乳腺癌易患基因GT198和其用途

摘要

已经发现在染色体17q21基因位点中的人GT198基因(基因符号PSMC3IP)是一个肿瘤抑制基因。GT198基因突变引起其显性失活的剪接变异体活性的增加，并且导致野生型GT198功能的丧失，从而诱导乳腺癌和卵巢癌。一个实施方式是利用GT198基因突变来确定方法或药物用以治疗或缓解由于GT198基因突变引起的一种或多种癌症症状。另一个实施方式是利用GT198基因突变来检测由GT198基因突变引起的癌症。此发明还可进一步用于鉴定药品，药品为治疗由GT198基因突变所引起的癌症的化合物、抗体和天然产物分子。使用拮抗或干扰GT198剪接变异体生物活性的药物应做为首选药物。

权利要求

1.一种DNA分子，其特征在于：该DNA分子编码GT198或其剪接变异体的mRNA，其碱基序列如SEQ NO：4、SEQ NO：5、SEQ NO：7、SEQ NO：8、SEQ NO：9、SEQ NO：10、SEQ NO：11或SEQ NO：12所示。

2.一种蛋白质，其特征在于：该蛋白质为GT198剪接变异体，其氨基酸序列如SEQ NO：

13所示。

3.一种使用GT198蛋白质做为药物靶子来筛选、提取和制造药物的方法，此药物用于乳腺癌，卵巢癌及女性生殖器官癌，该方法包括：通过抑制GT198蛋白质以抑制含有GT198蛋白的细胞的生物活性来确定有效药物的成分和剂量，该细胞包含权利要求2所述的蛋白质的胞浆转位。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述药物是抗体类药物，该抗体类药物是能与GT198或其剪接变异体蛋白在生理条件下特异性结合的抗体或诱导抗体的抗原结合片段。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述的抗体选自下列：单克隆抗体，多克隆抗体，单链抗体，人源化抗体，和嵌合抗体。

6.如权利要求3所述的方法，其中所述药物是化合物类药物，该化合物类药物是有效剂量的纯化的天然产物或合成化合物，并能够拮抗或抑制GT198蛋白或其剪接变异体蛋白的生物活性或生物可利用性。

7.一种使用GT198核酸做为药物靶子来筛选、提取和制造药物的方法，此药物用于乳腺癌，卵巢癌及女性生殖器官癌，该方法如下：通过抑制GT198核酸以抑制含有GT198基因突变的细胞的生物活性来确定有效药物的成分和剂量，突变的细胞含有如权利要求1所述的DNA分子，该药物是核酸类药物选自：由GT198序列组成的DNA片段、RNA片段、非编码RNA、siRNA、微小RNA、适体和多肽核酸。

8.一种试剂盒，是用于检测GT198基因异常的试剂盒，此试剂盒可用于评估乳腺癌，卵巢癌及女性生殖器官癌发生与生长的阶段，其特征在于： 通过体外分析提取的人生物样品来确定是否存在GT198基因和如权利要求1所述DNA分子的变异。

9.如权利要求8所述的试剂盒，该核酸探针检测的变异是GT198基因的一个或多个突变、异常、DNA拷贝数增减或基因重排。

10.如权利要求8所述的试剂盒，该核酸探针检测的变异是如权利要求1所述mRNA表达增加。

11.一种试剂盒，是用于检测GT198蛋白表达异常的试剂盒，此试剂盒可用于评估乳腺癌，卵巢癌及女性生殖器官癌发生与生长的阶段，其特征在于： 通过体外分析提取的人生物样品来确定是否存在GT198和如权利要求2所述的蛋白质的胞浆转位的变异。

12.如权利要求11所述的试剂盒，该试剂盒中还包括装有GT198抗体的容器，使用免疫组织化学方法，用该GT198抗体来检测的变异是GT198蛋白或其剪接变异体蛋白在肿瘤组织中由正常的细胞核表达变为异常的细胞浆表达。

13.如权利要求1所述的GT198剪接变异体的mRNA或蛋白质的拮抗剂在制备用于治疗乳腺癌或卵巢癌药物的增效剂的应用。

14.如权利要求13所述的应用，其中所述拮抗剂是GT198抗体或其抗原结合片段。

15.如权利要求14所述的应用，其中抗体选自：单克隆、多克隆、单链、人源化和嵌合的。

16.如权利要求13所述的应用，其中所述的拮抗剂选自：siRNA、微小RNA、适体和肽核酸。

17.如权利要求13所述的应用，其中所述的拮抗剂是拮抗或抑制GT198和如权利要求

2所述的剪接变异体蛋白的纯化的天然产物或合成化合物。

说明书

乳腺癌易患基因GT198和其用途

[0001] 相关申请的交叉参考文献

[0002] 这个申请于2009年4月20日在美国提交了美国临时专利申请其申请号为61/212,974并要求了优先权和利益，并且在此处并入参考文献于申请中。

技术领域

[0003] 本发明的技术方面通常涉及分子生物学、基因诊断学和基因治疗的领域。技术背景

[0004] 癌症是影响大部分人口的常见致命疾病。(美国)国立癌症研究院估算在美国每年校正年龄的癌症死亡率是每100,000个男性和女性中的192.7人。在2003年1月份，大约1050万美国人患过癌症。乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，并且特别是在美国是45岁以上女性中死亡率的主因。每年确诊185,000例以上新病例，并且超过40,000名女性死于该疾病。然而，只有非常小百分比的乳腺癌和卵巢癌归因于癌症易患基因BRCA1和BRCA2中突变的遗传。大多数乳腺癌和卵巢癌都需要用于诊断和治疗的另外的乳腺癌基因知识。

[0005] 癌症是一组疾病，其特征在于异常细胞的不受抑制的生长和扩散。如果扩散不受抑制，它可以引起死亡。癌症是由外因(烟草、化学制品、辐射和传染性生物体)和内因(遗传突变、激素、免疫状况和由于新陈代谢所引起的突变)引起的。已经深入研究了参与癌症发展的基因表达的调节，但是仍旧需要用于检测癌症的治疗的方法。

[0006] BRCA1和BRCA2基因中种系突变解释了家族乳腺癌和卵巢癌中增加易患性的原因(Nathanson，K.L.，et al.，Nat Med，7：552-6(2001))。BRCA1编码带有N-末端环形结构域和C-末端BRCT结构域的1863个氨基酸的蛋白质，该N-末端环形结构域有利于遍在蛋白化作用，该C-末端BRCT结构域刺激转录激活(Welcsh，P.L.，et al.，Trends Genet，16：69-74(2000))。一旦电离辐射时，该BRCT结构域诱导RNA聚合酶II的切割(Bennett，C.B.et al.，PLoS ONE，3：e1448(2008))。BRCA1的大外显子11所编码的序列结合Rad51，Rad51是对同源重组和DNA损伤应答至关重要的蛋白质(Chen，J.J.，et al.，Cancer Res，59：1752s-1756s(1999))。BRCA1的可变剪接变异体，诸如BRCA1Δ11b和BRCA1-IRIS(Wilson，C.A.et al.，Oncogene，14：1-16(1997)；ElShamy，W.M.&Livingston，D.M.，Nat Cell Biol，6：954-67(2004))已经被鉴定具有对BRCA1功能有潜在影响作用。

[0007] BRCA2编码3418个氨基酸的蛋白质，并且具有与BRCA1非常相似的组织表达模式(Chodosh，L.A.，J Mammary Gland Biol Neoplasia，3：389-402(1998))。它的大外显子11编码8个序列重复，命名为BRC重复，其中6个与Rad51相互作用(Bork，P.，Blomberg，N.&Nilges，M.，Nat Genet，13：22-3(1996)；Bignell，G.，et al.，Hum Mol Genet，6：53-8(1997)；Davies，A.A.et al.，Mol Cell，7：273-82(2001))。晶体结构分析证明BRC重复模拟Rad51寡聚界面之间的分子构象(Pellegrini，L.et al.，Nature，420：287-93(2002))，并且证明BRCA2与Rad51的结合对两者的功能是必需的(Gudmundsdottir，K.&Ashworth，A.，Oncogene，25：5864-74(2006))。BRCA2的mRNA转录产物也经历复杂的可变剪接，并且由于其比较大的基因尺寸，它的剪接产物完全不能被确定(Speevak，M.D.，et al.，Eur J Hum Genet，11：951-4(2003)；Bieche，I.&Lidereau，R.，Cancer Res，59：
2546-50(1999))。

[0008] BRCA1和BRCA2之间亲密的功能关系表明了乳腺癌和卵巢癌中DNA修复路径的参与。然而，明显地与激素调节相关的乳腺癌和卵巢癌的特定风险还没有被充分地解释。此外，在染色体17q21基因座的早期连锁分析已经提供了乳腺癌和卵巢癌易感性的实质性证据，该乳腺癌和卵巢癌易感性以孟德尔方式在具有早期发病癌症的家族中遗传(Hall，J.M.et al.，Science，250：1684-9(1990)；Hall，J.M.，et al.，Am J Hum Genet，50：1235-42(1992)；Narod，S.A.，et al.，Lancet，338：82-3(1991))。然而，BRCA1突变仅仅解释一部分具有17q21关联的家族(Nathanson，K.L.，et al.，Nat Med，7：552-6(2001)；
Miki，Y.，et al.，Science，266，66-71(1994))。这种矛盾现象引起了对BRCA1基因座内另外候选基因存在的思考(Vogelstein，B.&Kinzler，K.W.，Cell，79：1-3(1994))。在
1995年，在17q21的BRCA1附近寻找新基因的作图期间，GT198(基因组转录物198，基因符号PSMC3IP，也称为TBPIP或Hop2)被鉴定为一个cDNA克隆(Rommens，J.M.，et al.，Genomics，28：530-42(1995))。GT198后来被鉴定为核受体激活因子，其与核受体相互作用，并且参与雌激素、雄激素和孕激素受体介导的基因调节(Ko，L.，et al.，Mol Cell Biol，22，357-69(2002)；Satoh，T.，et al.，Endocrinology，150：3283-90(2009))。后来也发现GT198与酵母Hop2是同源的(Petukhova，G.V.，et al.，Dev Cell，5：927-36(2003))，与Rad51相互作用，并且刺激同源重组中DNA链交换与参与DNA修复路径(Enomoto，R.，et al.，J Biol Chem，281：5575-81(2006)；Pezza，R.J.，et al.，Genes Dev，21：
1758-66(2007)；Enomoto，R.，et al.，J Biol Chem，279：35263-72(2004))。

[0009] 用现有的BRCA1和BRCA2基因来检测乳腺癌和卵巢癌以及治疗癌症通常是不够的，因为这些基因突变不发生在大量的偶发的癌症。

[0010] 因此，本发明通过确认GT198基因突变存在于偶发的癌症中来提供了用于癌症，例如乳腺癌和卵巢癌，的早期检测或诊断的方法。

[0011] 本发明的另一个目的是提供了用于与癌症相关的一种或多种症状治疗的方法。

[0012] 另一个目的是提供用于筛选药物诸如化合物和小生物分子，和抗体的方法，该化合物和小生物分子可抑制或减缓由于一个或多个GT198基因突变而引起癌细胞的病理发展。

[0013] 另一个实施方式是提供了用GT198作为癌症检测和诊断的生物标记。

发明内容

[0014] GT198和其可变剪接变异体是有用的生物标记，优选地用于卵巢癌和乳腺癌的检测和诊断。已经发现17q21上的GT198基因在其调节和功能方面与BRCA1具有惊人的相似性。一种实施方法是通过确定获自受试者的生物样品中GT198基因的一个或多个突变、改变或重排的存在，来检测或帮助癌症的诊断。在一些实施方法中，通过用探针接触样品完成确定步骤，该探针对GT198基因的一个或多个突变、改变或重排或者GT198基因产物有特异性，以在探针和GT198基因或基因产物之间形成可检测的复合物。生物样品中有可检测的复合物的存在表示癌症。GT198中优选的突变包括，但是不限于GT198外显子4中取代，在外显子4的核苷酸85的突变，在GT198内含子4的核苷酸88的突变，或者在GT198的5’非翻译区的核苷酸31的突变。首选的GT198剪接变异体包括，但不限于GT198a、GT198-1、GT198-2、GT198-3、GT198-4和GT198a-4。

[0015] 另一个实施方式是提供了用于检测由于GT198中基因突变和拷贝数缺失或含有GT198蛋白质剪接变异体蛋白增加的的细胞所引起的癌症的方法。使用PCR、构象敏感的凝胶电泳和直接测序方法可以检测GT198突变。通过定量实时PCR、Southern印迹法和基因组步移、原位荧光杂交方法可以检测拷贝数改变。用于检测癌症组织中GT198变异体蛋白质表达的示例性方法包括，但不限于免疫组织化学分析。检测出由一个或多个GT198突变而造成的GT198变异体表达的增加表示癌症的发生。

[0016] 用于诊断或帮助癌症诊断的另一种方法包括：通过用探针接触样品，确定获自受试者的样品中GT198的胞浆表达水平，该探针对GT198特异并在探针和GT198基因或基因产物之间形成可检测的复合物，其中相对于对照组升高的GT198胞浆表达水平表示癌症的发生。

[0017] 还有另一个实施方法是使用生物分子治疗癌症的方法，该生物分子抑制、减少、阻断或防止GT198和GT198变异体蛋白质起作用。或者，这些化合物可以减少或抑制GT198或其变异体的生物可利用性。用化合物拮抗或干扰具有GT198变异体蛋白质异位胞浆表达的细胞中GT198和/或其可变剪接变异体，包括GT198a的生物活性，是首选方法。

[0018] 另一个实施方法是筛选合成或天然的化合物的方法，该合成或天然的化合物抑制GT198或其可变剪接变异体的活性。该方法包括筛选抗体或小核酸分子，就像siRNA、微小RNA(miRNA)、适体和肽核酸以抑制GT198或可变剪接变异体的活性。

[0019] 也可以制造试剂盒。范例的试剂盒包括装有核酸探针的容器，该核酸探针具有在严格条件下与编码GT198变异体蛋白质的核酸杂交，而在严格条件下不与编码野生型GT198蛋白质的核酸杂交并至少含10个核苷酸。

附图说明

[0020] 图1a是BRCA1、变异体BRCA1Δ11b、BRCA2、GT198和变异体GT198a结构的图示，其中含有BRC重复的序列表示为黑盒。GT198 N末端和亮氨酸拉链结构域表示为明盒。图1b是使用ClustalW 2.0.8软件得到的蛋白质同源性分析，BRCA2和GT198 C-末端结构域(SEQ ID NO.3)中BRC3(SEQ ID NO.1)和BRC4 SEQ ID NO.2)的序列对齐。与BRCA2的BRC重复具有同源性的碱基被框出。相同的碱基用箭头表示，剩余的阴影的残基是保守的。数字表示氨基酸。图1c是表示GT198或BRCA1或BRCA2的剪接变异体对它们野生型起显性失活作用的图示。在Rad51(圆形)相互作用中，GT198潜在地与BRCA2竞争。

[0021] 图2a是通过5’互补DNA末端的快速扩增(5’RACE)和测序(没有绘制)所鉴定的人GT198剪接变异体的图示。哺乳动物包括人GT198具有8个外显子。内含子表示为线条，外显子表示为条形，蛋白质编码区表示为粗条形。示出了推知的翻译起始和终止密码子。顶部示出了引物位置。图2b-e是用500nM视黄酸(RA)诱导4天以形胚胎体(EB2-EB4)和未分化P19干细胞(EC)中相对的mRNA水平的条形图。使用实时聚合酶链式反应获得野生型BRCA1(图2b)、BRCA1Δ11b(图2c)、野生型GT198(图2d)或GT198a(图2e)的相对的mRNA水平。结果用相对的mRNA水平的平均数±s.e.m来表示，显示野生型与其剪接变异体呈现拮抗的表达。

[0022] 图3a是用所表示的MMTV-荧光素酶报道基因(100ng)和结合MMTV启动子的糖皮质激素受体(10ng)一起瞬时转染的P19细胞中转录活性的条形图。在配体地塞米松(100nM)存在(实心条形)或不存在(清晰的条形)的情况下，诱导细胞过夜，并且通过Dynex发光计测量荧光素酶活性。图3b是除了使用递增量的质粒-0.0ng(清晰的条形)、50ng(阴影条形)、100ng(影线条形)和200ng(实心条形)，如图3a中所转染和用地塞米松(100nM)诱导的P19细胞的转录活性的条形图。所示荧光素酶活性是三次重复转染的平均值±s.e.m(n＝3)。

[0023] 图4a是人GT198基因的示图。内含子表示为线条，外显子表示为盒子，Alu和L2重复序列表示为空的定向三角形，示出了翻译起始和终止密码子。填充的箭头表示突变，空的箭头表示单核苷酸多态性(SNPs)的位置。图4b是概述发病年龄、所鉴定的等位基因突变和SNPs(rs2292751，rs2292752)的表。图4c是具有乳腺癌的病例1、病例3和病例9(填充的圆形和方形)，其它类型癌症(阴影圆形和方形)或健康人(清晰的圆形和方形)的家族系谱。圆形表示女性，方形表示男性。里面的数字表示另外的健康同胞兄妹。斜线符号表示已故的个体。癌症类型、发病年龄和死亡年龄(d)如所得到的一样被表示(BC，乳腺癌；CRC，结直肠癌；ST，胃癌；SK，皮肤癌；LI，肝癌；ES，食道癌；PC，前列腺癌；LC，肺癌)。

具体实施方式

[0024] I.诊断癌症的诊断学和方法

[0025] GT198和其可变剪接变异体的变化可作为有用的癌症生物标记，优选地用于卵巢癌和乳腺癌的检测和诊断。GT198和其变异体的生物活性或生物可利用性的拮抗剂可以用于治疗一种或多种癌症的病症。在实施方法中，GT198的胞浆表达指示癌症发生。在另一种实施方法中，GT198剪接变异体的表达增高指示癌症发生。优选的GT198变异体包括，但不限于GT198a、GT198-1、GT198-2、GT198-3、GT198-4和GT198a-4。通过筛选抑制GT198或其变异体的生物活性可以鉴定用于治疗癌症的药物。

[0026] A.GT198

[0027] 当检索BRCA1基因座的另外乳腺癌基因时，GT198最初被鉴定为转录物(Rommens，J.M.，et al.，Genomics，28：530-42(1995))。GT198基因位于BRCA1下游和近端的470Kb，及HSD17B1远端的15Kb，在BRCA1定位克隆之前，HSD17B1是早期连锁分析期间所鉴定的最紧密连锁的标记之一(Anderson，L.A.，et al.，Genomics，17：618-23(1993)；Black，D.M.，et al.，Am J Hum Genet，52：702-10(1993))。人类GT198基因位于染色体17q21上HSD17B1和BRCA1基因之间。处于HSD17B1远端的15Kb和BRCA1近端的470Kb。哺乳动物及人GT198跨越5Kb，并且编码包含N-末端功能区和C-末端DNA结合功能区(DBD)的217个氨基酸的蛋白质(Enomoto，R.，et al.，J Biol Chem，279：35263-72(2004))，该N-末端功能区和C-末端DNA结合功能区(DBD)被亮氨酸拉链所连锁。GT198蛋白质二聚体依靠其亮氨酸拉链所形成(Ko，L.，et al.，Mol Cell Biol，22，357-69(2002))。

[0028] GT198的一级序列与BRCA2中BRC重复共同分享同源性，这为它与Rad51相互作用提供了有力的证据。GT198蛋白质的体内内源表达与BRCA1和BRCA2的内源表达极为相似，这表明它们通过相同的功能路径起作用。GT198具有双转录起始位点，该特征也存在于BRCA1中，允许野生型和它的剪接变异体转录物使用不同的转录起始位点进行差异化表达。GT198剪接变异体编码包含与BRC重复同源性的C-末端DNA结合功能区蛋白质序列，却不含N-末端功能区，从而抑制野生型GT198活性。在GT198和BRCA1中，正常的干细胞分化伴随有减少的剪接变异体和增加的野生型表达。而且，当用免疫组织化学分析几百个病例时，GT198变异体的异位表达诱导细胞调亡，阻断Rad51聚集灶形成，并且在初期乳腺癌，卵巢癌，子宫癌组织的细胞胞浆中发现该GT198变异体的异位表达。与上述一致的是，已知BRCA1的变异体BRCA1Δ11b在乳腺癌的胞质中表达(Wilson，C.A.，et al.，Oncogene，14，
1-16(1997))。而且，现在已经发现了早期发病家族乳腺癌患者中GT198的种系突变。在
33岁年龄发病的人中有一人具有产生提前终止密码子的突变，该提前终止密码子将阻止全长野生型GT198的表达，但是允许GT198剪接变异体的表达。在40岁年龄具有乳腺癌发病的她的姐妹也带有同样的突变。这一起表明GT198活性通过其可变剪接变异体可被调节。
GT198基因突变造成剪接变异体活性的增加可以诱导癌症起始。GT198是新的乳腺癌和卵巢癌易患基因，有助于对17q21相关的癌症易患性病例的诠释。

[0029] GT198是小蛋白质，并能够形成同源和异源二聚体，并且与包含核受体的锌指结构域的DNA结合蛋白及Rad51相互作用。GT198在转录和DNA修复方面的双重功能与BRCA1和BRCA2在转录和DNA修复方面的双重功能相同。因为BRCA1包含直接地修饰转录中RNA聚合酶II的C-末端结构域(Bennett，C.B.et al.，PLoS ONE，3：e1448(2008))，并且已经显示了作为核受体辅激活蛋白的功能，所以当BRCA1和GT198同时工作时，BRCA1可以介导GT198的转录活性。相反，乳腺癌和卵巢癌中BRCA1的激素诱导活性也可能通过核受体相关的GT198起作用。BRCA1和GT198作为配偶体是一个正确的模型并将能解释它们在组织中的共表达，它们在干细胞分化中的协调调节，它们在转录和DNA修复路径中的共同参与，以及它们在乳腺癌和卵巢癌中的相似改变。以前的证据已经支持在乳腺癌和卵巢癌的起始中类固醇激素调节和DNA修复活性是等同参与的。

[0030] 可变剪接调控控制机制是pre-mRNA转录中的不可缺少的组成步骤，并且人类基因组中90％以上的多外显子基因是可变剪接的(Pan，Q.，et al.，Nat Genet，40：1413-5(2008))。在正常发育和细胞分化中，剪接变异体影响野生型活性。在各种疾病或癌症中经常地发现剪接变异体缺陷或增加(Kalnina，Z.，Genes Chromosomes Cancer，42：
342-57(2005)；Venables，J.P.，Bioessays，28：378-86(2006))。BRCA1和BRCA2的突变筛选表明几千种变化(Meindl，A.，Int J Cancer，97：472-80(2002))，其中的许多可以改变可变剪接变异体(Brose，M.S.，et al.，Genet Test，8：133-8(2004))。在BRCA1的远处增强子或启动子区域的等位基因序列缺失和重排也可以影响它的可变剪接调节(Orban，T.I.&Olah，E.，Mol Pathol，56：191-7(2003))。GT198的多个剪接变异体产生相同功能的结果。如果这种现象也存在于BRCA1中，那么野生型BRCA1活性可以受各种其剪接变异体控制。野生型和变异体转录物的差异化表达可以通过两个转录起始位点完成，这两个转录起始位点在早期干细胞分化期间交替使用，并且相似地存在于GT198和BRCA1中。在干细胞分化期间也发现了野生型BRCA2的增加的表达，尽管BRCA2变异体被表征不易检测。通常，剪接变异体到野生型的转换存在于以前发表报道的癌基因CoAA中，表明在干细胞分化中可变剪接调控的关键作用(Brooks，Y.S.，et al.，J Biol Chem，284：18033-46(2009)；Yang，Z.，et al.，Nucleic Acids Res，35：1919-1932(2007))。因为剪接变异体是竞争地表达，并且常常功能上与野生型对抗，变异体的下调允许野生型的上调。相反，由大范围突变所引起的变异体异常上调可以表型地等同其野生型缺陷，即“癌症抑制基因的缺失”。当需要GT198或BRCA1时，这将阻止正常细胞分化。

[0031] 来自于遗传连锁研究的早期证据证明了家族乳腺癌与BRCA1和HSD17B1标记的紧密关联(Hall，J.M.，et al.，Science，250：1684-9(1990)；Hall，J.M.，et al.，Am J Hum Genet，50：1235-42(1992)；Anderson，L.A.，et al.，Genomics，17：618-23(1993)；Black，D.M.，et al.，Am J Hum Genet，52：702-10(1993)；Easton，D.F.，Bishop，D.T.，et al.，Am J Hum Genet 52：678-701(1993))，后者编码17β-羟甾类脱氢酶。因为在连锁家族中HSD17B1基因内没有鉴定出突变(Simard，J.，et al.，Hum Mol Genet，2：1193-9(1993))，后来的努力聚焦在BRCA1标记上。BRCA1的克隆基于家族与D17S1321和D17S1325区域的连锁，该区域侧翼于BRCA1，但是排除HSD17B1和GT198基因(Miki，Y.，et al.，Science，266：66-71(1994)；Neuhausen，S.L.，et al.，Hum Mol Genet，3：1919-26(1994))。GT198在HSD17B1附近5Kb具有小基因尺寸，因此在历史候选基因鉴定中被遗漏。随后的研究表明在17q21相关癌症家族中BRCA1的参与有限，产生了在BRCA1基因座内存在另外未鉴定候选基因的推测(Vogelstein，B.&Kinzler，K.W.，Cell，79：1-3(1994))。鉴于如这里所述的GT198的功能和遗传的证据，GT198很可能是在染色体17q21基因座上另一个乳腺癌易患基因。

[0032] 在过去偶发性乳腺癌和卵巢癌的研究中没有用遗传方法鉴定出GT198，存在另一个可能的原因。以前对体细胞突变的大多数遗传分析依赖于肿瘤块，而不是依赖于稀少的引发肿瘤的干细胞。一个还在争论的新出现的假说是说肿瘤细胞不是从引发癌症的细胞生长出来的，但引发癌症的细胞才带有首发的遗传突变。而是，肿瘤细胞生长受包含引发癌症的癌干细胞的肿瘤环境影响，但不携带首发遗传突变。如果这种假说证明是正确的，那么没有可见的标记，不可能从肿瘤块鉴定出小百分数GT198阳性细胞中的遗传改变。因此，GT198和BRCA1的功能性分析可能是鉴定该候选者的必需步骤，癌基因候选者GT198可能参与偶发性癌症，此点以被在初期肿瘤中其异常胞浆表达的证据所支持。

[0033] B.诊断学

[0034] GT198变异体蛋白质和编码它们的核酸片段可以用在诊断测定法，筛选测定法及治疗应用中。在一些实施方法中，可用GT198剪接变异体和可变剪接变异体的表达来作为诊断标记对所引起的癌症进行检测。代表性的剪接变异体包括GT198a、GT198-1、GT198-2、GT198-3、GT198-4和GT198a-4。代表性癌症包括，但不限于卵巢癌和乳腺癌。受试者癌组织中一个或多个GT198剪接变异体表达水平的的升高可作为检测癌症的指标，诸如对乳腺癌和卵巢癌的确定或诊断。GT198可以是多肽或核酸。为了检测或诊断癌症，可以建立GT198表达或活性的基准值以作为受试者中癌症的诊断和/或预后的基础。优选的受试者包括哺乳动物，包括但不限于人类。在一些实施方式中，这是通过取自正常受试者(无癌症的受试者)的体液、组织活检或细胞提取物与在适合于复合物形成的条件下特异地与编码GT198变异体的核酸杂交的一个或多个抗体或核酸的结合来完成。这种条件是本领域所公知的。通过比较正常样品中抗体-靶复合物的水平与阳性对照的稀释系列，可以定量标准复合物形成的量，包括已知数量的抗体结合和已知浓度的纯化的GT198变异体。获自正常样品的标准值可以与获自怀疑患有癌症的受试者的样品的值比较。标准值和受试者值之间的偏差可建立疾病状态的存在或易患性的数据。

[0035] 在其它实施方式中，确定癌症表型中不同细胞状态的GT198剪接变异体的表达水平；即，评估无癌症的组织中和癌症组织中GT198变异体的表达水平，以提供表达图谱。特定细胞状态或发育点的表达图谱基本上是状态的“指纹”；虽然两种状态可以具有任何特定的基因或相似表达的GT198变异体，但是对基因或GT198变异体数量的评估可对细胞状态作出特异的基因或GT198变异体表达的图谱。通过比较不同状态中细胞的表达图谱，则可获得关于在这些状态中基因或GT198变异体的重要的信息(包括基因或变异体的上调和下调)。然后，通过确定来自于特定患者的组织是否具有正常或癌组织的基因表达图谱来完成或确定诊断。

[0036] 如这里所用的“差异表达”或语法上的等同用语意是指在细胞内和细胞之间的GT198变异体的时间和/或细胞表达中定性及定量的差异。因此，差异表达的GT198变异体在例如对卵巢癌组织比较中可以定性地具有改变的表达，包括激活或失活。即，GT198变异体可以在相对于另一种状态的特定状态中被打开或关闭。如本领域技术人员所显而易见地可以进行两种或多种状态的任何比较。这种定性调节的GT198或其变异体将在不同状态或细胞类型中显示不同表达，该状态或细胞类型通过标准技术可以比较检测，但是在两者中不可都单独检测。或者定量的检测表达是增加或减少。即，GT198变异体的表达或者被上调，引起增加数量的转录物，或者被下调，引起减少数量的转录物。表达不同的程度仅仅TM需要足够大以通过如下所列的标准表征技术，诸如通过Affymetrix GeneChip 表达阵列，Lockhart，Nature Biotechnology，14：1675-1680(1996)的使用来定量。其它技术包括，但不限于定量逆转录PCR，Northern分析和RNase保护。表达的改变(即，上调或下调)是至少约50％，更优选地至少约100％，更优选地至少约150％，更优选地至少约200％，从300到至少1000％是特别地优选的结果。

[0037] 正如本领域技术人员所知，这可以通过对GT198变异体转录物或蛋白质表达水平的评估来完成；也就是，可以使用GT198变异体转录物的DNA或RNA等同物的核酸探针来监测基因表达的量，并且例如，通过使用GT198变异体蛋白质的抗体和标准免疫测定法(ELISAs，等)或其它技术，包括质谱测定法、2D凝胶电泳测定法等，可以监测GT198变异体表达水平或者可最终测定GT198变异体产物本身(蛋白质)的量。因此，可以在癌症诊断检测评估对应于GT198变异体的蛋白质，该蛋白质即在癌症表型中被鉴定为是重要的蛋白质。

[0038] 在一些实施方式中，GT198变异体的抗体可以用在原位成像技术中。优选方法可以是用对GT198变异体多肽特异的抗体，而不与野生型GT198多肽结合的抗体来检测。在这个方法中，细胞与GT198变异体多肽的一个至多个抗体接触。冲洗以移除非特异性抗体结合后，检测单个或多个抗体的存在。在一个实施方式中，通过与包含可检测标记的第二抗体温育来检测抗体。在另一个方法中，GT198变异体的第一抗体包含有可检测的标记。在另一个优选的实施方式中，多个第一抗体中每个抗体都可包含不同的可检测的标记。这个方法在同时筛选多个癌症标记，例如BRCA1或BRCA2方面特别适合应用。如本领域普通技术人员所知道的，大量其它的组织成像技术都可以使用。

[0039] 在一些实施方式中，用荧光计来检测标记，该荧光计具有检测和区分不同波长发射的能力。此外，荧光激活细胞分选仪(FACS)也可以用在该方法中。

[0040] 在一些实施方式中，标记的GT198或GT198核酸探针与组织阵列可原位杂交。例如，组织样品是包括癌症组织和/或正常(无癌症组织)的阵列。如本领域所知，然后可以做原位杂交。相对于对照具有升高水平的一个或多个GT198变异体的细胞表示癌症可能存在。示例性的对照样品可包括来自于无癌症的受试者的细胞。

[0041] 已知当比较个体和标准之间的表达指纹时，本领域技术人员可以进行诊断及预后。进一步已知的是诊断的基因可以不同于预后的基因。来自于如上所诉阵列的数据可以用于诊断癌症和帮助预后。

[0042] 在优选的实施方式中，GT198变异体蛋白质、抗体、核酸可用于预后。在这些实施方式中，于长期预后方面，可以产生与癌症严重性相关的基因表达图谱。而且，这可以在蛋白质或基因水平上完成。在一些实施方式中，GT198蛋白质或核酸探针附着固相支持体，用于受试者组织中GT198变异体序列的检测和定量。如用于所概述的阵列进行诊断。

[0043] 在一种实施方式中，细胞胞浆中野生型GT198的存在表示有癌症存在。通常地，对野生型GT198特异的抗体可以用在细胞或组织的免疫检测中，以检测或定量胞浆中GT198。在另一个实施方式中，相对于对照，野生型GT198胞浆表达水平的升高表示癌症阳性。

[0044] 另一个实施方式提供了通过确定自受试者的样品中GT198变异体的表达及一个或多个另外基因中突变的表达来帮助癌症诊断的方法。例如，该方法可以包括确定BRCA1或BRCA2中突变的表达及确定一个或多个GT198变异体的表达。

[0045] C.治疗药剂的效力

[0046] 使用上述的诊断测定法也可以确定治疗药剂的药效，诸如抗体和/或其它候选药物的治疗效力。如本领域技术人员所知，确定治疗药剂的效力的测定法需要基准值的建立。在一些实施方式中，这是在用候选药物治疗前，通过取自患癌症的受试者的体液、组织活检或细胞提取物与GT198变异体的一个或多个抗体在适合于复合物形成的条件下结合来完的。这种条件是本领域所共知的。通过比较正常样品中抗体-靶复合物的水平与阳性对照的稀释系列，可以定量标准复合物形成的量，包括已知数量的抗体结合和已知浓度纯化的GT198变异体。获自治疗前患者的标准值可以与获自治疗后受试者的值比较。标准值和受试者值之间的偏差建立了药物的效力。

[0047] II.筛选方法

[0048] 在一些实施方式中，GT198变异体蛋白质、抗体、核酸和含有GT198变异体蛋白质或核酸的细胞可用于筛选方法之中。例如，可以进行调节癌症表型的药剂筛选。这可以通过筛选个体基因或蛋白质水平上基因表达，包括GT198变异体表达的调节剂或GT198变异体蛋白质活性的调节剂，或者通过评估药物候选者对“基因表达图谱”的效果来完成。在一些实施方式中，对表达图谱与高通量筛选技术结合的使用可以监测候选药剂治疗后的效果(参见Zlokamik，et al.，Science，279：84-8(1998))。

[0049] “调节”包括基因表达或活性方面的增加和减少。优选的调节量将取决于正常与肿瘤组织比较中基因表达的原始数值的改变，至少10％，优选地50％，更优选地100-300％，及在一些实施方式中300-1000％或更多改变。如果与正常组织比较，肿瘤中基因显示了4倍的增加，而期望的是约4倍的减少；如肿瘤比正常组织中10倍的减少给出了候选药剂表达中10倍的增加则是期望的，等等。

[0050] 如本领域技术人员所知，这可以通过变异体转录物或蛋白质水平的评估来完成；也就是，可以使用核酸探针监测GT198变异体mRNA表达的量，或者，通过使用GT198变异体的抗体和标准免疫测定法可以监测蛋白表达水平的量。

[0051] 或者，与蛋白质的结合和生物活性测定可以如下所概述完成。

[0052] 在一些实施方式中，完成了基因表达监测，并且除了同时监测GT198变异体以外，还同时监测了大量基因，即，表达图谱。如果需要，也可以完成多个蛋白表达监测。在监测多个基因或蛋白质的实施方式中，相应的GT198变异体探针被固定于固相支持体。可以理解并且已知的是，可以通过以下任何方法进行固定，包括例如，通过共价结合，通过静电固定，通过利用配体/配体相互作用的结合，通过接触或通过表面沉积。“固相支持体”或“固相基质”指在其上合成、附着、连接或以另外方式固定GT198变异体序列或抗体的任何固相材料。固相支持体可以由有机聚合物，诸如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚氟乙烯、聚氧乙烯和聚丙烯酰胺，以及共聚物和其分支体组成。固相支持体也可以是无机的，诸如玻璃、硅石、可控孔度玻璃(CPG)或反相硅石。固相支持体的构型可以是珠子、球形、粒子、颗粒、凝胶或表面的形式。表面可以是平面的，基本上平面的，或非平面的。固相支持体可以是多孔或非多孔的，并且可以具有膨胀或非膨胀特征。固相支持体可以由孔、凹陷或其它容器、器皿、特征或位置的形式构成。多个固相支持体可以在可寻址试剂的机器递送的各个位置的阵列中构成，或者由检测装置，包括通过激光照明和共焦或偏转光聚集的扫描构成。

[0053] 通常，在分析前添加候选生物活性药剂。这里所用的术语“候选生物活性药剂”或“药物候选者”或语法上等同的术语描述了待要被检测生物活性药剂的任何种分子例如，蛋白质、寡肽、小有机或无机分子、多糖、多核苷酸等，它们能够直接或间接地改变癌症表型，结合和/或调节GT198变异体的生物活性，或者GT198变异体序列的表达。在特别优选的实施方式中，候选药剂抑制癌症表型，例如达到正常组织指纹。通常，用不同的药剂浓度平行地进行大量测定混合物以获得对各种浓度的差异应答。通常，这些浓度之一作为阴性对照，即，在零浓度或检测水平以下。在优选的实施方式中，抑制一个或多个GT198变异体的表达。

[0054] 在一方面，候选药剂将中和一个或多个GT198变异体的作用。用“中和”意指蛋白质的活性被抑制或者抵消，以实质上对细胞没有作用。

[0055] 候选药剂包括大量化学类别，尽管它们通常是有机或无机分子，优选地具有大于100，但是小于约2,500道尔顿分子量的小有机化合物。优选的小分子是小于2000，或小于
1500或小于1000或小于500道尔顿。候选药剂包含对于与蛋白质，特别是氢键结合的结构相互作用所必需的功能团，并且通常包含至少一个胺、羰基、羟基或羧基，优选地至少功能化学团中的两个。候选药剂常常包含被一个或多个上述功能团所取代的环形碳或杂环结构和/或芳香族或聚芳香族结构。在生物分子，包括肽、蛋白质、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或它们的组合中也可以发现候选药剂。

[0056] 候选药剂获自各种广泛的来源，包括合成或天然化合物库。例如，可得到大量的方法用于各种广泛有机化合物和生物分子的随机和直接合成，包括随机寡核苷酸的表达。或者，细菌、真菌、植物和动物的提取物形式的天然化合物库是可以获得的或容易生产候选药剂的来源。另外，通过常规的化学、物理和生物化学方法可以很容易地修饰天然或合成产生的库和化合物。已知的药理学药剂易受直接或随机的化学修饰，诸如酰化、烷基化、酯化、酰胺化以产生结构类似物。

[0057] 在用于改变一个或多个GT198变异体序列的表达图谱的测定法中，添加候选药剂及允许细胞温育一段时间后，向固相支持体添加待要分析的包含GT198变异体序列的样品。如果需要，使用已知的技术制备GT198变异体序列。例如，使用已知的裂解缓冲液、电穿孔等可以处理样品以裂解细胞，同时如本领域技术人员所知到的，如果需要，可进行纯化和/或扩增，诸如PCR。

[0058] 一般的情况下，测定法的组分之一可被标记以提供检测结合复合物的方法。这里用“标记”意指化合物是具有可结合的至少一个元素、同位素或化合物是能够检测的化合物。通常，标记属于三类：a)同位素标记，其可以是放射性的或重同位素；b)免疫标记，其可以是抗体或抗原；和c)染色或荧光染料。标记可以在任何位置掺入GT198变异体核酸、蛋白质和抗体中。例如，标记应该能够直接或间接地产生可检测的信号。可检测的组3 14 32 35 125
成成分可以是放射性同位素，诸如 H、C、P、S或 I，荧光或化学发光化合物，诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素或酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。
可以使用本领域已知的用于缀合抗体和标记的任何方法，包括Hunter et al.，Nature，
144：945(1962)；David et al.，Biochemistry，13：1014(1974)；Pain et al.，J.Immunol.Meth.，40：219(1981)；和Nygren，J.Histochem.and Cytochem.，30：407(1982))所述的方法。标记也可以是酶，诸如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，当给它们提供适合的基质时就会产生可检测的产物。或者，标记可以是标记的化合物或小分子，诸如酶抑制剂，是结合但是不被酶催化或改变。标记也可以是组成成分或化合物，诸如特异性结合抗生蛋白链菌素的附加表位或生物素。对于生物素的例子，如上所述是标记抗生蛋白链菌素，因此提供了结合靶序列的可检测的信号。如本领域所知，分析前移除未结合的抗生蛋白链菌素。

[0059] 如本领域技术人员所知道的，这些测定法可以是直接杂交测定法或者可以包括“夹心测定法”，这包括使用多个探针，如在美国专利号5,681,702、5,597,909、5,545,730、5,594,117、5,591,584、5,571,670、5,580,731、5,571,670、5,591,584、5,624,802、
5,635,352、5,594,118、5,359,100、5,124,246和5,681,697中所通常概述的探针，因此所有这些文献整体地被并入为参考文献。

[0060] 可以使用各种杂交条件，包括高、中和低严格性的条件。测定法通常在严格条件下进行，该严格条件允许仅仅在靶存在的情况下标记探针杂交复合物的形成。通过改变其热力学变量的步骤参数可以控制严格性，该参数包括，但不限于温度、甲酰胺浓度、盐浓度、离液序列高的盐浓度pH，有机溶剂浓度等。为了获得在各种条件下的杂交，可以使用对GT198变异体多核苷酸特异的探针。探针小于约1000个核苷酸长度，优选的是小于500个核苷酸长度。优选的探针是至少约10个核苷酸长度，最优选的至少约20个核苷酸长度。这种探针可以用相应的GT198变异体序列来PCR扩增样品。

[0061] 可以在严格条件下进行杂交。用“严格条件”或“严格杂交条件”意指在该条件下探针将与其靶序列杂交达到比与其它序列可测的更大的程度(例如，背景的至少2倍以上)。严格条件是依赖于序列的，并且在不同环境中不同。通过控制杂交和/或冲洗条件的严格性，以鉴定100％与探针互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调整在严格条件下所允许的序列的一些错配，这样就检测到较低程度的相似性(异源探测)。

[0062] 通常，严格条件将是这样的条件，其中在pH 7.0到8.3，盐浓度小于约1.5M Na离子，通常约0.01到1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)，温度是至少约30℃，对于长探针(例如，大于50个核苷酸)，至少约60℃。通过添加去稳定剂，诸如甲酰胺也可以获得严格条件。示例性低严格条件包括在37℃，和30到35％甲酰胺缓冲液、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)杂交，以及在50到55℃，在1x到2.x标准柠檬酸钠(SSC)(20xSSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中冲洗。示例性中严格性条件包括在37℃，在40到45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，和在55到60℃，在0.5x到1xSSC中冲洗。示例性高严格性条件包括在37℃，在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，和在60到65℃，在0.1xSSC中冲洗。可选择的条件是，冲洗缓冲液可以包含约0.1％到约1％SDS。杂交期间通常不少于约24小时，通常约4到约12小时。

[0063] 这些参数也可以用于控制非特异性结合，如美国专利号5,681,697中所通常概述的。因此，可以期望在较高严格条件下进行一些步骤以减少非特异性结合。

[0064] 如本领域技术人员所知的，可以通过各种方法完成这里所概述的反应。在下面所概述的优选的实施方式中，可以同时地或顺序地或任意顺序地添加反应的组分。此外，反应可以包含测定法中所包含的各种其它试剂。这些试剂包括，如盐、缓冲液、中性蛋白质，例如白蛋白、去污剂等，可以使用它们以有利于最佳的杂交和检测，和/或减少非特异性或背景的相互作用。并且，根据样品制备方法和靶的纯度，可以使用另外改进测定法效率的试剂，诸如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物剂等。此外，可以使用固相或基于溶液(即，动态PCR)的测定法。

[0065] 一旦进行测定，就可分析数据以确定GT198变异体或个体GT198变异体蛋白质的状态之间表达水平及表达水平的变化，形成表达图谱。

[0066] 在一些实施方式中，进行筛选以改变GT198变异体的表达产物的生物学功能。而且，如下面所充分地概述，可以进行鉴定特定状态中变异体的重要性，筛选结合和/或调节变异体生物学活性的药剂。

[0067] 在一些实施方式中，设计筛选并首先发现可以结合GT198变异体蛋白质或核酸的候选药剂，然后这些药剂可以用于在评估候选药剂调节GT198变异体活性和癌症表型能力的测定法中。如本领域技术人员所知，可以进行的大量不同的测定法；结合测定法和活性测定法。

[0068] 在一些实施方式中，进行结合测定法。通常，使用纯化的或分离的GT198变异体蛋白质或核酸。方法包括结合GT198蛋白质或核酸与候选生物活性药剂，并且确定候选药剂与GT198变异体蛋白质或核酸的结合。通常，GT198变异体蛋白质或核酸或候选药剂非扩散地结合到有分离的样品的固相支持体(例如，微量滴定板和阵列等)。微量滴定板和阵列特别方便，因为使用小量的试剂和样品可以同时进行大量的阵列。只要组合物与试剂相适合，维持组合物的活性并且是不可扩散的，这样组合物特定的结合方式就不是至关重要的了。优选的结合方法包括抗体(当蛋白质结合支持体时，抗体空间上不阻断配体结合位点或激活序列)，直接结合“粘性”的或离子的支持体，化学交联，表面蛋白质或试剂的结合都可应用。蛋白质或试剂结合后，通过冲洗移除过多未结合的材料。通过与牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或其它无害的蛋白质或其它组成成分温育可以阻断样品非特异结合。

[0069] 在一些实施方式中，GT198变异体蛋白质或核酸可以结合到支持体上，并且向测定中添加候选的生物活性剂。或者，用候选剂结合的支持体，并且添加GT198变异体蛋白质或核酸。新结合的候选剂包括特异性抗体、在化学库筛选中鉴定的非天然结合剂，肽类似物、适体等。一个特殊的目的是筛选测定对人类细胞具有低毒性的药剂。广泛不同种类的测定法可以用于该目的，包括标记的体外蛋白质-蛋白质结合测定法，电泳迁移率变动分析，蛋白质结合的免疫测定法，功能性测定法(磷酸化测定法等)等等。

[0070] 可以通过大量方法进行对候选生物活性剂与GT198变异体蛋白质或核酸结合的确定。在优选的实施方式中，标记候选生物活性剂，并且直接地测定结合。例如，这可以通过连接所有或部分的GT198变异体蛋白质或核酸于固相支持体上，添加标记的候选药剂(例如，荧光标记)，冲洗掉多余的试剂，并且确定标记是否存在于固相支持体上来完成。可以利用本领域所已知的各种阻断和冲洗步骤。

[0071] 在一些实施方式中，只标记组分之一。例如，可以使用125I或用荧光团在酪氨酸位置标记蛋白质(或蛋白质性质的候选药剂)。或者，用不同的标记可以标记一个以上的组125
分；例如，蛋白质使用 I，候选药剂使用荧光团。

[0072] 在一些实施方式中，通过使用竞争性结合测定法确定候选生物活性剂的结合。在该实施方式中，竞争剂是已知的结合GT198变异体蛋白质或核酸的结合组成成分，诸如抗体、肽、结合配偶体、配体等。在一些条件下，如生物活性剂和结合组成成分之间可以存在竞争性结合，其中结合组成成分置换生物活性剂。

[0073] 在一些实施方式中，可标记候选生物活性剂。如果存在候选生物活性剂或竞争剂或者两者，首先将其添加到蛋白质中给与一段充足的时间以允许结合。在有利于最佳活性的任何温度，通常4和40℃之间可以进行温育。选择温育期间为最佳活性，但是也可以优化温育时间以利于快速高通量筛选。通常0.1到1小时之间将是充足的。通常移除或洗掉过量的试剂。然后添加第二种成分，接着是用标记成分的存在或不存在以表示是否结合。

[0074] 在一些实施方式中，首先添加竞争剂，接着是候选生物活性剂。竞争剂置换的是候选生物活性剂结合的GT198变异体蛋白质或核酸，因此是能够既结合又和潜在地调节GT198变异体蛋白质或核酸的活性指标。在该实施方式中，可以标记两者中任一成分。因此，例如，如果标记竞争剂，冲洗液中标记的存在则表明该试剂的置换。或者，如果用标记候选生物活性剂，支持体上标记的存在表示置换。

[0075] 在其它实施方式中，首先添加候选生物活性剂，同时温育和冲洗，接着添加竞争剂。不存在竞争剂的结合可以表示生物活性剂以高度亲和性结合了GT198变异体蛋白质或核酸。因此，如果标记候选生物活性剂，那么没有偶联竞争剂结合的支持体上存在标记则可以表示候选剂能够结合GT198变异体蛋白质或核酸。

[0076] 在一些实施方式中，方法包括差异筛选以鉴定能够调节GT198变异体蛋白质或核酸的活性的生物活性剂。在该实施方式中，方法包括在第一样品中让GT198变异体蛋白质或核酸与竞争剂结合。第二样品包含候选生物活性剂，作为GT198变异体蛋白质或核酸的竞争剂。确定两个样品的竞争剂的结合，两个样品之间结合的变化或差异表示能够结合GT198变异体蛋白质或核酸及潜在地调节其活性的药剂的存在。也就是，如果竞争剂的结合在第一种样品和第二种样品中不同，药剂就能够结合GT198变异体蛋白质或核酸。

[0077] 在一些实施方式中，提供了筛选能够调节细胞中GT198变异体蛋白质或核酸的活性的生物活性剂的方法。该方法包括向具有GT198变异体蛋白质或核酸的细胞添加如上所限定的候选生物活性剂。通常，使用具有一个或多个GT198变异体扩增子的细胞。培养细胞的方法和测定细胞分散、粘着和迁移的方法如Russell et al.，J.Cell Sci.，116：3543-3556(2003)中所述，这篇文献的整体内容在这里并入为参考文献。

[0078] 在测定中可以使用阳性对照和阴性对照。优选的方法是，以至少3次重复进行所有对照和实验样品以获得统计学上显著性的结果。所有样品的温育都进行充足时间的药剂和蛋白质的结合。温育后，冲洗所有的样品直到没有非特异性结合为止，测定结合，通常是测标记药剂的量。例如，如果使用放射性标记，可以在闪烁计数仪中计数样品以确定结合化合物的量。

[0079] 各种其它试剂可以包含在筛选测定法中。这些包括试剂，如盐、中性蛋白质，例如白蛋白、去污剂等，可以使用它们以有利于最佳的蛋白-蛋白结合，和/或减少非特异性或背景相互作用。也可以使用另外地改进测定法效率的试剂，诸如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物剂等。可以按照提供所需结合的任何顺序添加混合组分。

[0080] 在一方面，可用以下情况评估测定法。如用生理学信号，例如激素、抗体、肽、抗原、细胞因子、生长因子、动作电位，药理学试剂，包括化学疗法、辐射、致癌法或其它细胞(即，细胞-细胞接触)存在或不存在，以前或随后出现的情况下来评估测定法。在另一个例子中，在细胞周期过程的不同阶段进行测定。

[0081] III.药物制造和治疗方法

[0082] A.药物制造法

[0083] 另一个实施方式是使用药物，其包含GT198变异体蛋白质或核酸的一种或多种拮抗剂。这里用“药理学活性”意指化合物能够抑制或干扰GT198变异体蛋白质或核酸的活性。具有期望的药理学活性的化合物可以在生理学可接受的载体中向受试者或患者给药。“受试者”或“患者”包括人类和其它动物，特别是哺乳动物和家畜。因此，该方法可以应用于人类治疗和兽医应用。

[0084] 在一些实施方式中，生物活性剂包括识别GT198变异体蛋白质及已被证明抑制或调节GT198变异体蛋白质活性或生物可利用性的抗体。在其它实施方式中，生物活性剂包括抗GT198内含子1序列gtaacggcgc cgtgggcgcg gggaagaccc gggagggcag tgggtgagga ggtcggttga gtggccccct cccctgcctt tctctccgta g(SEQ ID NO.4)的反义或siRNA组合物。如本领域所公知的，这些药剂可以直接地被递送或在药物组合物中一起与适合的载体或赋形剂被递送。目前的治疗方法包括给需要治疗的患者提供抑制GT198变异体表达活性的有效量化合物。

[0085] 通过常规实验，可以容易地确定这种药剂的有效量，也可以确定最有效和方便的给药途径和最适合的剂型。各种剂型和药物递送系统是本领域可以得到的。

[0086] 适合的给药途径可以有，例如包括口服、直肠、经粘膜、经皮、鼻子或肠内给药以及非肠道的递送，包括肌内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。药剂或其组合物可以以局部而不是系统方式进行给药。例如，适合的药剂可以通过注射递送或在靶向药物递送系统中递送，诸如储存或缓释剂。

[0087] 可以通过本领域公知的任何方法制造药物组合物，诸如通过常规的混合、溶解、成粒、制糖锭剂、研磨、乳化、胶囊化、包载或冻干方法。组合物可以包含一种或多种生理学上可接受的载体，诸如有利于活性分子加工成药物用途的制剂的赋形剂和辅剂。合适的剂型取决于所选择的给药途径。

[0088] 例如，对于注射，组合物可以制成水溶液，优选地在生理学相容缓冲液，诸如Hanks液、Ringer液或生理盐缓冲液中制成。对于经粘膜或鼻给药，在剂型中使用适合渗透屏障的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域已知的。对于口服给药，通过联合活性剂和本领域公知的药物学上可接受的载体可以容易地制造药剂。这种载体能够使本发明的药剂被制成用于受试者口服消化的片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等。药剂也可以制成直肠组合物，诸如栓剂或保留灌肠剂，例如包含常规栓剂基质，诸如可可油或其它甘油酯。

[0089] 用于口服用途的药物制备可以从固体赋形剂开始获得，如果需要，添加适合的辅剂后，可选地研磨所得到的混合物，加工颗粒混合物，以获得片剂或糖锭剂核芯。特别地，适合的赋形剂是填料，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂诸如，例如玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果期望，可以添加崩解剂，诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐诸如藻酸钠。

[0090] 糖锭剂核芯提供有合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖锭剂包衣添加染料或颜料用于鉴定或用于表征不同活性剂量的组合。

[0091] 用于口服给药的药物制备包括由明胶制成的推入配合胶囊以及由明胶和增塑剂，诸如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。推入配合胶囊可以含有混合填料，诸如乳糖，粘结剂，诸如淀粉，和/或润滑剂，诸如滑石或硬脂酸镁，以及可选则的稳定剂的活性组分。在软胶囊中，活性剂可以溶解或悬浮在适合的液体，诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可以添加稳定剂。用于口服给药的所有的剂型应该是适合于这种给药的剂量。

[0092] 对于吸入给药，利用适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或任何其它适合的气体，药剂可以方便地以来自于加压容器或喷雾器的气溶胶喷雾呈现的形式被递送。在加压的气溶胶情况下，通过提供阀门以递送所计量的量，可以确定合适的剂量单位。可以配制在吸入器和吹入器中所使用的胶囊和弹药。这些通常含有药剂和适合的粉末基质，诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。

[0093] 例如在安瓿瓶或多剂量容器中带有添加防腐剂的形式可以制备药剂用于注射，例如通过单次快速静脉注射或持续静脉点滴的非肠道给药的药物。药物可以呈现如油或水载体中悬浮液、溶液或乳液形式，并且可以包含辅剂诸如悬浮、稳定和/或分散剂。用于非肠道给药的剂型包含给药的化合物或药剂的水溶液，包括水溶形式。

[0094] 活性剂的悬浮液也可以制备为适合的油注射悬浮液。适合的亲脂溶剂或载体包括脂肪油，诸如芝麻油和合成的脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯或脂质体。水注射悬浮液可以包含增加悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。或者，悬浮液也可以包含适合的稳定剂或增加药剂溶解性的试剂，以允许高浓度溶液的制备。再或者，活性组分可以是粉末形式，用于适合的载体，例如用灭菌无热原的水在使用前组合。

[0095] 如上所述，药物也可以配制成储存形式。只要起作用的组分可以通过灌输(例如，皮下或皮内地)或通过肌内注射给药。因此，例如，可以用适合的聚合或疏水材料或离子交换树脂制备本药剂(例如，作为可接受油中乳剂)，或者本药剂制备为少量可溶的衍生物，例如制备为少量可溶的盐。

[0096] 用于本发明疏水分子的适合载体是本领域所公知的，并且包括共溶剂系统，其包含例如，苯甲醇、非极性表面活性剂、水可混的有机聚合物和水相。共溶系统可以是VPD共溶系统。VPD是3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨醇酯80和65％w/v聚乙二醇300、和用无水乙醇补足体积。VPD共溶系统(VPD:5W)由1∶1稀释的VPD和5％葡萄糖水溶液组成。该共溶系统有效地溶解疏水试剂，并且产生对系统给药的低毒性。自然，共溶系统的比例可以相当大地变化，而不会破坏它的溶解度和毒性特征。而且，共溶系统组分的同一性可以变化。例如，其它低毒性非极性表面活性剂可以用于代替聚山梨醇酯80，聚乙二醇的级分大小可以改变，其它生物相容的聚合物可以取代聚乙二醇，例如，聚乙烯吡咯烷酮，并且其它的糖或多糖可以取代葡萄糖。

[0097] 可以使用用于疏水分子的其它递送系统。脂质体和乳剂是公知的用于疏水药物的递送工具或载体的例子。脂质体递送系统是如上面基因递送系统上下文中所讨论的。也可以使用一些有机溶剂，诸如二甲基亚砜，尽管通常以更大的毒性为代价。此外，使用缓释系统，诸如含有有效量的待给药组合物的固体疏水聚合物的半渗透基质可以递送药剂。构建各种缓释的材料，并且这种材料是本领域技术人员可以得到的。缓释胶囊可以根据其化学性质释放药剂几周到100天以上。根据治疗试剂的化学性质和生物稳定性，可以使用其他蛋白质稳定化的策略。

[0098] 对于这里所使用的任何药物，可以使用本领域公知的各种技术来首先评估治疗的有效剂量。例如，在细胞培养测定中，可以在动物模型中配制剂量以获得包括如细胞培养中所确定的IC50的循环浓度的范围。在期望抑制GT198或GT198变异体活性的情况下，可以确定获得GT198或GT198变异体活性半最大抑制的实验药剂浓度。使用获自细胞培养测定和其它动物研究的数据，可以确定适于人类受试者的剂量范围。

[0099] 药剂的治疗有效剂量指的是引起受试者中症状改善或存活延长的药剂的量。通过细胞培养或实验动物中标准的药物学方法，例如通过确定LD50(致死种群中50％的剂量)和ED50(种群中50％治疗有效的剂量)可以确定这种分子的毒性和治疗效力。毒性对治疗效果的剂量比率是治疗指数，其可以表示为比率LD50/ED50。显示高治疗指数的药剂是优选的。

[0100] 优选剂量是在循环浓度的范围内没有毒性或很小毒性的ED50。根据所使用的剂量形式和所用的给药途径，剂量可以在该范围内变化。鉴于受试者条件的特异性，应该根据本领域已知的方法选择精确的剂型、给药途径和剂量。

[0101] 可以个体地调整剂量和间隔以提供如所期望的足以影响GT198或GT198变异体的表达或活性的活性组成成分的血浆水平或组织水平，即，最小有效浓度(MEC)。MEC将随着每个药剂而变化，但是可以由例如，体外数据，诸如使用这里所述的测定法获得GT198或GT198变异体活性50-90％抑制必需的浓度来评估。获得MEC所必需的剂量将依赖于给药的个体特征和途径。应该使用治疗方案给药药剂或其组合物，该治疗方案将维持血浆水平在MEC以上约10-90％的治疗期间，优选地约30-90％的治疗期间，最优选地50-90％之间。在局部给药或选择性摄入的情况下，药物的有效局部浓度可以与血浆浓度不相关。

[0102] 所给药的药剂或组合物的量将当然地依赖于各种因素，包括待要治疗的受试者的性别、年龄和体重，病痛的严重性，给药方式以及处方医师的判断。

[0103] 如果期望，本组合物可以呈现包含一个或多个单位剂量形式的包装或分配器装置，该单位剂量形式包含活性组分。这种包装或装置可以，例如包括金属或塑料箔，诸如起泡包装。包装或分配器装置可以伴有用药说明书。也可以制备包含在相容性药物学载体中所配制的本发明药剂的组合物，将该组合物放置在合适的容器中，贴上用于标明条件下治疗的标签。标签上标明的适合条件可以包括障碍或疾病，诸如乳腺癌和卵巢癌或其它癌症的治疗，以及与GT198的改变表达相关的条件。

[0104] B.治疗的方法

[0105] 一个实施方式是通过给有效量的药并对编码GT198变异体蛋白质的核酸特异的抑制性核酸，以缓解与癌症相关的一种或多种症状来治疗癌症症状的方法。抑制性核酸可以是反义DNA或siRNA。与癌症相关的症状包括肿瘤尺寸大小和细胞增殖速度。可以治疗的代表性癌症包括，但不限于卵巢癌、子宫癌，前列腺癌和乳腺癌。抑制性核酸可以是上面所公开的一种或多种组合物。

[0106] 所公开的GT198或GT198变异体拮抗剂组合物可以向所需的受试者单独给药，或者联合一种或多种另外的治疗剂，或者联合至少两种不同的GT198拮抗剂给药。代表性的GT198或GT198变异体拮抗剂包括，但不限于抑制性核酸，诸如siRNA或反义DNA，以及其拮抗抗体或抗原结合部分。另外的治疗药剂基于待要治疗的健康状况、障碍或疾病来选择。例如，GT198拮抗剂可以与具有抑制GT198生物学功能或生物可利用性功能的一种或多种另外的药剂共给药。

[0107] GT198拮抗剂也可以联合一种或多种另外的治疗剂。代表性的治疗剂包括，但不限于化疗剂和预凋亡剂。代表性的化疗剂包括，但不限于安吖啶、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、门冬酰胺酶、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、甲酰四氢叶酸、多柔比星脂质体、柔红霉素脂质体、洛莫司汀、美法仑、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、喷司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、沙铂、链佐星、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、替尼泊苷、塞替派、硫鸟嘌呤、托泊替康、曲奥舒凡、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨或它们的组合。代表性预凋亡剂包括，但不限于氟达拉滨牛磺孢子素(fludarabinetaurosporine)、环己酰亚胺、放线菌素D、乳糖基酰基鞘氨醇、15d-PGJ(2)和它们的组合。

[0108] IV.试剂盒

[0109] 这里也提供了制作带有盛装探针的容器的试剂盒的方法，该探针特异地结合GT198或GT198变异体蛋白质或核酸。试剂盒可用于检测表示癌症的GT198中突变的存在。在一个实施方式中，探针是对GT198或GT198变异体蛋白质特异的抗体。抗体可以是单克隆、多克隆、单链、人源化和嵌合的或者其抗原结合部分。在另一个实施方式中，探针是特异地结合编码GT198或其变异体的核酸的核酸探针，优选地至少10个核苷酸长度。试剂盒可选地包括用于检测癌症的一种或多种生物标记的探针。可以与GT198标记联合在癌症中优先使用的生物标记包括BRCA1和BRCA2中突变。因此，特异地与BRCA1和BRCA2中突变杂交的核酸探针可以包括在试剂盒中。用于检测杂交的试剂，诸如缓冲液和材料也可以包括在试剂盒中。

[0110] 除非另外地限定，这里所用的所有科技和科学术语都具有与所公开的发明所属领域技术人员所通常理解的含义相同的含义。这里所引用的文献和引用它们的材料特别地并入为参考文献。

[0111] 本领域技术人员将能够识别并能够确定使用这些不超过常规的实验，这里所述的本发明特定的实施方式也是如此。这种等同意欲也包含在后面的权利要求书中。

[0112] 实施例

[0113] 方法和材料

[0114] GT198变异体的克隆

[0115] 最初用RT-PCR，接着用测序分析首次检测出组织中人GT198剪接变异体的存在。通过5’RACE(Invitrogen)方法获得了含有与野生型相似的含长5’末端的全长GT198-1到-4变异体cDNAs。从人BG01细胞和小鼠P19干细胞分别地检测出人和小鼠GT198a变异体cDNAs，两者都保留有内含子1。进而使用内含子1引物的5’RACE揭示了在人和小鼠序列中相同核苷酸位置上存在另一转录起始位点含短5’末端，几乎与它们的起始密码子紧邻。使用内含子1特异性引物在组织中又鉴定出了人GT198a-4。P19干细胞的表达模式分析则依赖于野生型GT198的5’特异性引物和变异体GT198a特异的内含子1引物。鉴定的cDNA序列已经存入并且在GenBank中发布，登录号如下：hGT198，FJ952179；hGT198-1，FJ952180；hGT198-2，FJ952181；hGT198-3，FJ952182；hGT198-4，FJ952183；hGT198a，GQ851964；hGT198a-4，GQ851965；mGT198，FJ937966；和mGT198a，FJ937967。

[0116] RT-PCR和定量PCR分析

[0117] 使用来自于多个正常人组织和癌细胞系的第一条链cDNAs分析了内源GT198和其TM变异体(MTC panels，Clontech)。在干细胞中，使用Trizol试剂(Invitrogen)分离每个分化阶段的总RNA，用DNase I处理，使用SuperScriptIII(Invitrogen)反转录成cDNA，并在RT-PCR前标准化它们的浓度用以RT-PCR分析。定量PCR分析使用SYBR绿色染料一式二份重复在25μl反应中进行实时PCR(iCycler，BioRad)。结果用GAPDH来校准。

[0118] 干细胞分化

[0119] 以前我们的报道描述过来自于小鼠胚胎干(ES)细胞或胚胎癌(EC)P19细胞的胚胎体形成方法Brooks，Y.S.，et al.，J Biol Chem，284：18033-46(2009)。简而言之，用500nM全反式视黄酸诱导未分化的P19细胞(EC)分化4天，以形成胚胎体(EB2-4)。在P19分化的每个阶段都分离总RNA进行RT-PCR分析。鼠ES细胞生长在γ-辐射的饲养成纤维细胞上，并且通过除去血清分化成胚胎体。石蜡包埋ES来源的胚胎体以进行免疫组织化学分析。

[0120] 荧光素酶测定法

[0121] 在补加有2.5％胎儿牛血清和7.5％小牛血清的α-MEM中维持P19细胞。在24孔板中培养细胞，并且使用带有MMTV荧光素酶报道基因(100ng)、糖皮质激素受体(10ng)的脂质转染胺试剂2000(Invitrogen)和各种量的GT198表达质粒一式三份转染细胞。细胞与配体地塞米松(100nM)温育在收获前诱导MMTV荧光素酶报道基因16小时。通过Dynex发光计测量相对的荧光素酶活性。数据表示为三次转染的平均数±标准误差。

[0122] 免疫组织化学和免疫荧光

[0123] 先前从兔子制备了多克隆抗GT198的抗体(Covance)(Ko，L.，et al.，Mol Cell Biol，22：357-69(2002)。重组GT198蛋白或其作为抗原的部分蛋白片段与亲和胶10树脂(Bio-Rad)交联进行亲和纯化。样品为石蜡包埋的阵列形式的肿瘤组织来自于Imgenex和US Biomax，Inc.。免疫组化法利用生物素酰化的抗兔IgG F(ab)2二抗，接着通过检测试剂(DAKO)来检测抗体结合。并且切片用苏木精复染色。免疫荧光法使用兔抗GT198抗体和鼠抗Flag抗体(Sigma)进行免疫荧光双染色。以1∶200的稀释度应用Cy3-和FITC-缀合的二抗(Jackson Immuno-Research Laboratory Inc.)。GFP-Rad51质粒含有pEGFP-C3载体(Clontech)和小鼠全长Rad51基因。对于TUNEL细胞调亡的测定，是在使用原位细胞调亡检测试剂盒(Roche)的TUNEL测定前，进行免疫荧光抗体结合。

[0124] Western印迹分析

[0125] 使用来自于过表达的293细胞或来自于内源P19干细胞的整个细胞裂解液，通过Western印迹分析检测内源或过表达的GT198和其剪接变异体蛋白。使用抗Flag M2琼脂糖小球(Sigma)与1∶10稀释的来自于转染细胞的细胞提取物在结合缓冲液中温育，进行免疫沉淀。冲洗沉淀物，和使用抗GT198抗体对该沉淀物进行Western印迹分析。用1∶200稀释度的抗GT198探测印迹，并且用ECL系统(Amersham Pharmacia)进行检测。

[0126] 原位杂交的整装制片

[0127] E8.5、E9.5和E10.5时间的小鼠胚胎，在4℃，在带有0.1％吐温的PBS中4％低聚甲醛中固定过夜，通过在25％、50％、75％和100％的系列甲醇脱水。在与变性的核糖探针杂交前，用无RNase的DNase I(50U/ml)处理脱水的胚胎。在地高辛配基-UTP(Roche Diagnostics)存在的情况下，使用pcDNA3载体中全长GT198 cDNA，通过体外转录产生反义和有义核糖探针。固定染色的胚胎，并且对其进行制片。

[0128] 受试者和材料

[0129] 从来源于家族乳腺癌患者的EB病毒(EBV)无限增殖化的B淋巴母细胞系分离基因组DNA或RNA。这些患者在40岁之前被诊断为患乳腺癌，并且不携带有BRCA1和BRCA2的突变。同时可得到从患者全血分离的基因组DNA，用于确认细胞系中鉴定的突变。使用患者样品前以经根据大学机构的准则获得了个体患者的知情同意。

[0130] Southern印迹分析

[0131] 从乳腺癌患者的B淋巴母细胞系分离的基因组DNA(10ug)，用限制酶Pst I过32
夜消化，通过1％琼脂糖凝胶分离，转移到正电荷的尼龙膜上，用随机引物 P标记的探针(Stratagene)来探测。由外显子1-3探针所探测的印迹尼龙膜被洗净后，用外显子4-5探针重新探测分别取得结果。两种探针都包含如图4a中所示的小内含子。

[0132] 实施例1：GT198和BRCA2中BRC重复之间的蛋白质序列同源性

[0133] GT198由亮氨酸拉链连接的N末端功能区和C末端DNA结合功能区(DBD)。由于存在下面所述的GT198、BRCA1和BRCA2之间功能的相似性，我们使用ClustalW蛋白质同源性分析软件进行BRCA1、BRCA2和GT198的多序列对齐，鉴定出GT198的C末端DBD与BRCA2中BRC重复序列同源(图1)。特别是，GT198的C末端区域与BRCA2中第三、第四BRC重复对齐同源性很高。这三个序列同源解释了它们与Rad51结合的活性同时也对GT198中存在潜在的BRC重复提供了功能性支持。GT198的N末端只显示了与BRC重复有限的同源性。它们序列同源性的功能性含义是GT198可以与BRCA2通过如图1c中所示的BRC重复区域竞争结合Rad51从而显示GT198与已知乳腺癌基因功能上相关。

[0134] 实施例2：GT198与BRCA1和BRCA2共表达

[0135] GT198的内源核表达模式与小鼠中BRCA1和BRCA2表达极其相似或几乎没有区别(Chodosh，L.A.，J Mammary Gland Biol Neoplasia，3：389-402(1998))。在来源于胚胎干细胞的胚胎体的第4天，原始外胚层中GT198蛋白质表达增加。与以前的Northern印迹分析一致(Ko，L.，et al.，Mol Cell Biol，22：357-69(2002))，原位杂交显示在来自于E8.5到E10.5的神经管中GT198 mRNA表达的增加(未示出数据)。在所有三个胚层中在E12.5表达出现了峰值，并且在E18.5中表达下调。在成年鼠类中，通过Western印迹分析分析，GT198蛋白质主要在睾丸中被发现，在胸腺、脾脏和卵巢中限制性表达(Ko，L.，et al，.Mol Cell Biol，22：357-69(2002))。与BRCA1类似，也可以在不同组织中检测GT198 mRNA表达。在细胞水平，GT198蛋白质在睾丸的精母细胞和卵巢的卵母细胞表达，这与它在睾丸和卵巢中基本功能一致，因为雄性和雌性GT198敲除鼠都是不育的(Petukhova，G.V.，et al.，Dev Cell，5：927-36(2003))。在卵巢中，GT198在次级和Graafian卵泡的粒层细胞中，而不是在原始卵泡或黄体中高水平核表达。泡膜细胞具有低水平的核表达。该模式与循环的类固醇激素作用潜在地相关联，因为GT198与类固醇受体相互作用，并且刺激受体介导的基因调节(Ko，L.，et al，.Mol Cell Biol，22：357-69(2002))。GT198、BRCA1和BRCA2表达之间极其相似的模式(Lane，T.F.，et al.，Genes Dev，9：2712-22(1995)；Sharan，S.K.&Bradley，A.，Genomics，40：234-41(1997)；Durocher，F.，et al.，J Histochem Cytochem，45：
1173-88(1997)；Blackshear，P.E.，et al.，Oncogene，16：61-8(1998))，表明它们在相同的发育途径中可以具有密切的功能性关系。

[0136] 实施例3：可变剪接的GT198变异体抑制野生型GT198

[0137] 在人GT198 mRNA表达的RT-PCR分析期间，鉴定了大量的GT198可变剪接变异体。GT198的可变剪接是组织特异的，在胚胎组织中或在癌细胞中比在正常成人组织中发现了更多种类的剪接变异体。测序结果表明所有可变剪接事件均严格地出现在GT-AG共有位点，其中一些GT-AG共有位点被NCBI EST证据所支持。有趣的是，可变剪接的变化总是出现在基因5’的一半个基因处，并且都产生翻译提前终止的提前终止密码子(图2a)。所有变异体转录物都包含开放编码读框，该开放读框编码带有BRC重复同源性的DBD(氨基酸
126-217)。一些变异体也含有编码N末端。这些截短形式的潜在蛋白质在氨基酸89-117没有亮氨酸拉链(Ko，L.，et al.，Mol Cell Biol，22：357-69(2002))，因此不会形成与野生型相似的二聚体。此外，通过5’RACE已经鉴定了在5’第一外显子不同的两种可变转录起始位点。5’末端的较长转录物编码野生型及命名为GT198 1-4的变异体。5’末端的较短转录物总是保留第一内含子，并且编码命名为GT198a和GT198a-4的变异体。在人和小鼠中均存在双转录起始位点表明野生型和变异体的启动子的差异使用。值得注意地是，也已知人BRCA1具有相似的双转录起始位点(hodosh，L.A.，J Mammary Gland Biol Neoplasia，3：
389-402(1998))，由于它们较大的尺寸，BRCA1双转录起始位点与每个变异体的连锁还没有被研究。

[0138] 然后，我们研究了干细胞分化系统中GT198可变剪接的功能重要性。在人和小鼠干细胞中，具有内含子1保留的变异体GT198a鉴定为主要变异体形式。在视黄酸诱导的小鼠P19干细胞分化期间，通过RT-PCR检测了明显减少的GT198a和增加的野生型GT198 mRNA，并且通过定量进行了验证(图2d-e)。同时，我们发现BRCA1和其变异体BRCA1Δ11b具有与GT198和GT198a相似的递增和递减转换表达模式(图2b-c)，这与以前报道的小鼠胚胎中BRCA1的Northern印迹分析一致(Hakem，R.et al.，Cell，85：1009-23(1996))。数据表明在胚胎体形成期间，调节两个基因中的双启动子来差异地表达野生型和变异型。通过使用通用引物同时检测两者所推断，变异型GT198a mRNA比野生型GT198 mRNA更多。然而，在蛋白质水平，当使用GT198蛋白质片段作为对照，通过Western印迹检测时，GT198a或GT198-4变异体只产生少量的变异体蛋白质。甚至当存在丰富的变异体mRNA时，当在293细胞中过表达时，只通过免疫沉淀或通过免疫荧光染色可以检测到仅痕量的对应于带有BRC重复同源性的GT198 DBD的变异体蛋白质，这可能是由于转染细胞的细胞调亡。因此，通过免疫组织化学染色在正常组织中所检测到的核蛋白质应该主要是野生型GT198蛋白质。令人惊奇地，当使用小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子-荧光素酶报道基因系统，检测P19干细胞中转录活性时，变异体GT198a和GT198-4显示了极强的转录刺激，而野生型GT198反而抑制MMTV启动子的转录活性(图3a-b)。带有BRC重复同源性的DBD和防止GT198二聚化的亮氨酸拉链缺失突变体也都显示了转录刺激活性。N末端没有显著的活性。与GT198活性需要DBD的报道一致(Enomoto，R.et al.，J Biol Chem，279：35263-72(2004))，数据表明由所有变异体mRNA编码的带有BRC重复同源性的GT198 DBD与野生型GT198竞争，并且抵消野生型的活性。尽管需要进一步阐明详细的机理，GT198剪接变异体可以用作天然显性失活来拮抗是可信的。除了在蛋白质水平的竞争，变异体通过可变剪接mRNA的竞争表达或通过已知的下游的RNA干扰，可以阻止野生型mRNA表达。重要的是，对于BRCA1或BRCA2，如果可以透彻地研究它们的抑制性变异体，它们很可能存在相似的调节。因此，通过潜在的多个机理，GT198的可变剪接变异体可抑制野生型。

[0139] 实施例4：GT198剪接变异体的过表达阻断Rad51聚集灶形成，诱导野生型GT198的细胞调亡和促进其胞浆转位

[0140] γ-电离辐射后，可检测GT198变异体对Rad51聚集灶形成的作用。用GFP标记的Rad51和用Flag标记的编码GT198、或变异体GT198a、GT198-4、或N末端结构域、或带有BRC重复同源性的DBD或亮氨酸拉链缺失突变体的构建体共转染HeLa细胞。通过免疫荧光染色分析前，γ-辐射细胞以诱导Rad51聚集灶。与未转染的对照比较，GT198或N末端中没有一个扰乱Rad51聚集灶，而带有BRC重复同源性的所有编码DBD的蛋白质，包括两个GT198变异体都阻断了聚集灶形成。聚集灶扰乱引起Rad51不仅在核中均匀表达，并且也扩散到胞质中因而丧失功能。有趣的是，尽管野生型GT198是专门地在细胞核内表达，但是所有它的片段、突变体或变异体都成为胞浆表达。这是因为变异体们不能二聚化而二聚化对于它们的亚细胞表达分布是重要的，并且GT198二聚体参与Rad51相关的结合功能(Pezza，R.J.，et al.，Genes Dev，21：1758-66(2007))。大量转染细胞的详细检查表明具有扰乱Rad51聚集灶的细胞也具有带皱缩的核的改变的形态学。TUNEL测定证实含DBD的单体蛋白质包含剪接变异体诱导的明显的细胞调亡，伴随着DNA片段化，表明野生型GT198是培养中细胞存活必需的。N末端表明胞质表达没有细胞调亡的诱导或Rad51聚集灶的扰乱，可能因为GT198必需的功能单元需要其带有BRC重复同源性的DBD。这些数据表明BRC重复区域竞争或阻断野生型GT198的正常活性。野生型功能的损失触发了细胞调亡。这个结论与上述的转录研究一致，并且也与报道的GT198的DBD所需的DNA结合活性一致(Enomoto，R.et al.，J Biol Chem，279：35263-72(2004))。通过使用抗N或C末端的非重叠抗体，检查变异体过表达以确定是否影响内源野生型GT198表达。结果揭示内源GT198的表达随细胞周期循环改变。正如已知的BRCA1随细胞周期循环改变被调节一样。当用C末端标记的变异体分析抗GT198 N末端的抗体时，在变异体活性的诱导下，内源GT198变成胞浆表达。使用抗GT198 C末端的抗体也观察到了胞浆表达。总之，GT198剪接变异体的过表达促进野生型GT198胞浆转位而抑制野生型，损害Rad51聚集灶的正常形成而抑制修复路径，并且如很多癌基因一样诱导细胞调亡。

[0141] 实施例5：人乳腺癌和卵巢癌及小鼠肿瘤模型中GT198变异体的细胞浆过表达[0142] BRCA1是肿瘤抑制基因，并且它的功能缺失易患乳腺癌，卵巢癌和女性生殖系统癌。以前报道过高百分比的病例中乳腺癌中胞浆BRCA1过表达(Al-Mulla，F.，et al.，J Histochem Cytochem，53：621-9(2005))，表明增加的变异体和野生型缺陷之间的联系。实际上，许多鉴定的BRCA1突变改变了其剪接。这一现象在最初促进了原发乳腺癌和卵巢癌中GT198表达的免疫组织化学的分析。使用抗全长GT198的抗体，在组织测定中，我们用正常对照筛了选238名卵巢子宫癌病例和114名乳腺癌病例。在卵巢子宫癌病例中，在13.4％基质细胞和29.8％上皮细胞中发现了GT198的胞浆表达(表1)。正常的人类成人卵巢没有胞浆GT198，染色表明胞浆表达与癌症有关。除了良性的纤维瘤和纤维泡膜细胞瘤外，大多数卵巢癌没有显示GT198的核染色(未示出)。在卵巢子宫癌的大多数上皮亚型，包括浆液性的、粘液性的、子宫内膜的、透明细胞的癌中以及在粒泡膜细胞癌中发现了特异的基质细胞中特征性高水平胞浆表达。在卵巢癌中也可以检测到GT198变异体mRNA，并且抗GT198的N和C末端的抗体可以识别胞浆蛋白质，表明在肿瘤中存在变异体表达或野生型胞浆转位。在一个病例中，在早期，GT198阳性细胞位于围绕着卵泡的泡膜细胞区域中，而卵泡继续变长，破裂成索状结构。当检查大量病例时，看到在癌症发展的较晚期，所积累的粒层细胞经历了上皮转换以演变成上皮类型。GT198阳性细胞最常在上皮细胞下发现，并且在较晚期，当肿瘤块变得明显时，它们被挤压在基质区的通道里。GT198阳性细胞不存在于起源于其它组织位点的转移肿瘤中，表明卵巢癌发育中GT198的特异性参与(表1)。还不知道是否这些GT198阳性基质细胞与泡膜细胞有关。然而，在发育的癌症组织中它们的分布模式暗示来自于每个上皮亚型的这些阳性细胞可能具有相同的来源。支持这一发现的是，相当多的证据以前已经证明卵巢表面上皮，也称作胚上皮和卵泡共有相同的来源，并且卵子发生出现在卵巢表面上皮中(Nishida，T.& Nishida，N.，Reprod Biol Endocrinol，4：42(2006)；Bukovsky，A.，et al.，Endocrine，26：301-16(2005))。利用GT198作为标记的观察资料与激素应答的粒层细胞和泡膜细胞可以演变成上皮类型的卵巢癌的证据一致。

[0143] 在114例人乳腺癌病例的分析中，在17.5％的基质细胞，48.2％的上皮细胞或肌上皮细胞中发现了胞浆GT198的表达(表1)。正常乳腺组织除了极少细胞外，GT198表达是阴性的。在增生或扰乱的导管结构中常常发现胞浆GT198的肌上皮表达。因为GT198调节激素刺激的核受体信号，在肌上皮细胞中它的改变支持了肌上皮层的激素应答(Strum，J.M.，Cell Tissue Res，193：155-61(1978))现有证据也证实在乳腺癌发育中肌上皮层起至关重要的作用(Gudjonsson，T.，et al.，J Mammary Gland Biol Neoplasia，10：261-72(2005))。而且，在带有MMTV-Ras或多瘤病毒中间T抗原转基因的小鼠肿瘤模型中，与非转基因的正常组织比较，甚至在形态学增生出现前，GT198在乳腺肿瘤的基质中有大量的胞浆表达。该数据表明病毒癌基因活化诱导了GT198变异体的过表达。因为GT198变异体刺激MMTV启动子(图3a-b)，癌基因MMTV-Ras和GT198变异体表达之间的正反馈可以有利于肿瘤的起始。当转化的肿瘤细胞累积时，胞质向核GT198转换仅出现在较晚期。

[0144] 总之，乳腺癌和卵巢癌包含带有胞浆表达的GT198阳性细胞。增加的GT198变异体活性会引起野生型功能的缺陷，并且扰乱从细胞调亡所存活下来细胞的分化。为了进一步确认这种观点，用野生型GT198或变异体GT198a稳定地转染的小鼠P19干细胞注射裸小鼠乳腺。数据表明变异体GT198a，而不是野生型GT198转染的细胞诱导显著的小鼠乳腺肿瘤生长。在人卵巢癌和乳腺癌和小鼠肿瘤模型中共同的证据表明GT198变异体过表达是肿瘤发育期间的早期事件，这反映了GT198和BRCA1之间紧密的功能性关系。

[0145] 表1：人乳腺癌和卵巢癌中GT198的胞质表达

[0146]

[0147] 实施例6：早期发病的家族乳腺癌中GT198的基因突变

[0148] 为了寻找GT198参与乳腺癌的遗传学证据，从来自于BRCA1和BRCA2突变阴性的9名早期发病(＜40岁)的家族乳腺癌病例的无限增殖化血淋巴细胞中分离了基因组DNA和RNA并发现了GT198突变。发现的突变均在患者血样中证实。进行了Southern印迹、实时PCR、基因组步移、RT-PCR和序列分析。Southern印迹分析表明在病例3和病例9中异常带的存在。随后的测序证实这两个病例中限制位点的等位基因点突变。在病例3中，C到G突变位于3’UTR中终止密码子后31bp，c.*31C＞G。在病例9的情况下，鉴定了内含子4中C到T的突变，离剪接点88bp，c.337+88C＞T。不包括大内含子3在内，测序分析了这9个病例中所有的外显子和内含子。在病例1的外显子4中鉴定了单等位基因C到T的突变(Q104Stop，c.310C＞T)。这种截断型的突变产生提前终止密码子，并且阻止全长GT198的蛋白翻译，但是允许包含外显子5-8所编码的BRC重复同源性的变异体蛋白质的翻译。通过RT-PCR评估了这些序列改变对可变剪接的影响。结果实际结果表明带有突变的病例中无限增殖化淋巴细胞中的变异体mRNA的表达确实增加了，很可能是由于变异体的表达。在病例
1和病例3中，GT198a变异体显著地增加，在病例9中GT198-4变异体增加。发现病例1和病例3的变异体cDNA带有相同的突变。另外，实时PCR分析中检测出一个病例中GT198的拷贝增加(未示出)。此外，在测序分析期间在内含子4中发现了2个SNPs(图4b)。基于NCBI上的HapMap数据库，这两个SNPs是常见的SNPs，不可能是强的易患等位基因。GT198基因覆盖在包含多个Alu和L2重复的其大内含子3处连接的两个单倍型块(图4a)，然而，通过实时PCR和基因组步移分析，我们还没有检测到这9个病例中任何重排。但仍有可能存在更多的未鉴定的突变以影响可变剪接，这是因为我们还没有分析启动子/增强子区域。进一步检查带有突变的病例的家族史，发现每个家族中多个个体具有近亲患者的癌症，包括乳腺癌(图4c)。病例1的姐姐在40岁患乳腺癌，并且我们可以得到她的DNA。序列分析表明她也带有相同的c.310C＞T(Q104Stop)突变。这些数据共同地表明在早期发病乳腺癌中GT198种系突变的存在，同时存在GT198变异体表达的增加。

[0149] 序列数据

[0150] 下划线是翻译蛋白时的起始和终止密码子。粗体是变异体中额外的序列。

[0151] GT198野生型

[0152] cttccccttcagccaatcaccgttcgaggcccgcccccgtcgccggaaggagccgtcgccccgagcaactacaacgtccggcttt

[0153] ctgagttgggtggcgggaaaggcgatgagtaaaggccgggcagaagctgcggcgggagccgccgggatcctcctgaggtac

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[0161] cccctgaggggcc(SEQ ID NO：5)

[0162] 蛋白质：

[0163] MSKGRAEAAAGAAGILLRYLQEQNRPYSSQDVFGNLQREHGLGKAVVVKTLE

[0164] QLAQQGKIKEKMYGKQKIYFADQDQFDMVSDADLQVLDGKIVALTAKVQSL

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[0166] EEKEQVYRERQKYCKEWRKRKRMATELSDAILEGYPKSKKQFFEEVGIETDED

[0167] YNVTLPDP(SEQ ID NO：6)

[0168] GT198-1剪接变异型1

[0169] cttccccttcagccaatcaccgttcgaggcccgcccccgtcgccggaaggagccgtcgccccgagcaactacaacgtccggcttt

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[0181] (SEQ ID NO：7)

[0182] GT198-2剪接变异型2

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[0194] acggatgaagattacaacgtcacactcccagacccctgaggggcc(SEQ ID NO：8)

[0195] GT198-3剪接变异型3

[0196] cttccccttcagccaatcaccgttcgaggcccgcccccgtcgccggaaggagccgtcgccccgagcaactacaacgtccggcttt

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[0198] ctgcaggagcagaaccggccctacagctcccaggatgtgttcgggaacctacagcgggaacacggactgggcaaggcggtgg

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[0200] ag

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[0206] ttctttgaggaagttgggatagagacggatgaagattacaacgtcacactcccagacccctgaggggcc(SEQ ID NO：9)

[0207] GT198-4剪接变异型4

[0208] cttccccttcagccaatcaccgttcgaggcccgcccccgtcgccggaaggagccgtcgccccgagcaactacaacgtccggcttt

[0209] ctgagttgggtggcgggaaaggcgatgagtgagtaaaggccgggcagaagctgcggcgggagccgccgggatcctcctgaggtac

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[0216] ggcc(SEQ ID NO：10)

[0217] hGT198a 761bp剪接变异型a

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[0226] ttgaaggataccccaagagcaagaagcagttctttgaggaagttgggatagagacggatgaagattacaacgtcacactcccaga

[0227] cccctgaggggcc

[0228] (SEQ ID NO：11)

[0229] hGT198a-4 664bp剪接变异型a-4

[0230] gggaaaggcgatgagtaaaggccgggcagaagctgcggcgggag

[0231]ccgccgggatcctcctgaggtacct

[0232] gcaggagcagaaccggccctacagctcccaggatgtgttcgggaacctacagcgggaacacggactgggcaaggcggtggtg

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[0235] aatgcgctggctacagagagagattgaagaacattaaagcagctaccaatcatgtgactccagaagagaaagagcaggtgtaca

[0236] gagagaggcagaagtactgtaaggagtggaggaagaggaagaggatggctacagagctgtctgatgcaatacttgaaggatac

[0237] cccaagagcaagaagcagttctttgaggaagttgggatagagacggatgaagattacaacgtcacactcccagacccctgaggg

[0238] gcc(SEQ ID NO：12)

[0239] 所有剪接变异体编码C末端蛋白质：92aa

[0240] MQKEIQELKKECAGYRERLKNIKAATNHVTPEEKEQVYRERQKYCKEWRKRK

[0241] RMATELSDAILEGYPKSKKQFFEEVGIETDEDYNVTLPDP(SEQ ID NO：13)