同一所述待测植物在所述步骤甲和所述步骤乙中的鉴定结果不一致，可结合其它现有方法确定该待测植物对白粉病的抗感性。

[0017] 野生二粒小麦(Triticum dicoccoides，2n＝4×＝28，AABB)是普通小麦的二级基因源，对小麦叶锈病、秆锈病和白粉病具有良好的抗性，在小麦抗病性遗传改良中有着巨大的应用潜力。野生二粒小麦是普通小麦的四倍体祖先种，与普通小麦杂交容易成功，杂种F1部分或完全可育，其抗病性可以通过杂交和回交等方法便捷地转移到普通小麦中。因此，充分发掘野生二粒小麦的白粉病抗源，并将其导入到普通小麦中，对于提高小麦抗病基因的多样性及基因累加，具有重要的现实意义。抗白粉病基因Ml7K65的发现也进一步证实了野生二粒小麦在普通小麦抗白粉病上的作用，也为小麦新品种的选育提供了依据。本发明筛选到了2个与抗白粉病基因Ml7K65紧密连锁的分子标记：Xcfd50和Xmag633。该两个标记可有效地用于M17K65基因的标记辅助选择。以该标记为路标，可以进行Ml7K65基因的精细定位或通过染色体步移法接近Ml7K65基因，从而为Ml7K65基因的克隆打下基础。

[0018] 应用本发明提供的引物组合物和方法，可以辅助鉴定白粉病抗性植物，具有操作简便、成本低廉、可以实现早期选育的优点。本发明的引物组合物和方法可以用于植物遗传育种，对于培育抗白粉病植物新品种具有重大价值。

附图说明

[0019] 图1为应用Xcfd50引物对PCR鉴定7K65/农大211-F2代植株的结果。

[0020] 图2为应用Xcfd50引物对PCR鉴定7K65/农大212-F2代植株的结果。

[0021] 图3为应用XMag633引物对PCR鉴定7K65/农大211-F2代植株的结果。

[0022] 图4为应用XMag633引物对PCR鉴定7K65/农大212-F2代植株的结果。

具体实施方式

[0023] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0024] 小麦材料87-1(易感染小麦白粉病的普通小麦)：河北省邯郸农科院；公众可以从中国农业大学获得；参考文献：张连松，华为，关海英，李根桥，张宏涛，解超杰，杨作民，孙其信，刘志勇 野生二粒小麦导入普通小麦的抗白粉病基因MlWE29分子标记定位，作物学报 2009，35(6)：998-1005。

[0025] 小麦材料IW132(高抗白粉病的野生二粒小麦)：以色列海法大学；公众可以从中国农业大学获得；参考文献：解超杰，孙其信，杨作民以色列野生二粒小麦苗期抗病性鉴定。麦娄作物学报2003，23(2)：39～42。

[0026] 小麦材料Morocco(易感染小麦白粉病的普通小麦)：公众可以从中国农业大学获得；参考文献：刘慧远，K Suenaga，何中虎，王竹林，梁闪闪，马均，M Bernard，PSourdille，夏先春普通小麦白粉病成株抗性的QTL分析。作物学报2006，32(2)：197-202。

[0027] 小麦材料农大212(易感染小麦白粉病的普通小麦)：中国农业大学农学与生物技术学院小麦组培育小麦新品种，公众可从北京市通州区种子公司购得。

[0028] 小麦材料农大211(易感染小麦白粉病的普通小麦)：中国农业大学农学与生物技术学院小麦组培育小麦新品种，公众可从北京市通州区种子公司购得。

[0029] 小麦材料薛早(易感染小麦白粉病的普通小麦)：北京市农科院作物所；公众可以从中国农业大学获得；参考文献：张连松，华为，关海英，李根桥，张宏涛，解超杰，杨作民，孙其信，刘志勇野生二粒小麦导入普通小麦的抗白粉病基因MlWE29分子标记定位。作物学报2009，35(6)：998-1005。

[0030] E09号生理小种：中国农科院植保所；公众可以从中国农业大学获得；参考文献：张连松，华为，关海英，李根桥，张宏涛，解超杰，杨作民，孙其信，刘志勇野生二粒小麦导入普通小麦的抗白粉病基因MlWE29分子标记定位。作物学报2009，35(6)：998-1005。

[0031] 植物对小麦白粉病致病菌的抗性和感性的划分依据于接种小麦白粉病致病菌后植物的苗期反应型，分级标准见表1。

[0032] 表1接种小麦白粉病致病菌后植物的苗期反应型分级标准(Liu et al.1999)[0033]

[0034] 实施例1、植物材料的获得

[0035] 一、抗病亲本7K65的获得

[0036] 1、将1株小麦材料87-1(作为父本)与1株小麦材料IW132(作为母本)杂交，获得10粒种子，即为F1代。

[0037] 2、将10株F1代小麦(作为母本)与1株小麦材料Morocco进行杂交，获得50粒种子，即为BC1代。

[0038] 3、将50粒BC1代种子播种，在苗期接种小麦白粉病致病菌(E09号生理小种)，选择接种致病菌15天后表现为抗病的幼苗(共2株)，待抽穗后与1株小麦材料87-1杂交(抗性幼苗作为母本、小麦材料87-1作为父本)，获得23粒种子，即为BC2代。

[0039] 4、播种23粒BC2代种子，并分别收获自交种子。

[0040] 5、将步骤4获得的23组自交种子种植于中国农业大学科学园试验地，每组种子1行，分别在苗期接种小麦白粉病致病菌(E09号生理小种)，其中行号为“7K65株行”的植株均表现为纯合抗小麦白粉病，保留该行植株(纯合抗白粉病材料)用于后续研究，即为抗病亲本7K65。抗病亲本7K65的系谱为：IW132/87-1//Morocco/3/87-1。

[0041] 二、7K65/农大212-F2代抗病分离群体的获得

[0042] 1、将1株抗病亲本7K65(作为母本)和1株小麦材料农大212(作为父本)进行杂交，获得18粒种子，即为F1代。

[0043] 2、将18株F1代小麦进行自交，获得247粒种子，即为7K65/农大212-F2代。

[0044] 三、7K65/农大211-F2代抗病分离群体的获得

[0045] 1、将1株抗病亲本7K65(作为母本)和1株小麦材料农大211(作为父本)进行杂交，收获20粒种子，即为F1代。

[0046] 2、将20株F1代小麦进行自交，获得268颗籽粒，即为7K65/农大211-F2代。

[0047] 实施例2、植物材料的白粉病抗性鉴定

[0048] 分别对7K65/农大212-F2代植株(247株)和7K65/农大211-F2代植株(268株)进行抗病性鉴定，将小麦材料薛早作为感病对照(3株)，具体方法如下(在温室中进行)：

[0049] 1、将白粉病致病菌E09号生理小种利用自然传播和人工拂掸(在幼苗生长期间每天拂掸1次)的方法接种小麦材料薛早，重复多次接种，直至小麦叶片上出现较厚菌丝层，大量产孢且病斑连成片，即可作为繁菌盆。

[0050] 2、将待测籽粒(种子)种于塑料育苗盘中，每穴种植15粒左右，籽粒萌发并生长至一叶一心期时，将繁菌盆置于育苗盘四周，白粉病致病菌孢子通过自然传播接种待测植株的幼苗。

[0051] 3、接种(放置繁菌盆)后15天，此时感病对照已充分发病，依据观察记录待测植株的抗病性，再过3天后复查一次，准确记录其抗病性。

[0052] 结果表明，两次观察记录待测植株抗病性的结果一致。247株7K65/农大212-F22
代植株中有174个单株表现为抗病，73个单株表现感病，卡方测验结果表明χ3∶1＝2.73，
2
(χ0.05，1＝3.840)(P＜0.05)，符合3∶1的单基因分离比例，表明该组合的抗白粉病性状由显性单基因控制。268株7K65/农大211-F2代植株中有196个单株表现为抗病，72个单
2 2
株表现感病，卡方测验结果表明χ3∶1＝0.497，(χ0.05，1＝3.84)(P＜0.05)，符合3∶1的单基因分离比例，也表明该组合的抗白粉病性状是由显性单基因控制的。暂时将该抗病基因定名为Ml7K65。

[0053] 实施例3、植物材料的PCR鉴定

[0054] 一、SSR标记与植物白粉病抗性的关联分析

[0055] 利用集群分离分析(Bulked Segregant Analysis，BSA)法构建抗、感池：从F2代单株中挑取10株纯合抗病单株和10株纯合感病单株的DNA分别等量混合形成DNA抗病池和DNA感病池，用于筛选与抗病基因连锁的分子标记。最终发现Xcfd50引物对和XMag633引物对与Ml7K65基因紧密连锁，从而可以采用该两对引物辅助鉴定植物的白粉病抗性。

[0056] 二、引物组合物的制备

[0057] 引物组合物由Xcfd50引物对和XMag633引物对组成。

[0058] Xcfd50引物对(应用于PCR的退火温度为60.0℃)的上下游引物的序列如下：

[0059] 上游引物(序列表的序列1)：5’-TTCTGCAACATTTTGTCCCA-3’；

[0060] 下游引物(序列表的序列2)：5’-CGTATGATCCTAACGAGGGC-3’。

[0061] XMag633引物对(应用于PCR的退火温度为52.0℃)的上下游引物的序列如下：

[0062] 上游引物(序列表的序列3)：5’-CGCCAAAACTCTGGGACG-3’；

[0063] 下游引物(序列表的序列4)：5’-GAAAGAAGGACCGTGCTACAAG-3’。

[0064] 分别合成以上四条引物。

[0065] 三、植物材料的PCR鉴定(应用Xcfd50引物对)

[0066] 分别对7K65/农大212-F2代植株(247株)和7K65/农大211-F2代植株(268株)进行PCR鉴定，采用小麦材料87-1、小麦材料农大212和小麦材料农大211作为阴性对照，小麦材料IW132和抗病亲本7K65作为阳性对照，具体方法如下：

[0067] 1、剪取实施例2中的各个幼苗的叶片，提取基因组DNA。

[0068] 2、以步骤1的基因组DNA为模板，用Xcfd50引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

[0069] 3、将步骤2的PCR扩增产物进行8％聚丙烯酰氨凝胶电泳，然后利用银染法进行染色，最后统计实验结果。部分结果见图1(R代表抗病单株、S代表感病单株)。

[0070] 174个抗病单株中，有163株电泳显示510bp和490bp两条特异性条带。73个感病单株中，只有13株电泳显示510bp和490bp两条特异性条带。结果表明，应用Xcfd50引物对对待测植株的基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增产物是否具有510bp和490bp的DNA片段可以辅助鉴定待测植株为白粉病抗病植株还是白粉病感病植株。将各个PCR扩增产物进行测序验证，与电泳结果一致。

[0071] 四、植物材料的PCR鉴定(应用XMag633引物对)

[0072] 分别对7K65/农大212-F2代植株(247株)和7K65/农大211-F2代植株(268株)进行PCR鉴定，采用小麦材料87-1、小麦材料农大212和小麦材料农大211作为阴性对照，小麦材料IW132和抗病亲本7K65作为阳性对照，具体方法如下：

[0073] 1、剪取实施例2中的各个幼苗的叶片，提取基因组DNA。

[0074] 2、以步骤1的基因组DNA为模板，用XMag633引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

[0075] 3、将步骤2的PCR扩增产物进行8％聚丙烯酰氨凝胶电泳，然后利用银染法进行染色，最后统计实验结果。部分结果见图2(R代表抗病单株、S代表感病单株)。将各个PCR扩增产物进行测序验证，与电泳结果一致。

[0076] 174个抗病单株中，有171株电泳显示570bp的特异性条带。73个感病单株中，只有9株电泳显示570bp的特异性条带。结果表明，应用XMag633引物对对待测植株的基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增产物是否具有570bp的DNA片段可以辅助鉴定待测植株为白粉病抗病植株还是白粉病感病植株。