约氏乳杆菌在制备提高畜禽免疫水平饲料中的应用

摘要

本发明公开了约氏乳杆菌CGMCC？No.4926在制备提高畜禽免疫水平饲料中的应用。将所述的约氏乳杆菌以适当的剂量添加饲料中对提高产蛋鸡、蛋雏鸡和肉仔鸡血清新城疫抗体效价和IgA水平有显著改善作用。

权利要求

1.约氏乳杆菌CGMCC No.4926在制备提高鸡免疫水平饲料中的应用，其中，在产蛋鸡的基础日粮中添加所述的约氏乳杆菌制剂，使所述的约氏乳杆菌在每克饲料中的含量为4

1.0×10 cfu，在蛋雏鸡的基础日粮中添加所述的约氏乳杆菌制剂，使所述的约氏乳杆菌在

6 7

每克饲料中的含量为1.0×10~10cfu，在肉仔鸡的基础日粮中添加所述的约氏乳杆菌制5

剂，使所述的约氏乳杆菌在每克饲料中的含量为1.0×10cfu，所述的约氏乳杆菌制剂为约氏乳杆菌冻干剂，所述约氏乳杆菌冻干剂的冻干保护剂为质量比为2:2:4:1:2的脱脂乳、海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠和甘油。

说明书

约氏乳杆菌在制备提高畜禽免疫水平饲料中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种约氏乳杆菌菌株在制备提高畜禽免疫水平饲料中的应用。

背景技术

[0002] 约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)属于厚壁菌门(Firmicutes)芽孢杆菌纲(Bacilli)乳杆菌目(Lactobacillales)乳杆菌科(Lactobacillaceae)乳杆菌属(Lactobacillus)，1980年首次被分离，然而在分类学上一直将其划分为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。1992年Fujisawa等通过生化实验和DNA杂交实验将其定名为约氏乳杆菌。约氏乳杆菌主要存在于动物和人的消化道中，且为优势菌群。

[0003] 欧盟食品安全局(EFSA)会分别于2009年和2011年两次发布了针对约氏乳杆菌的健康申明，申明指出约氏乳杆菌具有减少肠道内病原菌的微生物，增强天然防御和免疫系统和保持皮肤健康。并且欧盟与2010年对约氏乳杆菌进行了安全资格认定(qualified presumption of safety，QPS)批准其在饲料和食品中使用。综合目前关于约氏乳杆菌的文献报道，其对动物的益生功能主要体现在以下几方面：1.约氏乳杆菌对动物天然防御系统及免疫机能具有调节作用，其具体调控位点，如TGFβ，TLR9，NF-κB，IgA，往往是动物机体免疫应答反应的起始受体，因此其预防动物疾病的作用机理可能是在特定时期刺激动物免疫系统，早期激活下游免疫应答进而防止疾病发生；2.约氏乳杆菌表现出对动物皮炎的特异性预防作用。3.约氏乳杆菌对病原菌的排他性竞争作用。约氏乳杆菌对一些病原菌如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌在肠道上皮细胞上的定殖产生空间位阻，可防止病原菌对肠道上皮细胞的侵染，减少疾病发生。

[0004] 2010年我国卫生部办公厅将约氏乳杆菌收录到《可用于食品的菌种名单》中，批准其作为具有益生功能的食品添加剂使用。目前在国内尚未见有将约氏乳杆菌作为添加剂添加食品和饲料添加剂的产品面世，其在动物畜禽养殖上的应用也鲜见报道，将约氏乳杆菌开发成动物微生态饲料添加剂，为填补国内空白，筛选益生性能优良的约氏乳杆菌，对促进我国畜禽养殖水平意义重大，可在畜禽养殖中发挥更大作用。

发明内容

[0005] 为了解决上述问题，本发明提供约氏乳杆菌CGMCC No.4926在制备提高鸡免疫水平饲料中的应用。

[0006] 本发明的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，是通过体外耐酸和耐胆盐筛选得到的一株具有潜在益生功能的约氏乳杆菌，命名为约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)YS-12，并于2011年6月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为CGMCC No.4926。

[0007] 其中，所述的约氏乳杆菌菌株的筛选过程如下：

[0008] (1)收集菌种

[0009] 截取健康猪结肠后半段，用生理盐水冲洗三次，用牙签多次刮取肠道上皮上的附着物，放入10mL的生理盐水中，作为样品原液，对原液进行10倍梯度稀释。

[0010] (2)菌种培养

[0011] 将每个稀释度，取100微升涂布于MRS平板上，37℃倒置培养24小时。

[0012] (3)菌种鉴定

[0013] 挑取平板上的单菌落进行对其16S rRNA进行菌落PCR鉴定，通过在数据库中进行序列比对，发现其16S序列(GenBank登录号：HQ641209)与数据库中已知的约氏乳杆菌的16S序列的相似度达99％，进一步通过理化实验证实其为约氏乳杆菌。

[0014]

[0015] (4)菌种筛选

[0016] 1)将菌体重悬于PBS液后，梯度稀释至10-2，用移液器吸取10-2稀释液100微升分别加入900微升0.3％的胆盐溶液和PBS(对照)中，37℃保温3小时。

[0017] 2)将菌体重悬于PBS液后，梯度稀释至10-2，用移液器吸取10-2稀释液100微升分别加入900微升pH3.0的缓冲液和PBS(对照)中，37℃保温3小时。

[0018] 3)将酸处理过的菌液继续稀释至10-5，取10-3、10-4、10-5三个稀释度(对照组稀释-6 -4 -5 -6至10 ，取10 、10 、10 )各0.1ml涂布MRS平板，37℃倒置培养48小时。挑取耐受性菌株进行反复筛选，得到耐酸和耐胆盐性能优良的约氏乳杆菌。

[0019] (5)菌种保藏

[0020] 将筛选得到的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)YS-12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，获得保藏号为CGMCC No.4926。

[0021] 将约氏乳杆菌CGMCC No.4926单独或制备成制剂添加到不同类型的鸡的基础日粮中，饲喂后可显著提高免疫水平。

[0022] 在本发明的一个实施方案中，在产蛋鸡的基础日粮中添加所述的约氏乳杆菌制4
剂，使所述的约氏乳杆菌在每克饲料中的含量达到1.0×10cfu，显著提高了产蛋鸡血清新城疫抗体效价和IgA水平。

[0023] 在本发明的另一个实施方案中，在蛋雏鸡的基础日粮中添加所述的约氏乳杆菌制6 7
剂，使所述的约氏乳杆菌在每克饲料中的含量达到1.0×10 ～10cfu，显著提高了蛋雏鸡血清新城疫抗体效价和IgA水平。

[0024] 在本发明的又一个实施方案中，在肉仔鸡的基础日粮中添加所述的约氏乳杆菌制5
剂，使所述的约氏乳杆菌在每克饲料中的含量达到1.0×10cfu，显著提高了蛋雏鸡血清IgA水平。

[0025] 在本发明一个优选的实施方案中，所述的约氏乳杆菌制剂可为本领域常规制剂，更优选为约氏乳杆菌冻干剂。

[0026] 其中，所述约氏乳杆菌冻干剂还可含有冻干保护剂，优选的冻干保护剂为质量比为2∶2∶4∶1∶2的脱脂乳、海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠和甘油。

[0027] 其中，所述约氏乳杆菌冻干剂的制备方法如下：

[0028] 1)将冷冻保存的约氏乳杆菌CGMCC No.4926在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10mL深层MRS液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于250mL MRS液体培养基，培养8～10小时后作为种子液；

[0029] 2)以5％～10％的接种量将步骤1)所得的种子液接种于5L的发酵罐中培养；

[0030] 3)发酵过程中维持发酵液pH值为6.0～6.5，当pH超过设定值时，补加料液；当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水、KOH、NaOH中的任一种；在温度37～39℃、转速100rpm条件下发酵10～14小时，发酵过程不通气或通入N2，维持溶氧小于1％；

[0031] 4)当补加料液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值(即OD600)不再增11
加时，终止发酵，即得约氏乳杆菌活菌数达10 cfu/ml以上的发酵液；

[0032] 5)4000-8000转/分钟离心5-10分钟，得到约氏乳杆菌菌泥；

[0033] 6)得到的产物按照菌泥(g)∶保护剂(mL)质量体积比1∶5加入冻干保护剂，进行真空冷冻干燥，得到约氏乳杆菌冻干剂。

[0034] 本发明的约氏乳杆菌CGMCC No.4926以适当的剂量添加饲料中对提高产蛋鸡、蛋雏鸡和肉仔鸡血清新城疫抗体效价和IgA水平有显著改善作用。其中饲料4
中以1.0×10cfu/g添加约氏乳杆菌分别提高产蛋鸡血清中第21天新城疫抗体效价(745.92±0.102.32)与对照相比达到显著水平(P＜0.01)，第28天IgA水平
6
(174.81±15.97)与对照相比也达到显著水平(P＜0.01)；饲料中以1.0×10cfu/g添加约氏乳杆菌分别提高蛋雏鸡血清中第91天新城疫抗体效价(4319.77±945.05)与对照相
7
比达到显著水平(P＜0.01)，以1.0×10cfu/g添加约氏乳杆菌分别提高蛋雏鸡血清中第
63和91天IgA水平(757.28±145.56)与对照相比也达到显著水平(P＜0.01)；饲料中以
5
1.0×10cfu/g添加约氏乳杆菌分别提高14日龄肉仔鸡血清中IgA水平(383.05±53.29)与对照相比也达到显著水平(P＜0.01)。

[0035] 本发明中的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)YS-12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)保藏，简称CGMCC，保藏日期为2011年6月8日，保藏号为CGMCC No.4926。

具体实施方式

[0036] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0037] 实施例1 约氏乳杆菌CGMCC No.4926冻干剂的制备

[0038] 1)将冷冻保存的约氏乳杆菌CGMCC No.4926在MRS琼脂平板活化三次，挑取单菌落接种于10mL深层MRS液体试管，37℃培养10小时后，以1％接种量转接于250mL MRS液体培养基，培养10小时后作为种子液；

[0039] 2)以5％的接种量将步骤1)所得的种子液接种于5L的发酵罐中培养；

[0040] 3)发酵过程中维持发酵液pH值为6.0，当pH超过设定值时，补加料液；当pH低于设定值时，自动流加碱性中和剂氨水；在温度37℃、转速100rpm条件下发酵14小时，发酵过程通入N2，维持溶氧小于1％；

[0041] 4)当补加料液pH不再降低或发酵液在600nm波长下的吸光值(即OD600)不再增11
加时，终止发酵，即得约氏乳杆菌活菌数达10 cfu/ml以上的发酵液；

[0042] 5)8000转/分钟离心10分钟，得到约氏乳杆菌菌泥；

[0043] 6)得到的产物按照菌泥(g)∶保护剂(mL)质量体积比1∶5加入质量比为2∶2∶4∶1∶2的脱脂乳、海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸钠和甘油，进行真空冷冻干燥，得
11
到约氏乳杆菌冻干剂，其中，约氏乳杆菌的活菌数可达3.7×10 cfu/g。

[0044] 实施例2

[0045] (1)实验动物及实验设计

[0046] 124日龄海兰褐商品代蛋鸡540只购自北京蛋鸡养殖场。基础日粮配方和营养成分，见表1。

[0047] 表1 基础日粮配方和营养成分

[0048]

[0049] 注：每千克饲料中含有：VA 16mg，VD3 5mg，VE 20mg，VK3 3mg，VB1 4.6mg，VB210.5mg，VB6 8.6mg，VB12 2mg，蛋白粉390mg，次粉5473.55mg，泛酸钙14.5mg，烟酰胺
40.2mg，叶酸2.3mg，生物素10mg，硫酸锰251.57mg，硫酸锌202.9mg，硫酸铁199.33mg，硫酸铜31.92mg，碘化钾50mg，亚硒酸钠30mg，石粉1234.28mg，氯化胆碱1000mg，MET 1000mg。

[0050] 根据体重情况将540只健康蛋鸡，按单因素随机试验设计分成6个处理组，每个处理组6个重复，每个重复15只鸡。第1组为空白对照组，饲喂基础日粮；第2组为约氏乳杆菌试验组，分别在基础日粮的基础上添加实施例1制备的约氏乳杆菌，使每克饲料中分别含有104、105、106、107、108cfu的约氏乳杆菌

[0051] (2)动物实验方法

[0052] 试验鸡在相同条件的半开放鸡舍内饲养，采用3层阶梯式笼养，饲养密度为3只/笼，每天定时饲喂2次(8:00；15:00)。自由采食，饮水。采用16小时光照(早6:00至晚10:00)，用干湿球温度计记录鸡舍内温度和湿度，保持鸡舍内温度在22±3℃，相对湿度在
50％-70％。随时记录和观察鸡只死亡情况，并进行剖检，对病情进行初步诊断。

[0053] (3)血清新城疫抗体效价和IgA水平的检测

[0054] 试验鸡进行新城疫疫苗免疫，分别于第0、7、14、21、28、35天翅静脉真空采血。每个重复选取两只鸡进行翅下静脉采血，每只鸡采血4ml，分离血清，用ELISA试剂盒进行新城疫抗体效价及IgA水平的测定。

[0055] (4)统计方法

[0056] 数据经Excel初步处理后，采用SAS软件进行单因素方差分析和多重比较，结果用“平均数±标准差”表示。

[0057] (5)结果分析

[0058] 1)约氏乳杆菌对产蛋鸡血清新城疫抗体效价的影响

[0059] 见表2。免疫后21d时，试验2组的抗体效价最高，平均达到745.92pg/ml；免疫后28d时，试验4组的新城疫抗体效价极显著高于对照组(P＜0.01)。

[0060] 表2 约氏乳杆菌对产蛋鸡血清新城疫抗体效价的影响(pg/ml)

[0061]

[0062] 注：1、同行内平均值标注不同大写字母表示差异极显著。

[0063] 2、0d是在实验一周后免疫前采血样；21d是免疫后21天；28d是免疫后28天。下表同。

[0064] 2)约氏乳杆菌对产蛋鸡血清IgA水平的影响

[0065] 如表3所示，免疫后21天，试验3，4，5和6组血清IgA水平极显著高于对照组和试验2组(P＜0.01)。免疫后28天，试验3，4，5和6组血清IgA水平极显著低于对照组和试验2组(P＜0.01)。

[0066] 表3 约氏乳杆菌对产蛋鸡血清IgA水平的影响(μg/ml)

[0067]

[0068] 实施例3

[0069] (1)实验动物及实验设计

[0070] 1日龄雌性健康健康京红蛋雏鸡540只购自北京华都峪口禽业有限责任公司孵化场。基础日粮配方和营养成分，见表4。

[0071] 表4 基础日粮配方和营养成分

[0072]

[0073] 随机分成6个处理组，每个处理组6个重复，每个重复15只鸡。第1组为空白对照组，饲喂基础日粮；第2-6组为约氏乳杆菌试验组，分别在基础日粮中添加实施例1制备4 5 6 7 8
的1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10cfu/g的约氏乳杆菌。试验周期为120天。

[0074] (2)动物实验方法

[0075] 试验鸡在相同条件的半开放鸡舍内饲养，采用3层阶梯式笼养，饲养密度为3只/笼，每天定时饲喂2次(8:00；15:00)。自由采食，饮水。采用16小时光照(早6:00至晚10:00)，用干湿球温度计记录鸡舍内温度和湿度，保持鸡舍内温度在22±3℃，相对湿度在
50％-70％。随时记录和观察鸡只死亡情况，并进行剖检，对病情进行初步诊断。

[0076] (3)血清新城疫抗体效价和IgA水平的检测

[0077] 试验鸡进行新城疫疫苗免疫，分别于第0、7、14、21、28、35天翅静脉真空采血。每个重复选取两只鸡进行翅下静脉采血，每只鸡采血4ml，分离血清，用ELISA试剂盒进行新城疫抗体效价及IgA水平的测定。

[0078] (4)统计方法

[0079] 数据经Excel初步处理后，采用SAS软件进行单因素方差分析和多重比较，结果用“平均数±标准差”表示。

[0080] (5)结果分析

[0081] 1)约氏乳杆菌对蛋雏鸡血清新城疫抗体效价的影响

[0082] 63日龄时，试验4组和5组血清新城疫抗体效价高于其他各组，试验2，3，4，5，6组血清新城疫抗体效价均比试验1组高，但无显著性差异(P＞0.05)；91日龄时，试验4，5，6组血清新城疫抗体效价显著高于试验1，2，3组(P＜0.05)。

[0083] 表5 约氏乳杆菌对蛋雏鸡血清新城疫抗体效价的影响(pg/mL)

[0084]

[0085] 2)约氏乳杆菌对产蛋鸡血清IgA水平的影响

[0086] 见表6。28日龄时，试验3，4，5组鸡血清IgA水平显著低于试验1，2，6组(P＜0.05)，试验6组血清IgA水平显著低于试验2组(P＜0.05)；63日龄和91日龄时，试验4，5，6组鸡血清IgA水平均显著高于试验1，2，3组(P＜0.05)。

[0087] 表6 约氏乳杆菌对蛋雏鸡血清IgA水平的影响(μg/mL)

[0088]

[0089] 实施例4

[0090] (1)实验动物及实验设计

[0091] 1日龄雄性健康的AA肉仔鸡540只随机分成6个处理组，每个处理组6个重复，每个重复15只鸡。第1组为空白对照组，饲喂基础日粮；第2-6组为约氏乳杆菌试验组，饲料4 5 6 7 8
中约氏乳杆菌添加量分别为1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10cfu/g，试验周期为7周。基础日粮配方和营养成分，见表7。

[0092] 基础日粮配方见表7。参照NRC(1994)配制。

[0093] 表7 基础日粮组成

[0094]

[0095] 注：每公斤饲料中维生素与微量元素含量：Mn 90mg；Zn 50mg；Fe 90mg；Cu 10mg；I 0.4mg；Se 0.2mg；Co 0.4mg；VA 5000IU；VD3 500IU；VE 10IU；VK 0.5mg；VB1 1.5mg；VB2
6.0mg；泛酸12mg；烟酸35mg；VB6 6.0mg；叶酸0.8mg；VB12 0.01mg；生物素0.18mg[0096] (2)动物实验方法

[0097] 采用叠层笼养，15只/笼。进雏后供给温水饮用，4-5个小时后供给雏鸡料。随后自由采食与饮水，室温：1周龄32℃-34℃，从第二周起，每周下降2℃-3℃，第4周起，室温保持27℃-28℃；前期湿度保持在65％-70％，后期湿度为55％-65％。

[0098] (3)血清IgA水平的检测

[0099] 分别在1、7、14、21、28、35、42、49日龄早上8点空腹称重，统计每周采食量；分别在7、14、28、42日龄，每个重复随机取一只鸡翅静脉采血，测定血清IgA水平。

[0100] (4)统计方法

[0101] 数据经Excel初步处理后，采用SAS软件进行单因素方差分析和多重比较，结果用“平均数±标准差”表示。

[0102] (5)结果分析