人血清糖化白蛋白检测试剂盒

摘要

本发明提供一种人血清糖化白蛋白检测试剂盒，它包括试剂1和试剂2，其中试剂1由以下组分构成：缓冲液20-200mmol/L，蛋白酶共表达体5-50KU/L，过氧化物酶10-50KU/L，4-氨基安替比林2-20mmol/L，防腐剂0.01-1％，稳定剂0.01-1％，蛋白酶共表达体由蛋白酶基因与抗坏血酸氧化酶基因克隆到同一载体上进行共表达得到；试剂2由以下组分构成：缓冲液20-200mmol/L，果糖赖氨酸酶5-50U/mL，N，N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺1-10mmol/L，防腐剂0.01-1％，稳定剂0.01-1％。该试剂盒能排除人血清中球蛋白及抗坏血酸的干扰、稳定性好、成本低。

权利要求

1.一种人血清糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于：包括试剂1和试剂2，其中：试剂1：

试剂2：

其中，所述蛋白酶共表达体指将蛋白酶的基因与抗坏血酸氧化酶的基因克隆到同一载体上，在同一宿主菌中实现共表达得到的蛋白质；所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液或甘氨酸-盐酸缓冲液中的一种；

所述防腐剂为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮或proclin300中的一种；所述稳定剂为甘油、牛血清白蛋白、吐温-20中的一种。

2.根据权利要求1所述的人血清糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述蛋白酶的基因为曲霉属或芽孢杆菌属或麦轴梗霉属来源的基因。

3.根据权利要求2所述的人血清糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述蛋白酶的基因为林伯氏白色念球菌来源的基因。

4.根据权利要求1所述的人血清糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述抗坏血酸氧化酶的基因为植物来源的基因。

5.根据权利要求4所述的人血清糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述抗坏血酸氧化酶的基因为黄瓜来源的基因。

6.根据权利要求1所述的人血清糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述蛋白酶共表达体表达出的蛋白酶和抗坏血酸氧化酶的N端均有5-30个氨基酸片段的增加。

7.根据权利要求1所述的人血清糖化白蛋白检测试剂盒，其特征在于：还包括校准品，校准品为含白蛋白和糖化白蛋白的溶液，校准品的制备步骤为：将人血清白蛋白与葡萄糖以重量比1:1～1:100混合，37℃孵育十天，透析除去葡萄糖，用葡萄糖试剂盒测定无葡萄糖后，采用HPLC测定糖化白蛋白的含量及占总蛋白的比例，并将该溶液稀释为

200-1000μM，冷冻干燥作为校准品，采用HPLC给校准品进行定值；根据校准品与试剂1、试剂2，选用120份健康体检个体血清，测定糖化白蛋白的参考范围为100～285μmol/L，同时测定白蛋白，校正公式为糖化白蛋白/白蛋白=（糖化白蛋白浓度×0.23+1.12）/白蛋白浓度，得出糖化白蛋白/白蛋白的参考范围为11～16%。

说明书

人血清糖化白蛋白检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种人血清糖化白蛋白检测试剂盒。

背景技术

[0002] 糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，是危害人类疾病的几大疾病之一。

[0003] 人体血清中白蛋白占血清蛋白的66％，其余为免疫球蛋白；血清中葡萄糖与血清蛋白的N-末端发生非酶促的糖基化反应，生成糖化血清蛋白，而糖化白蛋白则占糖化血清蛋白的90％以上。另外，由于白蛋白在血清中含量稳定存在，而球蛋白则会由于感染等疾病因素造成波动；故准确测定糖化白蛋白对准确反应糖尿病的的血糖控制情况非常重要。

[0004] 所以如何能精确地测定出人血清中的糖化白蛋白量成为临床检测糖化白蛋白的关键。目前市场主要采用酶法用于检测人血清中的糖化白蛋白，其反应原理为首先使用蛋白酶将糖化蛋白消化成低分子量的糖化多肽，随后使用果糖氨基酸酶催化糖化多肽发生氧化反应生成多肽(或氨基酸)、葡萄糖醛酮和H2O2，释放的H2O2通过终点反应比色法来测定，其在600nm处的吸收值与糖化白蛋白的浓度成比例。具体反应过程如下：

[0005]

[0006] 而目前市场上的酶法糖化白蛋白存在下述缺陷：

[0007] (1)不能完全排除球蛋白的干扰：所采用的蛋白酶底物特异性差，对血清中所有蛋白种类都可以进行分解，故无法排除球蛋白的干扰；

[0008] (2)试剂盒稳定性差：因为偶联为Trinder反应，而该反应易受到还原性物质的干扰，由于目前大量输入抗坏血酸等还原性物质的缘故，很多病人血清中高的还原物质对反应造成很大的干扰；而去除抗坏血酸所采用的抗坏血酸氧化酶又容易受到蛋白酶的分解；蛋白酶自身也可以发生自分解反应，稳定性差；

[0009] (3)试剂盒成本高：为了将糖化白蛋白完全分解为糖化氨基酸，以便参与下步反应，故采用高浓度的蛋白酶，所采用的酶量也很高，故导致试剂盒整体成本很高；

[0010] (4)目前市场上现有的糖化白蛋白没有给出参考范围，只给出糖化白蛋白/白蛋白的参考范围，对于临床的指导有一定的缺陷。

发明内容

[0011] 本发明所要解决的技术问题是提供一种人血清糖化白蛋白检测试剂盒，该试剂盒能排除人血清中球蛋白及抗坏血酸的干扰、稳定性好、成本低。

[0012] 本发明所采用的技术方案为：

[0013] 一种人血清糖化白蛋白检测试剂盒，该试剂盒包括试剂1和试剂2，其中：

[0014] 试剂1：

[0015]

[0016] 试剂2：

[0017]

[0018] 其中，所述蛋白酶共表达体指将蛋白酶的基因与抗坏血酸氧化酶的基因克隆到同一载体上，然后将该载体转化宿主菌，在同一宿主菌中实现小分子的蛋白酶与大分子的抗坏血酸氧化酶的共表达，而得到的含有蛋白酶、抗坏血酸氧化酶这两种酶的蛋白质。

[0019] 所述蛋白酶的基因可以为任一来源的包含有蛋白酶基因序列的基因，优选为曲霉属或芽孢杆菌属或麦轴梗霉属来源的基因，进一步优选为酶活力高的林伯氏白色念球菌(Tritirachium album libmer)来源的基因，得到的蛋白酶为蛋白酶K(Proteinase K)。从NCBI的GENBANK上可以找到该酶的全基因序列。

[0020] 所述抗坏血酸氧化酶的基因可以为任一来源的包含有抗坏血酸氧化酶基因序列的基因，优选为植物来源的基因，进一步优选为黄瓜(Cucumis sp.)来源的基因。从NCBI的GENBANK上可以找到该酶的全基因序列。

[0021] 表达体系可以采用原核或真核表达体系，只要其能实现正确表达即可，优选原核表达体系，因为原核表达体系的背景较为简单，且周期较短。

[0022] 所述蛋白酶共表达体表达出的蛋白酶和抗坏血酸氧化酶的N端均有5-30个氨基酸片段的增加，即在分子克隆的时候在两者序列的5’端均加入15-90bp的核苷酸序列(对应5-30个氨基酸)，这些氨基酸的主要功能为：

[0023] 1、方便两种酶的连接，包括酶切位点等；

[0024] 2、确保两种酶正确构象的形成，从而保证两种酶的活力；

[0025] 3、增强蛋白酶针对白蛋白的特异性；

[0026] 4、避免蛋白酶对抗坏血酸氧化酶的分解作用；

[0027] 5、加入合适的标签，便于后期的分离纯化。

[0028] 所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液或甘氨酸-盐酸缓冲液中的一种。

[0029] 所述防腐剂为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮或proclin300中的一种。

[0030] 所述稳定剂为甘油、牛血清白蛋白(BSA)、吐温-20中的一种。

[0031] 小分子的蛋白酶与大分子的抗坏血酸氧化酶共表达技术路线如下：

[0032] 1、获取蛋白酶与抗坏血酸酶的基因全长片段；

[0033] 2、将蛋白酶与抗坏血酸基因片段的5’端加对应5-30个氨基酸片段的核苷酸序列；

[0034] 3、将两种连入同一载体，转入表达菌中；

[0035] 4、克隆表达、蛋白质分离纯化；

[0036] 5、活性测定，分别测定酶活、蛋白酶针对白蛋白的特异性、共表达物的稳定性：

[0037] (1)蛋白酶测活方法，任一一种测活方法即可，只要保证测活方法保持一致即可。如：37℃，1min产生1μmol酪氨酸所需要的酶量为1个酶活单位；3mL反应体系，含42mM磷酸钾缓冲液，0.5％乳酪蛋白，1.5mM醋酸钠，0.1-0.2U的蛋白酶；其中，采用酪氨酸建立标准曲线。

[0038] (2)蛋白酶共表达体的特异性：将上述(1)测活方法中的乳酪蛋白替换为球蛋白，结果发现，无论加入多高浓度的蛋白酶，均无显色，说明筛选到的蛋白酶共表达体对人血清中的白蛋白特异性高。

[0039] (3)抗坏血酸氧化酶测活方法：任一一种测活方法即可，只要保证测活方法保持一致即可。如：37℃，1min减少1mmol抗坏血酸所需要的酶量为1个酶活单位；3mL反应体系，含80mM磷酸二氢钾、10mM磷酸氢二钠、0.5mM抗坏血酸、1mM EDTA、1g/LBSA及0.1-0.2U/mL酶液；其中，采用抗坏血酸建立标准曲线。

[0040] (4)蛋白酶共表达体的稳定性：将蛋白酶共表达体放置于4℃，每隔1个月采用标准测活方法测定一次两种酶的活力，发现4℃保存半年活力仅有10％的下降，说明筛到的蛋白酶共表达体稳定性非常高，完全适用于糖化白蛋白试剂盒的制备。

[0041] 本发明人血清糖化白蛋白检测试剂盒除包括试剂1和试剂2外，还包括校准品，校准品为含白蛋白和糖化白蛋白的溶液。校准品的制备步骤为：将人血清白蛋白与葡萄糖以重量比(w/w)1∶1～1∶100混合，37℃孵育十天，透析除去葡萄糖，用葡萄糖试剂盒测定无葡萄糖后，采用HPLC测定糖化白蛋白的含量及占总蛋白的比例，并将该溶液稀释为200-1000μM，冷冻干燥作为校准品，采用HPLC给校准品进行定值。

[0042] 根据校准品与试剂1、试剂2，选用120份健康体检个体血清，测定糖化白蛋白的参考范围为100～285μmol/L，同时测定白蛋白，校正公式为糖化白蛋白/白蛋白＝(糖化白蛋白浓度×0.23+1.12)/白蛋白浓度，得出糖化白蛋白/白蛋白的参考范围为11～16％。经过公式校正后，本发明给出糖化白蛋白/白蛋白的比值。经过该校正后给出糖化白蛋白和糖化白蛋白/白蛋白的参考范围对临床监控糖尿病更为有利。

[0043] 本发明采用先进的现代分子生物学技术，将小分子的蛋白酶与大分子的抗坏血酸氧化酶共表达，这样做有以下优势：

[0044] 1、两种酶单独的活力保持不变；

[0045] 2、蛋白酶针对白蛋白的特异性增强，而对球蛋白的反应活力下降，从而从一定程度上避免了球蛋白的干扰；

[0046] 3、蛋白酶无法作用于抗坏血酸氧化酶，故后者稳定性提高，试剂盒稳定性提高；

[0047] 4、所采用的蛋白酶及抗坏血酸氧化酶量均减少，试剂盒成本降低；

[0048] 5、由于采用克隆表达，可以大量表达，产酶成本降低。

具体实施方式

[0049] 以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。

[0050] 一种人血清糖化白蛋白检测试剂盒，包括试剂1和试剂2，其中：

[0051] 试剂1：

[0052]

[0053] 试剂2：

[0054]

[0055] 蛋白酶K共表达体制备：

[0056] ①蛋白酶共表达体全基因合成：从GENBANK中找到林伯氏白色念球菌(Tritirachium album limber)蛋白酶K基因序列，在其基因序列5’端加入30bp核苷酸，包括加入酶切位点NdeI，3’端去除其终止密码，黄瓜来源(Cucumis sp.)抗坏血酸氧化酶基因序列5’端加入120bp核苷酸，3’端同样去除其终止密码，加入酶切位点XhoI，两端序列合在一起进行全基因合成；

[0057] ②重组基因连入克隆载体pMD-18-T简易载体中；

[0058] ③连入表达载体pET22b中；

[0059] ④转入表达菌ROSEETA中；

[0060] ⑤37℃长菌，OD＝0.6-0.8时加入IPTG＝0.1mM诱导产生酶共表达体；

[0061] ⑥采用镍亲和柱进行纯化。

[0062] 本实施例糖化白蛋白标准品制备及定值：人血清白蛋白(50g/L)与葡萄糖饱和溶液混合，加入1g/L叠氮钠做防腐剂，37℃孵育十天，采用生理盐水透析除去葡萄糖，用葡萄