用于传毒分子机制研究的无毒褐色桔蚜饲养方法

摘要

本发明公开了一种用于传毒分子机制研究的无毒褐色桔蚜的饲养方法，包括利用无毒柑桔苗进行继代饲养得到无毒无翅褐色桔蚜，配制饲养液与灭菌，饲养室的制备及饲养。该方法通过调整无毒柑桔苗上无翅成蚜和下一代若蚜数，有效抑制了有翅成蚜的形成，实现了周年无毒无翅成蚜的获得，保证了实验试虫的标准化。本发明的饲养液简单易于配制，实现了无翅成蚜在脱离寄主植物后得以短期正常存活，并不影响传毒效率，适用于蚜虫传播柑桔衰退病毒的分子机制研究的需求。

权利要求

1.一种用于传毒分子机制研究的无毒褐色桔蚜饲养方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)利用无毒柑桔苗进行继代饲养获得无毒无翅褐色桔蚜成虫：修剪无毒柑桔苗放入养虫室中，追施尿素或者复合肥促发新梢，从田间采集初孵若蚜建立无毒种群，将无毒种群放在无毒柑桔苗上饲养，用毛笔轻轻将产生的无翅成虫转移到无毒柑桔苗新梢上产生下一代若蚜，1～2天后将成虫转移到另一无毒苗上，获得大量的无毒无翅褐色桔蚜成虫备用； (2)配制饲养液，灭菌：所述饲养液为A或B两种，饲养液A的配制成分为：NaCl7～

10g/L，KCl0.05～0.2g/L，Na2HPO4·12H2O2.9～5g/L，KH2PO40.05～0.2g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖0～600g/L，所述饲养液B的配制成分为：Tris1.2～2g/L，EDTA0.2～

0.37g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖0～600g/L，饲养液A和饲养液B均为去离子水配制； (3)饲养室饲养蚜虫，然后将无毒褐色桔蚜成虫放入饲养室中进行饲养，饲养室置于养虫室中；所述步骤(1)或步骤(3)中养虫室的参数为：温度为25±2℃，光照∶黑暗为

14∶10h。

2.根据权利要求1所述的一种用于传毒分子机制研究的无毒褐色桔蚜饲养方法，其特征在于所述步骤(2)中饲养液A为去离子水配制，其配制成分为：NaCl7～10g/L，KCl0.1～

0.2g/L，Na2HPO4·12H2O2.9～4g/L，KH2PO40.1～0.2g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖200～

350g/L。

3.根据权利要求1所述的一种用于传毒分子机制研究的无毒褐色桔蚜饲养方法，其特征在于：所述步骤(2)中饲养液B为去离子水配制，其配制成 分为：Tris1.2～2g/L，EDTA0.2～0.37g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖200～350g/L。

4.根据权利要求1所述的一种用于传毒分子机制研究的无毒褐色桔蚜饲养方法，其特征在于：所述步骤(2)中饲养液A或饲养液B均在0.1MPa，121℃下高温灭菌20分钟。

5.根据权利要求1所述的一种用于传毒分子机制研究的无毒褐色桔蚜饲养方法，其特征在于：所述步骤(3)中饲养室为双通管，双通管一端由泊拉膜封住，饲养液置于泊拉膜上，蚜虫置于双通管道中，双通管的另一端由纱网封住。

说明书

用于传毒分子机制研究的无毒褐色桔蚜饲养方法

技术领域

[0001] 本发明属于昆虫饲养领域，具体的说，涉及一种用于传毒分子机制研究的无毒褐色桔蚜的饲养方法。

背景技术

[0002] 褐色桔蚜(Toxoptera citricida，Kirkaldy)，又称东方桔蚜，属于同翅目蚜总科Aphidoidea，是一种世界性分布的柑桔害虫，桔蚜不仅通过直接取食为害柑桔，而且是柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)的有效传播介体。柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)属于长线形病毒属(Closterovirus)，是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒。柑桔衰退病毒引起的柑桔衰退病是一种具有经济重要性的病害，广泛分布于世界各柑桔产区，对全世界的柑桔产业造成了严重的威胁。

[0003] 蚜虫人工饲料研究始于20世纪30年代，蚜虫人工饲料饲养技术的出现，使得蚜虫在脱离寄主植物后得以短期或长期存活。蚜虫人工饲料可应用于蚜虫传播病毒机制、营养生理、共生菌、毒理与杀虫活性物质生物测定以及昆虫与植物相互关系等方面的研究，已发展为这些研究的重要试验手段。

[0004] 植物病毒介体传播分子机制的研究，主要集中在病毒参与传播的基因及其产物的确定。目前在昆虫传播病毒分子机制的研究中经常使用的方法之一是：人工饲养昆虫，使昆虫在脱离寄植物后能够正常存活，在饲养液中添加病毒编码的蛋白质、特异性蛋白抗体或在饲养液中添加病毒提取液、双链RNA，通过比较传毒率的变化，探讨昆虫传播病毒的相关因子，对于一些基因组较小的病毒，使用侵染性克隆缺失突变体进行传毒分子机制的研究，但CTV基因组比较大，构建侵染性克隆缺失突变体比较困难，因此，研究传毒分子机制时需要蚜虫在脱离寄主植物后得以短期存活，为研究传毒分子机制，需要寻找适合褐色桔蚜取食和生存的实用饲料。酵母提取液作为实用饲料的成分之一，一方面可以提供营养，另一方面液体黄色对蚜虫有引诱作用，有利于蚜虫取食。糖类是生物体内能量的主要来源，对蚜虫具有刺激取食和营养双重作用，不同的蚜虫所需的蔗糖浓度是不同，目前已对桃蚜和豌豆蚜等不少蚜虫种类已实现了人工继代饲养，有桔二叉蚜在人工饲养上饲养1代的报道，但尚无褐色桔蚜人工饲养的资料的报道，而且柑桔衰退病毒的蚜虫传播分子机理进展不大。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种无毒褐色桔蚜人工饲养的方法，使蚜虫在脱离寄主植物后得以短期存活且不影响传毒效率，以便于无毒褐色桔蚜传毒分子机制的研究。

[0006] 本发明具体按如下步骤进行：

[0007] (1)利用无毒柑桔苗进行继代饲养得到无毒褐色桔蚜：从田间采桔蚜虫源，以初孵若蚜建立无毒种群，初孵若蚜是指刚出生尚未接触叶面的蚜虫，用脱毒柑桔苗或实生苗在养虫室内饲养褐色桔蚜，养虫室中设置温度为25±2℃，光照：黑暗为14∶10h，为了确保连续有新稍可用于饲养蚜虫，每两周修剪20株无毒柑桔苗，追施质量分数为0.5％尿素或复合肥促发新稍，若蚜会形成一个群体，群体太多就会产生有翅蚜虫。为了抑制有翅成蚜的形成和获得状态一致的无翅成虫，用毛笔轻轻将30头以上无翅成虫放在无毒柑桔苗新稍上产下一代若蚜，1～2天后将成虫转移到另一无毒苗上，下一代的1～2日龄的无翅成虫备用。不断挑用毛笔轻挑无翅成蚜于嫩梢，继代饲养得到无毒蚜虫备用；

[0008] (2)饲养液的配制与灭菌；饲养液为A或B两种，饲养液A为去离子水配制，其配制成分为：NaCl 7～10g/L，KCl 0.05～0.2g g/L，Na2HPO4·12H2O2.9～5g/L，KH2PO4 0.05～0.2g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖0～600g/L，pH调节为7.0～8.0，饲养液A在0.1MPa，
121℃下高温灭菌20分钟，可在饲养液A中添加用于研究传毒分子机制的特异性蛋白或者特异性抗体；

[0009] 上述饲养液B为去离子水配制，其配制成分为：Tris 1.2～2g/L，EDTA0.2～0.37g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖0～600g/L，pH调节为7.0～8.0，饲养液B在0.1MPa，
121℃下高温灭菌20分钟，可在饲养液B中添加用于研究传毒分子机制的病毒提取液或者双链RNA；

[0010] (3)将无毒褐色桔蚜和饲养液放入饲养室中进行饲养：饲养室由蚜虫取食液囊和取食室组成，取食液囊是由双层拉薄的泊拉膜(Parafilm)夹饲养液滴构成，取食室用直径1.5～3cm，高2.5～5cm的双通管，饲养时，取食液囊固着于取食室的一端，将蚜虫放人取食室，另一端围以纱网，防止蚜虫逃逸，并可起到通风的作用，每个饲养室中放10～15头蚜虫。在饲养室下方放置水槽，保持一定的湿度。将饲养装置放置在养虫室中养虫室中设置温度为25±2℃，光照：黑暗为14∶10h。

[0011] 为了优化，上述饲养液A的配制成分为NaCl 7～10g/L，KCl 0.1～0.2g g/L，Na2HPO4·12H2O 2.9～4g/L，KH2PO4 0.1～0.2g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖200～350g/L，去离子水配制，上述饲养液B的配制成分为：Tris 1.2～2g/L，EDTA0.2～0.37g/L，酵母提取粉25～50g/L，蔗糖200～350g/L，去离子水配制。

[0012] 上述酵母提取液作为实用饲料的成分之一，一方面可以提供营养，另一方面液体黄色对蚜虫有引诱作用，有利于蚜虫取食。

[0013] 糖类是生物体内能量的主要来源，对蚜虫具有刺激取食和营养双重作用，不同的蚜虫所需的蔗糖浓度是不同的，本发明给出了饲养褐色桔蚜优化的蔗糖浓度。

[0014] 有益效果：

[0015] (1)本发明提出的无毒无翅褐色桔蚜虫在柑桔苗上的继代饲养，实现了室内、周年饲养褐色桔蚜的目的，可以周年获得龄期和状态等较为一致的虫，克服了以往从自然发生地采集虫源，所带来的易受生长状态及龄期等的影响，导致实验结果存在差异的缺陷，保证了实验试虫的标准化。

[0016] (2)本发明饲养方法易于操作，饲养室制作简单，饲养液易于配制，适合褐色桔蚜成虫取食，实现了成蚜蚜虫在脱离寄主植物后得以短期正常存活，且不影响传毒效率，适用于褐色桔蚜传播柑桔衰退病毒的分子机制的研究。

[0017] (3)本发明饲养液A中可以添加用于研究柑桔衰退病毒传毒分子机制的特异性蛋白或者特异性抗体，可在饲养液B中添加用于研究柑桔衰退病毒传毒分子机制的病毒提取液或者双链RNA；通过比较传毒率的变化，探讨褐色桔蚜传播病毒的相关因子，推动了柑桔衰退病毒传毒分子机制的研究。

具体实施方式

[0018] 实施例1

[0019] (1)无毒褐色桔蚜虫在柑桔苗上的继代饲养

[0020] 桔蚜采自田间，以初孵若蚜(若蚜是指刚出生的蚜虫，初孵若蚜是指刚出生尚未接触叶面的蚜虫)建立无毒种群，用脱毒柑桔苗或实生苗饲养褐色桔蚜，为了保证一直有嫩稍饲养蚜虫，在温度为25±2℃的温室每周修剪20株无毒柑桔苗，修剪后施质量分数为0.5％尿素或复合肥促进发梢，发新稍后移至养虫室，养虫室中设置温度为为25±2℃，光照：黑暗为14∶10h，为了抑制有翅成蚜的形成和获得状态一致的无翅成虫，用毛笔轻轻将
30头以上无翅成虫放在无毒柑桔苗新稍上产若蚜，1～2天后将成虫转移到另一无毒苗上，下一代的1～2日龄的无翅成虫备用。

[0021] (2)饲养液的配制与灭菌

[0022] 配制饲养液1.2g Tris，0.37g EDTA，调pH于7.8，25g酵母提取粉，配成0、10％、20％、25％、30％、35％、40％、50％和60％不同蔗糖浓度的饲养液，用去离子水配制，定容到
1000mL。121℃下高压灭菌20分钟。

[0023] (3)饲养室的制备：

[0024] 饲养室由蚜虫取食液囊和取食室组成，取食液囊是由双层拉薄的泊拉膜夹人工饲料液滴构成，取食液囊加入300μL的饲养液，取食室用直径1.5cm，高2.5cm的双通管，饲养时，取食液囊固着于取食室的一端，将蚜虫放人取食室，另一端围以纱网，防止蚜虫逃逸，并可起到通风的作用，每个饲养室中放10头蚜虫。在饲养室下方放置水槽，保持一定的湿度。将饲养装置放置在养虫室中，养虫室中设置温度为25±2℃，光照：黑暗为14∶10h。

[0025] (4)成虫在饲养室的饲养及观察

[0026] 每个蔗糖浓度下有3个饲养室，每个饲养室用毛笔轻挑10头无翅成虫放入每个饲养室，记录饲喂48h后成蚜数，结果如表1：

[0027] 称量新鲜制作的饲养室和饲喂第3天饲养室的重量变化，分析结果如表2：

[0028] 表1不同蔗糖浓度的饲料对无翅成蚜存活的影响

[0029]

[0030] 由表1可见，实用饲料饲喂48h后成蚜数为8～27头，只有酵母提取液无蔗糖的饲养体系下饲喂48h后成蚜最少，存活率为26.7％，20％～35％蔗糖浓度体系饲喂48h后成蚜均有70％以上存活率。

[0031] 表2饲喂第3天饲养室的重量变化表

[0032]

[0033] 由表2可见，所有放入蚜虫的饲养室在饲喂蚜虫第3d重量均减轻，减轻2.0～9.3mg，表明蚜虫取食了实用饲料。35％蔗糖浓度饲喂体系下，饲养室重量减轻最多，为
9.3mg，饲养室减轻的重量经多重分析比较，含20～35％蔗糖浓度的实用饲料饲喂时，饲养室减轻的重量显著高于其他处理和对照，而含20～35％蔗糖浓度的实用饲料饲喂时，饲养室减轻的重量之间差异不显著。

[0034] (5)传毒率的测定：按照上述饲养方法的饲养室中随机取喂养24h小时后的无翅成蚜中取150头，然后放在柑桔衰退病毒CTV毒源植物上获毒24h，然后传毒，每株受毒植物上放置15头成虫，每次重复10株受毒植物，重复3次，传毒时间为24h，3个月后经DTBIA检测，平均传毒率为83.3％。

[0035] 对照试验：取利用无毒柑桔苗上饲养的无翅成虫150头，然后放在CTV毒源植物上获毒24h，然后传毒，每株受毒植物15头成虫，每次重复10株受毒植物，重复3次，传毒时间为24h，3个月后经DTBIA检测，平均传毒率为86.7％。

[0036] 由此可见，利用本发明的方法饲养的无翅成虫传毒率与利用无毒柑桔苗或者实生苗直接饲养的无翅成虫传毒率相当。

[0037] 实施例2

[0038] 本实施例其他的步骤与实施例1完全相同，不同的有以下两点：

[0039] (1)是饲养液的配制：NaCl 8g，KCl 0.1g，Na2HPO4·12H2O 3g，KH2PO4 0.1g，酵母提取粉50g，调pH于7.0，配成0、10％、20％、25％、30％、35％、40％、50％和60％不同蔗糖浓度的饲养液，用去离子水配制，定容到1000mL。121℃下高压灭菌20分钟。得到不同蔗糖浓度的饲料对蚜虫存活的影响的数据如下表

[0040]