掺杂化学发光及吸收活性分子的二氧化硅纳米颗粒

摘要

掺杂了吸收材料，如吸收染料的纳米颗粒在适当条件下呈现化学发光。该纳米颗粒可以是介孔二氧化硅纳米颗粒或核-壳二氧化硅纳米颗粒。该纳米颗粒可作为传感器用于检测分析物。

权利要求

1.一种包括吸收材料的具有介孔结构的，不具有外壳的二氧化硅纳米颗粒，其中所述吸收材料与所述二氧化硅网络结构共价连接，其中所述吸收材料吸收300nm至1200nm的电磁能，且其中当暴露于适当化学物种时，所述吸收材料呈现化学发光发射，其中所述纳米颗粒的最大尺寸为1至500nm。

2.根据权利要求1所述的二氧化硅纳米颗粒，其中所述纳米颗粒进一步包括化学物种，所述化学物种可反应生成高能量化学物种，当所述高能量化学物种暴露于所述吸收材料时导致化学发光发射。

3.根据权利要求2所述的二氧化硅纳米颗粒，其中所述化学物种包括草酸酯部分，所述化学物种可反应生成高能量化学物种，当所述高能量化学物种暴露于所述吸收材料时导致化学发光发射。

4.根据权利要求1所述的二氧化硅纳米颗粒，其中所述二氧化硅纳米颗粒具有1至

20nm的孔。

5.根据权利要求1所述的二氧化硅纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的最大尺寸是1至

100nm。

6.根据权利要求1所述的二氧化硅纳米颗粒，其中所述吸收材料是有机染料。

7.根据权利要求1所述的二氧化硅纳米颗粒，其中吸收材料是ADS832WS、琥珀酰亚胺酯(DNP-X SE)或QXL-490。

8.一种检测化学物种的方法，包括步骤：

a)提供权利要求1所述介孔纳米颗粒；

b)在导致所述介孔纳米颗粒化学发光发射的条件下，将所述介孔纳米颗粒暴露于含有分析物化学物种的环境中；以及c)检测化学发光发射，所述化学发光发射证明所述分析物化学物种的存在。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述介孔纳米颗粒进一步包括表面活性剂功能化的孔，以使化学物种的扩散相比未功能化的介孔纳米颗粒有所改变。

10.根据权利要求8所述的方法，其中步骤a)中所述的提供包括提供权利要求1所述的多种介孔纳米颗粒，其中所述的多种包括至少两种不同的介孔纳米颗粒。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述至少两种不同的介孔纳米颗粒具有不同的吸收材料和/或尺寸和/或孔尺寸和/或孔的功能化。

12.根据权利要求8所述的方法，其中所述分析物是过氧化氢。

13.根据权利要求8所述的方法，其中所述环境进一步包括化学物种，所述化学物种可与所述分析物反应形成高能量化学物种。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述可与所述分析物反应的化学物种是草酸酯。

说明书

掺杂化学发光及吸收活性分子的二氧化硅纳米颗粒

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2009年4月15日提交的申请号为61/169,605的美国临时专利申请的优先权，其公开的内容在此参考并入。

技术领域

[0003] 本发明主要涉及含有吸收染料的二氧化硅纳米颗粒。更具体的说，本发明涉及含有吸收和/或化学发光材料的介孔二氧化硅纳米颗粒和核-壳纳米颗粒及其用途。

背景技术

[0004] M.M.Rauhut于1969年发明了协同的过氧化物分解反应产生化学发光。这类光发射是化学反应的结果，在反应中荧光团受到高能量产物(本例中：1，2-二氧杂环丁烷二酮)的激发。这种高度不稳定的中间体是在过氧化氢和草酸二苯酯之间的SN2反应中产生的。当1，2-二氧杂环丁烷二酮的能量转移给染料分子时，该中间体分解为二氧化碳。荧光团通过光的形式释放吸收的能量，之后其可通过适当的仪器被检测到。反应机理如图1所示。

[0005] 理论上，反应物的每一个分子应该发出1光子的光，但是Rauhut设计了一种苯基草酸酯，当其与过氧化氢及染料混合时，产生的量子产额为大约5-50％。值得注意的是该量子效率对于化学发光反应而言是高的，然而与产生生物发光(事实上，当此种自然反应发生在活体上时，其被称为生物发光)的活体(比如萤火虫)相比，所设计反应效率是非常低的。萤火虫反应具有88％的量子产额，该反应具有已知最高的化学发光效率。萤火虫生物发光反应涉及三磷酸腺苷(ATP)，荧光素以及荧光素酶。所产生的中间体与氧结合生成高度化学发光的产物。

[0006] 虽然萤火虫使用的系统是非常量子高效的，但是在某些应用中并不理想。

[0007] 发明简介

[0008] 本发明提供了掺杂吸收材料(例如：吸收染料)的纳米颗粒，其在适宜条件下呈现化学发光。该纳米颗粒可以是介孔二氧化硅纳米颗粒或核-壳结构二氧化硅纳米颗粒。该纳米颗粒可作为传感器用于检测分析物。

[0009] 在一实施例中，本发明提供了一种介孔二氧化硅纳米颗粒，其包括与二氧化硅网络结构共价连接的吸收材料。该吸收材料可吸收300nm至1200nm的电磁能，并且当该吸收材料暴露于适宜的化学物种时呈现出化学发光。该纳米颗粒的最大尺寸可为1至500nm。

[0010] 在一实施例中，二氧化硅纳米颗粒还包括化学物种，例如草酸酯类，其可在适当条件下反应生成高能量化学物种，所述高能量化学物种暴露于吸收材料导致化学发光发射。

[0011] 在一实施例中，二氧化硅纳米颗粒具有1至20nm的孔。在一实施例中，纳米颗粒的最大尺寸为1至100nm。在一实施例中，吸收材料是吸收染料，例如，ADS832WS和琥珀酰亚胺酯(DNP-X SE)。

[0012] 在另一实施例中，本发明提供了一种具有核-壳结构的二氧化硅纳米颗粒。该二氧化硅核包括吸收材料，其中所述吸收材料与核的二氧化硅网络结构共价连接，其中该吸收材料吸收300nm至1200nm的电磁能，并且其中当该吸收材料暴露于适宜的化学物种时呈现出化学发光发射。该纳米颗粒的最大尺寸为1至500nm。

[0013] 在一实施例中，二氧化硅纳米颗粒进一步包括化学物种，例如草酸酯，其可反应生成高能量化学物种，所述高能量化学物种在暴露于吸收材料时导致化学光发射。

[0014] 在一实施例中，纳米颗粒的最大尺寸为1至100nm。在一实施例中，吸收材料是ADS832WS或琥珀酰亚胺酯(DNP-X SE)。

[0015] 另一方面，本发明提供一种化学物种的检测方法。在一实施例中，该方法包括步骤：(a)提供纳米颗粒，例如，如本申请所述的一种介孔纳米颗粒或多种介孔纳米颗粒或一种核-壳纳米颗粒或多种核-壳纳米颗粒；(b)在导致纳米颗粒化学发光发射的条件下，将纳米颗粒暴露于含有分析物化学物种的环境中；以及(c)检测证明分析物化学物种存在的化学发光发射。

[0016] 在一实施例中，纳米颗粒用于检测分析物，例如，过氧化氢。

[0017] 在一实施例中，环境进一步包括可以与分析物反应生成高能量化学物种(例如，1，2-乙二酮)的化学物种(例如，草酸酯)。

[0018] 通过使用随时间变化而区别响应分析物的纳米颗粒检测不同时间的分析物。在一实施例中，介孔纳米颗粒具有表面活性剂功能化的孔，相比未进行功能化的介孔纳米颗粒，其改变了化学物种通过纳米颗粒的扩散。在一实施例中，至少使用两种不同的介孔纳米颗粒，其具有不同的吸收材料和/或尺寸和/或孔尺寸和/或使用的孔的功能化。

[0019] 附图的简要说明

[0020] 图1为荧光团的激发机理。

[0021] 图2为ADS832WS的化学结构。

[0022] 图3为介孔纳米颗粒合成实施例的示意图。

[0023] 图4为介孔纳米颗粒实例的透射电子图。(a)0.06mol％；(b)0.08mol％；(c)0.10mol％；(d)0.12mol％；(e)0.14mol％；(f)0.16mol％；(g)0.18mol％；(h)0.20mol％；
(i)0.30mol％；和(j)0.40mol％。

[0024] 图5为图4所示纳米颗粒及游离染料溶液的吸光度匹配图。

[0025] 图6为图4所示纳米颗粒及游离染料溶液的化学发光随时间的衰减。染料的给定数量为10^-8摩尔每mg颗粒。

[0026] 图7为纳米颗粒在25秒时的最大峰强度。

[0027] 图8为0.10mol％纳米颗粒随时间的化学发光谱图。

[0028] 图9为图4所示纳米颗粒和游离染料溶液的吸光度匹配图。

[0029] 图10为纳米颗粒和游离染料溶液(右边最后两个点)在25秒时的最大强度峰。

[0030] 图11为0.10mol％纳米颗粒随时间的化学发光谱图。

[0031] 图12为0.08mol％纳米颗粒及游离染料溶液的吸光度匹配图。

[0032] 图13为使用不同量的过氧化氢激发的0.08mol％纳米颗粒在25秒时的化学发光强度峰。

[0033] 图14为吸光度匹配的游离染料溶液随时间的化学发光谱图。

[0034] 图15为N，N’-二(3-(三乙氧基硅烷)丙基)草酰胺的形成机理。

[0035] 图16为采用Brookhaven动态光散射系统测得的QXL490核-壳纳米颗粒(小颗粒合成物)在乙醇中的尺寸分析数据。

[0036] 图17为采用Brookhaven动态光散射系统测得的DNP-X核-壳纳米颗粒(小颗粒合成物)在乙醇中的尺寸分析数据。

[0037] 图18为采用Brookhaven动态光散射系统测得的DNP-X核-壳纳米颗粒(大颗粒合成)在乙醇中的尺寸分析数据。

[0038] 图19为采用Brookhaven动态光散射系统测得的QXL490核-壳纳米颗粒(大颗粒合成)在乙醇中的尺寸分析数据。

[0039] 图20为乙醇中～20nm核-壳纳米颗粒及游离染料的DNP-X吸收数据。染料结构显示于右上角。

[0040] 图21为乙醇中～20nm核-壳纳米颗粒及游离染料的QXL490的吸收数据。

[0041] 图22为采用SEM Keck装置测得的～20nm核-壳纳米颗粒的DNP-X SEM图像。(a)第一次反应；(c)第二次反应。

[0042] 图23为采用SEM Keck装置测得的～20nm核-壳纳米颗粒的QXL490SEM图像。(a)第一次反应；(c)第二次反应。

[0043] 图24为采用SEM Keck装置测得的核-壳纳米颗粒100nm反应的DNP-X SEM图像。

[0044] 图25为采用SEM Keck装置测得的核-壳纳米颗粒100nm反应的QXL490SEM图像。

[0045] 发明详述

[0046] 本发明提供了一种包括了掺杂吸收分子(例如，吸收染料)的二氧化硅纳米颗粒(例如，介孔二氧化硅和核-壳纳米颗粒)的组合物以及该纳米颗粒的制备方法。这些颗粒可被用于，例如，标记、以及传感器应用。

[0047] 本发明的一些独特的特征包括但不限于：i.)本发明覆盖的纳米颗粒可掺杂有机的光学吸收物；以及ii.)在一实施例中，含有吸收染料的介孔二氧化硅纳米颗粒已被证实是化学发光的，并且相对于游离染料显示出更好的化学发光性。

[0048] 本发明的二氧化硅纳米颗粒可以是，例如，介孔二氧化硅纳米颗粒和核-壳纳米颗粒。该纳米颗粒内掺杂了吸收分子，例如吸收染料。在适宜的条件下，该纳米颗粒释放出化学发光产生的电磁辐射。

[0049] 介孔二氧化硅纳米颗粒的尺寸可为5nm至500nm，包括所有整数及整数之间的范围。该尺寸是通过测量颗粒的最长轴尺寸获得。在各种实施例中，颗粒的尺寸为从10nm至200nm以及从10nm至100nm。介孔二氧化硅纳米颗粒具有介孔结构。孔的直径可为1至
20nm，包括所有整数及整数之间的范围。在一实施例中，孔的直径为1至10nm。在一实施例中，90％的孔的直径为1至20nm。在另一实施例中，95％的孔的直径为1至20nm。

[0050] 介孔纳米颗粒可采用本领域公知的方法合成。在一实施例中，纳米颗粒通过溶胶-凝胶法合成，其中一个或多个二氧化硅前体和一个或多个与吸收物分子结合(例如，共价连接)的二氧化硅前体在胶束形模板存在的情况下发生水解。该模板通过使用表面活性剂，例如，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)生成。预计可使用任何可形成胶束的表面活性剂。

[0051] 核-壳纳米颗粒包括核和壳。核包括二氧化硅和吸收物分子。该吸收物分子通过该分子和二氧化硅网络结构之间的一共价键或多个共价键被掺杂至二氧化硅网络结构。外壳含有二氧化硅。

[0052] 在一实施例中，核通过使用已知的溶胶-凝胶化学，例如，通过一个或多个二氧化硅前体的水解独立合成。二氧化硅前体以二氧化硅前体和与吸收物分子结合的(例如，通过共价键连接的)二氧化硅前体(在本发明中称为“结合的二氧化硅前体”)的混合物呈现。水解可在碱的(碱性的)条件下进行以形成二氧化硅的核和/或二氧化硅的壳。例如，水解可通过在含有二氧化硅前体和结合的二氧化硅前体的混合物中加入氢氧化铵来进行。

[0053] 二氧化硅前体是水解条件下可生成二氧化硅的化合物。二氧化硅前体的实例包括但不限于有机硅烷，例如，四乙氧基硅烷(TEOS)、四甲氧基硅烷(TMOS)及其类似物。

[0054] 用于形成结合的二氧化硅前体的二氧化硅前体具有一个或多个功能基团，所述基团可以与一个或多个吸收分子反应生成一个或多个共价键。此种二氧化硅前体的实例包括但不限于异酸氰酸基丙基三乙氧基硅烷(ICPTS)、氨基丙基三甲氧基硅烷(APTS)、巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)，及其类似物。

[0055] 在一实施例中，用于形成核的有机硅烷(可结合的二氧化硅前体)的通式为R(4-n)SiXn，其中X是可水解基团，例如乙氧基、甲氧基、或2-甲氧基-乙氧基；R可以是1至12个碳原子的单价有机基团，其可选择的含有但不限于功能性有机基团，例如巯基、环氧基、丙烯酰基、异丁烯酰基、或氨基；且n是0至4的整数。可结合的二氧化硅前体与吸收物分子结合，之后共缩合，从而与二氧化硅前体(例如，TEOS和TMOS)形成核。用于形成二氧化硅壳的硅烷的n等于4。已知功能性的单-，双-，和三-烷氧基硅烷也可用于结合及修饰共反应性官能团或功能性羟基表面，包括玻璃面，参考Kirk-Othmer，Encyclopedia of Chemical Technology，Vol.20，3rd Ed.，J.Wiley，N.Y。虽然无意受任何特定理论的束缚，我们考虑结合是烷氧基硅烷基团水解成硅烷醇基团并与表面羟基缩合的结果，参考E.Pluedemann，Silane Coupling Agents，Plenum Press，N.Y.1982。有机硅烷可产生凝胶，所以可能需要采用乙醇或其它已知的稳定剂。U.S.专利申请号10/306,614和10/536,569记载了使用改良的Stoeber法合成核-壳纳米颗粒的方法，其公开的方法在此参考并入。

[0056] 吸收材料不会自发发光。在适当条件下吸收材料会产生化学发光。吸收材料可吸收300nm至900nm的电磁辐射。可使用吸收材料例如，吸收染料或颜料。在一实施例中，NIR-吸收染料被掺杂入纳米颗粒。

[0057] 吸收峰在400nm至700nm光谱范围外的染料在常规情况下是不可见的，并且由于它们的吸收特性，其不像许多荧光染料那样会在紫外灯下变为可见。吸收染料显示出特异性很强的光谱峰且难以被复制，除非该特异性染料是已知的，这使其适用于，例如安全装置。因此，在纳米颗粒中使用紫外、可见、以及近红外(NIR)光谱区的吸收染料将会增加纳米颗粒的标记范围并扩展其应用。

[0058] 在一实施例中，NIR染料ADS832WS被掺杂入纳米颗粒。

[0059] 在一些实施例中，DNP-X和QXL490吸收染料已被用于制造直径大约为20nm的核-壳纳米颗粒。DNP-X和QXL490纳米颗粒的吸收峰与其各自的游离染料的吸收峰相匹配。

[0060] 当暴露于适当的化学刺激物时，吸收染料释放出源自化学发光过程的电磁辐射。在该过程中，目标分析物与第二化学物种反应，形成高能量化学物种，其可以激发掺杂入纳米颗粒的吸收材料。被激发的吸收材料随后释放出电磁辐射。

[0061] 在一实施例中，化学反应物(第二化学物种)，例如，草酸酯，能被保留在纳米颗粒结构中。这可导致更高的反应性。例如，双-(N-琥珀酰亚胺)草酸酯可在偶联试剂的帮助下与羟基硅烷反应。上述步骤另一可选方法是合成双-(N-马来酰亚胺基)草酸酯。巯基硅烷预期可与马来酰亚胺的双键反应且生成的产物可在颗粒合成过程中被整合。

[0062] 在一实施例中，本发明提供检测化学物种或部分(moiety)存在的方法。例如，掺杂了吸收材料的介孔纳米颗粒可作为传感器用于检测分析物(或目标)化学物种或部分的存在，所述吸收材料因为反应活性物种的形成(由于暴露于分析物化学物种或部分而形成反应活性物种)而展现出化学发光。通过探测纳米颗粒和化学物种或部分作用导致的化学发光可证明化学物种或部分的存在。

[0063] 在一实施例中，介孔和/或核-壳纳米颗粒附近存在过氧化氢和草酸酯部分会导致化学反应，生成1，2-二氧杂环丁烷二酮类，其通过能量转换激发掺杂在纳米颗粒中的吸收材料。受到激发的吸收材料随后释放出电磁辐射。例如，如果含有纳米颗粒和草酸酯的系统被暴露于含有过氧化氢的环境中，该系统可用来检测过氧化氢的存在。又如另外一个例子，如果系统中含有纳米颗粒、草酸酯和过氧化物，其中草酸酯和过氧化物不能发生反应(例如，它们被物理分离)，而在外力(例如，机械力)作用下，草酸酯和过氧化物能够反应生成1，2-二氧杂环丁烷二酮类，则该系统可被用于检测该外力的存在。

[0064] 掺杂吸收材料的介孔纳米颗粒是有用的，这是由于孔的性质(例如，孔的尺寸)控制吸收材料对分析物化学物种或部分(或可选地，第二化学物种或部分)的暴露。介孔纳米颗粒的孔可被修饰(例如，用有机分子比如表面活性剂)以延缓分析物化学物种或部分进入(扩散)至吸收部分。

[0065] 在一实施例中，可使用不同多孔性或孔修饰(继而，分析物化学物种通过多孔硅的扩散速率不同)的介孔纳米颗粒的混合物。因此，化学发光发射图谱可制成时间的函数。

[0066] 下列实施例用于阐述本发明。它们无意以任何方式限制本发明。

[0067] 实施例1

[0068] 含有吸收染料的介孔二氧化硅纳米颗粒的制备及表征

[0069] 材料和方法：

[0070] 步骤1-染料制备：

[0071] NIR-染料，ADS832WS被溶于DMSO中以形成4.5毫摩尔的溶液(例如，30.23mg染料溶于7.169mL DMSO中)。

[0072] 步骤2-结合

[0073] DMSO-染料溶液以1∶50的比例与3-异氰酸基丙基三乙氧基硅烷(ICPTS)结合。(例如，400μL+22.5μL ICPTS)。

[0074] 如前所述，ADS832WS被用作NIR-染料(λAbs＝832nm)。该染料的化学结构如图2所示。

[0075] 优选具有多孔结构的纳米颗粒。已知符合该要求的纳米颗粒为介孔二氧化硅纳米颗粒。通过胶束模板和正硅酸四乙酯(TEOS)反应，合成充满规则排列的孔的球状或杆状介孔二氧化硅纳米颗粒。通过在合成过程中加入染料，使染料整合进入二氧化硅壁中。孔的巨大表面区域应当允许1，2-二氧杂环丁烷二酮中间体扩散至染料。

[0076] 合成掺杂染料的介孔二氧化硅纳米颗粒。采用如下合成路线进行10mL的反应：将10mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶于0.5mL DI-H2O中。将500μL CTAB溶液加至
10mL DI-H2O中。为了形成胶束，加入88μL乙酸乙酯并且搅拌溶液数分钟。为形成颗粒，将270μL氢氧化铵，xμL结合染料溶液(其中x是染料的理想的量，11、33、44、55、66、77、
88、99、110、165和200μL)和50μL正硅酸四乙酯合并，搅拌5分钟。通过加入3690μL DI-水稀释反应并进一步搅拌10分钟。随后用2摩尔的盐酸中和反应混合物。合成的示意图如图3所示。

[0077] 为去除CTAB，采用乙醇和去离子水交替清洗形成的颗粒。(在每次清洗步骤之间，颗粒被旋沉(10min，8000-9000rpm)并在合适的溶剂中再悬浮)。

[0078] 在5次清洗步骤后，将500μL醋酸加入含有颗粒的水中。搅拌溶液大约1小时，之后再进行5次清洗步骤。

[0079] 通过加入不同量的结合的染料合成11种不同类型的颗粒(0.02mol％、0.06mol ％、0.08mol ％、0.10mol ％、0.12mol ％、0.14mol ％、0.16mol ％、0.18mol ％、
0.20mol％、0.30mol％、0.40mol％)。所有摩尔规格均与TEOS的摩尔数相关。染料含量不同而二氧化硅浓度恒定不变。

[0080] 为进行颗粒测试，1mL每种类型的颗粒在16000rpm的转速下旋沉10min，并通过超声处理在400μL正己醇中再悬浮。含草酸二苯酯的乙酸乙酯溶液(例如，34mg草酸二苯酯溶于15mL乙酸乙酯)是在化学发光测试当日新鲜配制的。将600μL该混合物加入含有颗粒的正己醇中并进行较好地混合。

[0081] 为获得可比较的结果，所有颗粒混合物在进行化学发光测试前都使用分光光度计将吸光度匹配至0.06mol％颗粒的吸收峰。为了维持该条件，颗粒溶液采用颗粒再悬浮使用的相同的溶剂和化学试剂(正己醇、乙酸乙酯、草酸二苯酯)进行稀释。在吸收匹配后，用过氧化氢激发颗粒以生成中间体1，2-二氧杂环丁烷二酮。因此，在稀释的纳米颗粒中加入12μL KOH/H2O2溶液(例如，含4.0mg KOH的1mL H2O2(30％))并进行较好地混合。在25s、70s之后以及之后的每40s(例如，110s、150s等)记录数据。实验通常持续3分钟。

[0082] 在染料和草酸酯浓度相同的情况下，纳米颗粒证明其化学发光强度相比游离染料-分子有所提高。进行的所有实验的条件都与游离染料的化学发光测试条件相同。(例如，2.3mg ADS832WS和43mg草酸二苯酯(双(2-戊氧羰基-3，5，6-三氯苯基)草酸酯)溶于25mL正己醇(1)：乙酸乙酯(1.5))。每次1mL新溶液都与0.06mol％颗粒的吸收进行吸收匹配。

[0083] 为确定颗粒大小及结构，每种颗粒类型都通过TEM成像进行表征。因此10μL每种颗粒溶液都采用10μL乙醇进行稀释并进行较好地混合。使用大约8μL这种混合物涂覆在用于透射电子显微镜的铜碳网上。在空气中干燥后，进行TEM成像。

[0084] 结果和讨论：

[0085] 为合成掺杂染料的介孔二氧化硅颗粒，不同量的染料被加入。为证实添加更高量的染料可使更多的染料被掺杂而进行了质量分析和吸收测定。这些实验数据对于计算每mg颗粒中的染料的摩尔数是必需的。

[0086] 通过使用Lambert Beer定律计算消光系数：A＝c*d*ε。其中A是光密度，c是浓度，d是光程长度，ε是消光系数。通过测量游离染料溶液的吸收获得消光系数ε。游离染料溶液的浓度c是已知的，而且比色皿的光程长度是已知的。用于所有计算的ε值是29195,678L/(mol*cm)。通过将实验中给定的每种颗粒类型的光密度ODNS除以计算得到的消光系数ε来计算纳米颗粒溶液的浓度cNS是可能的。

[0087] 为确定每毫克颗粒中的染料的摩尔数进行了质量分析。因为统计学的原因，3个小瓶中充满了300μL每一种类型的颗粒并在真空干燥箱内干燥过夜。所获得的质量mNS被用于计算稀释的纳米颗粒溶液中的染料量mNSD。使用该数值，通过浓度cNS除以稀释溶液中染料毫克数mNSD以获得每毫克颗粒中的染料的摩尔数。

[0088] 表1显示了不同颗粒类型中的染料的量(每mg颗粒摩尔数)。这些颗粒中的染料-8浓度范围为大约1至17x10 摩尔染料每mg颗粒。

[0089] 表1：不同颗粒类型的每mg颗粒的摩尔数

[0090]

[0091] 透射电子显微镜(TEM)被用于确定颗粒的大小和结构。图4a-4j显示了掺杂染料的介孔颗粒的代表性TEM图像。这些图像显示在合成过程中当更多染料被加入后，纳米颗粒的结构发生了改变。具有少量染料的颗粒形成了类似球状的结构，而具有更高量的染料的颗粒形成了杆状结构。然而，所有这些颗粒都显示出了或多或少的孔，但是多孔性似乎随着染料掺杂量的提高而降低。

[0092] TEM显示颗粒中染料的量低于0.18mol％时，该颗粒大小约为100nm。具有更高量的染料的纳米颗粒稍微更大些。0.14-0.18mol％的染料量高且形成的孔结构更差，特别是0.20-0.40mol％的颗粒出现了难以激发化学发光的困难(如下述实验结果所示)。该观察结果增强了一假设，即当1，2-二氧杂环丁烷二酮无法接近染料时，NIR-染料自淬灭或激发是不可能的。但是应当注意的是低强度的化学发光是可检测的，即便是对于0.40mol％的颗粒。

[0093] 过氧化氢和氢氧化钾对化学发光的激发

[0094] 测试图4所示颗粒类型和游离染料溶液的化学发光。为获得可比较的结果，所有颗粒类型都进行了吸光度匹配，吸光度匹配如图5所示。光密度被匹配至5％变化以内。

[0095] 为对吸光度进行匹配，制备的纳米颗粒和染料溶液都采用正己醇、乙酸乙酯和草酸二苯酯的混合物进行稀释(稀释混合物含有的组合物与上述对颗粒的描述相同)。

[0096] 用12μL KOH/H2O2溶液激发每一个稀释的溶液(参见以上所述)。因为水溶液和正己醇/乙酸乙酯适中的溶解性，混合物被较好地混合。25s后开始首次测量。更多数据在70s及随后每40s(例如，1l0s、150s等)被记录。图6显示了各种类型的颗粒以及游离染料的化学发光衰减。大约4分钟后，所有的化学发光都消失了。

[0097] 为了更仔细地观察颗粒和染料之间的差异，图7显示了所有颗粒化学发光的最大强度的峰(25s)。游离染料的强度峰显示在25xl0^-8摩尔每mg颗粒处。请注意该浓度值只是一个位置标志符。

[0098] 总体上，图表显示颗粒化学发光随着与掺杂的染料的量的提高而降低。前三种颗粒类型显示出几乎相同的化学发光强度，然而剩下的颗粒类型的强度上都有下降。为了解释该现象，有多种可能的解读。

[0099] a)一个问题可能是随着更高量的染料，染料分子更加接近颗粒中另一个染料分子而导致淬灭。

[0100] b)随着更多染料的掺杂，颗粒多孔性不好了。在具有更低量的染料的颗粒中，孔结构保持的更好，染料分子更易于接近。

[0101] c)使用的碱，氢氧化钾，可能与染料发生反应。这可以解释为何游离染料的化学发光强度非常低。

[0102] 图8示例性的显示了0.10mol％颗粒的化学发光衰减图表。

[0103] 过氧化氢对化学发光的激发

[0104] 不使用碱激发进行类似实验。用12μL过氧化氢(30％)激发1mL各种制备的颗粒类型和染料溶液。颗粒和染料的溶剂是含有先前所述草酸二苯酯的正己醇和乙酸乙酯。

[0105] 对不同颗粒进行如图9所示的吸光度匹配，从而允许结果可以比较。为了匹配吸光度，制备的纳米颗粒和染料溶液都采用正己醇、乙酸乙酯和草酸二苯酯的混合物进行稀释(和上述组合物相同)

[0106] 图10显示了所有经过吸光度匹配的颗粒类型的化学发光最大强度的峰(25s)。游离染料的强度峰显示在25x10^-8摩尔和30x10^-8摩尔每mg颗粒处。请注意这些染料浓度值只是位置标志符。

[0107] 再次地，强度随着染料掺杂量的降低而增加(类似于使用碱激发的化学发光测试)。然而，所有颗粒类型达到的最高强度只有使用KOH激发的大约一半。这似乎表明KOH的存在对于增加颗粒上所看到的亮度很重要。但同时随着强度的降低，观察到化学发光持续力增加了。这表明反应在没有碱催化存在的情况下减慢了。图11示例性的显示了0.06mol％颗粒的化学发光衰减。化学发光持续了大约14分钟，是H2O2/KOH激发的三倍。

[0108] 除了不同的颗粒性质外，吸光度匹配的游离染料溶液显示出了与0.06mol％颗粒一样高的化学发光强度。因为使用游离染料溶液和碱的实验显示的强度非常低，这个新的结果增强了一假设，即氢氧化钾与染料分子相互作用。

[0109] 系统对过氧化氢灵敏度

[0110] 由于该开发的系统是很好的过氧化氢指示剂，而且二氧化硅纳米颗粒在生物相容性上是有前景的候选物，因此值得考虑将颗粒应用于活的生物体，如细胞。当然，所有传感系统的优化对于颗粒的生物应用是非常重要的。例如，增加系统的灵敏度是必要的。

[0111] 为了研究人肿瘤细胞中过氧化氢的浓度，颗粒的灵敏度是最为重要的。已知这些4
细胞产生高达0.5nmol/10 个细胞/h的过氧化氢。这是一个非常低的单个肿瘤细胞过氧化氢浓度。现在，颗粒达到的灵敏度为0.33μmol过氧化氢每毫升颗粒溶液。这表明系统的优化是不可避免的。除了化学优化，也推荐采用更高灵敏度的仪器用于系统的生物学应用。

[0112] 此外，将草酸酯整合入纳米颗粒中也是必要的，因为细胞中除了过氧化氢外，其它分子也可能与游离草酸酯发生反应。如果将草酸酯掺杂入纳米颗粒中，则过氧化氢的错误阳性结果将会减少。

[0113] 由于细胞中的分子在近红外区域不显示吸收，应用近红外染料将是有优势的。然而，已知近红外染料显示出的化学发光比与其它染料低。使用可见染料可以增加系统的灵敏度和化学发光的亮度。

[0114] 一个好的系统优化的出发点是通过减少加入过氧化氢的量来测试系统对过氧化氢灵敏度。对于最初的实验，也为了能与游离染料进行比较，对所有溶液再次进行如图12所示的吸光度匹配。检测的代表性的纳米颗粒为掺杂0.08mol％染料的纳米颗粒。

[0115] 在1mL吸光度匹配的纳米颗粒溶液中加入体积为12μL、6μL、3μL以及1μL的过氧化氢(30％)。如图13所示，化学发光强度随着加入过氧化氢的量的减少而降低。这些实验结果是预料之中的，因为反应可得到的激发分子更少了。

[0116] 另一现象是随着加入的过氧化氢量的减少，化学发光持续力增加了。

[0117] 游离染料溶液的性质仍不清楚。当更少量的过氧化氢被加入时，化学发光似乎随着时间增加，如图14所示。然而当更多的过氧化氢被加入时，化学发光强度持续降低，如图13箭头所示。

[0118] 实施例2

[0119] 含有吸收染料的核-壳纳米颗粒的制备及表征

[0120] 实验方法

[0121] 染料选择。根据染料的特征性反应基团和吸收峰的波长选择吸收染料。实验使用的染料是6-(2，4-二硝基苯基)氨基己酸，吸收峰大约在350nm的琥珀酰亚胺酯(DNP-X)以及吸收峰在485nm的QXL490C2胺。用这两种染料可探究含有吸收染料的核-壳纳米颗粒从而深入研究吸收光谱中的紫外(DNP-X)和可见(QXL490)区域。

[0122] 颗粒形成。为制备含有DNP-X和RXL490染料的核-壳纳米颗粒，每种染料连续进行三次基于 方法的25mL，20nm颗粒反应用于合成二氧化硅纳米颗粒。每种染料同样进行一次25mL，100nm颗粒反应。

[0123] 购买的染料是粉末包装的。为便于处理和精确测量，将每种粉末染料溶于二甲基亚砜(DMSO)中以获得所需浓度。之后将染料与二氧化硅前体结合。这是通过分别使用异氰酸基丙基三乙氧基硅烷(ICPTS)和氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)处理DNP-X SE和QXL490胺来完成的。该结合反应被置于搅拌盘上并允许反应直至24小时。

[0124] 为形成核-壳纳米颗粒的富含染料的核，将结合的染料和正硅酸四乙酯(TEOS)与乙醇、水、和氨水的混合物搅拌24小时。核反应一旦完成，加入更多的TEOS，再反应24小时以形成二氧化硅外壳。这生成了核-壳纳米颗粒的核-壳结构，富含染料的核及二氧化硅的壳。

[0125] 颗粒清洗及测量。含有核-壳纳米颗粒的最终溶液是乙醇、水、和氨水和未反应的染料、或颗粒生成过程中未耗尽的TEOS的混合物。为了获得准确的吸收测量结果和粒径分析结果，需要只含有颗粒和乙醇的洁净溶液。因此，使用3500MWCO透析管在搅拌的乙醇中透析原始溶液样本至少8小时。经过足够时间后，袋子中的颗粒洁净溶液被移除并储存在密封瓶中。剩余的原始颗粒溶液也被储存于分离的封口瓶中。

[0126] 为证实核-壳纳米颗粒已适当地形成而且染料已成功的掺杂至颗粒中，两种测量是必需的。为确定颗粒的尺寸，将样品置于石英比色皿中并使用Brookhaven动态光散射(DLS)装置。该仪器通过激光束穿透颗粒稀释溶液时的颗粒光散射消减图像确定颗粒尺寸。为证实吸收染料被适当地掺杂至颗粒中，采用分光光度计测量吸光度。将每种游离染料样品稀释100倍并用于与新制的核-壳纳米颗粒进行比较。对于DNP-X，分光光度计光谱范围被设置为300nm至450nm且间隔为2nm，对于QXL490，光谱范围为390nm至590nm，间隔也是
2nm。用于稀释染料和颗粒样品的溶剂是乙醇。选择该溶液是基于其折射率与颗粒的二氧化硅壳的折射率相匹配。因此该溶剂可减少溶剂和颗粒外壳之间界面的光散射的影响，所述光散射可屏蔽(mask)所测量的吸收性质。拍摄颗粒每次反应的SEM(散射电镜显微镜)图像以进一步证实尺寸分布。对于较大的颗粒，这些SEM图像也提供了颗粒表面的有关多孔性的信息。

[0127] 结果

[0128] 一旦溶于乙醇，DNP-X生成亮黄色溶液而QXL490生成亮橙色溶液。在染料结合过程中，两种溶液都因为稀释而变成纯粹染料溶液的微淡型。通过稀释，核的形成使结合的染料变淡，以至DNP-X变成了半透明的黄色而QXL490变成了亮黄色。在核形成后或加入壳后，烧瓶底部没有发现沉淀。在这些步骤中的任一步出现沉淀都将是颗粒未适当生成的指示。所有三次20nm颗粒的DLS数据和分光光度数据以及第一次100nm颗粒的DLS数据都被绘制成图表。来自DLS数据的20nm大小数据的如图16和图17所示。三批QXL490颗粒具有相似的主要尺寸，范围为8.72nm至13.5nm而三批DNP-X颗粒的主要直径范围为15.7nm至
18.2nm。100nm反应的DLS尺寸数据如图18和图19所示。DNP-X100nm反应的主要尺寸是
190nm而QXL490100nm反应的主要尺寸是255nm。分光光度数据通过减去测定的参考数据来进行比色皿和溶剂(乙醇)的校正。染料和颗粒样品均进行了上述校正。之后将颗粒数据归一化至染料数据。图20和21分别显示DNP-X染料和颗粒的吸收数据以及QXL490染料和颗粒的吸收数据。QXL490染料的吸收峰是440nm，比QXL490颗粒的吸收峰大大约2nm。
DNP-X染料的吸收峰发生在348nm，比DNP-X颗粒的吸收峰小大约2nm。两种20nm的反应以及100nm的反应的SEM图像如图22-25所示。

[0129] 讨论

[0130] 通过DNP-X和QXL490的DLS数据获得的颗粒尺寸都处在同一数量级，数值大约为20nm。这证实颗粒已经形成。在20nm DNP-X颗粒第二次反应中观察到的次级成核现象推测是由于时间或浓度反应参数的细微变化而导致的。因为主峰仍然与第一次和第三次反应相符且次级峰也不是处于不同的数量级，因此它的存在可被忽略。前两次反应的SEM图像在颗粒尺寸上相互吻合证实了DLS数据的有效性。调查性100nm反应的尺寸数据均大于100nm，然而，因为100nm只是基于同荧光TRITC染料反应的反应参数名称，更大的尺寸为这些新染料提供了起点，且没有显示任何问题。同样，SEM中观察到的颗粒尺寸与DLS数据相互吻合，证明了DLS尺寸数据实际源于颗粒尺寸且未发生聚集。同时，两组100nm反应的表面在SEM中都显示为均匀的光滑球状颗粒，这表明反应成功生成了非多孔的保护外壳。

[0131] 20nm反应的吸收数据证实染料被成功掺杂入二氧化硅核-壳结构中，其没有在过程中淬灭，也没有在透析过程中滤出。DNP-X染料和颗粒的吸收峰强度与文献数值之间不存在偏移，乙醇中的染料和颗粒具有相同的吸收峰，这表明DNP-X染料掺杂入颗粒中并未影响其吸收峰特性。QXL490染料和颗粒与文献所述值490nm存在大约60nm的微小蓝移。然而，这是在预料之中的，因为测量溶剂不同；文献值报道的测量是以甲醇作溶剂，不同于本申请采用的乙醇溶剂。重要的是，染料和颗粒具有相同的峰值，这表明染料再次成功掺杂入颗粒中。

[0132] 通过使用吸收染料DNP-X和QXL490制备20nm核-壳纳米颗粒的目的实现了。尺寸分析和吸收测量都显示了在没有影响染料吸收特性及染料淬灭的情况下，染料被掺杂入颗粒中。在使用相同的20nm颗粒反应三次后，观察到可重复的实验结果。颗粒的吸收峰、过程每步中的溶液颜色、颗粒尺寸分布、以及SEM图像中显示的形状一致性在多次反应中都是一致的。三次反应中每步的颜色对比表明程序上是一致的。

[0133] 100nm颗粒反应成功地生成了更大的核-壳纳米颗粒。吸收测量被用于证实染料确实被掺杂了。采用类似的反应生产了60nm，250nm以及直径高达700nm的颗粒。此外，其它近红外区的染料也被成功掺杂入核-壳纳米颗粒中。

[0134] 虽然本发明通过引用特定实施例(其中的一些为优选实施例)的方式对发明进行特定地展现和描述，但是本领域技术人员都应该能够理解，在不脱离本发明披露的主旨和保护范围的情况下，上述内容还可以进行各种形式和细节上的变化。