含有穿山龙提取物与哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物的药物组合物及其应用

摘要

本发明涉及一种含有穿山龙提取物与哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物的药物组合物及其在制备治疗肝癌、胃癌、肺癌、肾癌、脑瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌或结肠癌的药物中的应用。本发明药物组合物具有显著的协同效应，提高了药物的疗效，降低了给药剂量，减少了副作用的发生。

权利要求

1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由穿山龙提取物与哈尔满碱组成；

所述穿山龙提取物与哈尔满碱的重量比为0.25～4：1；所述穿山龙提取物是将穿山龙药材粗粉用浓度为60%～80%乙醇提取后过滤，合并滤液，减压浓缩干燥后得粗提物，将所述粗提物用水溶解后再用石油醚萃取，取萃取后剩余的水层，再用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯萃取液得穿山龙提取物。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述穿山龙提取物与哈尔满碱的重量比为0.5～2：1。

3.权利要求1-2任一所述的药物组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物组合物中的穿山龙提取物和哈尔满碱同时使用或以任何先后的顺序使用。

说明书

含有穿山龙提取物与哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物的药物

组合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种药物组合物及其在制备治疗癌症的药物中的应用，具体涉及含有穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物的药物组合物及其在制备治疗肝癌、胃癌、肺癌、肾癌、脑瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌或结肠癌的药物中的应用。

背景技术

[0002] 恶性肿瘤是一大类疾病，世界卫生组织调查报告表明，全球癌症状况日益严重，因癌症而死亡的人数将由每年的600万增加至1000万。其中肺癌为常见的恶性肿瘤之一，源于各级支气管上皮，分为细胞肺癌和非小细胞肺癌；原发性肝癌为发生在肝细胞与肝内胆管上皮细胞的癌变，是人类最常见的恶性肿瘤之一；结肠癌的发病与环境、生活习惯尤其是饮食方式有关，随着生活水平的提高和饮食结构的改变，结肠癌的发病率呈逐年上升趋势；神经胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤，其起源于神经间质细胞，为颅内常见恶性肿瘤，约占颅内肿瘤的35-60％。

[0003] 目前，恶性肿瘤的药物治疗已经成为肿瘤三大治疗手段之一，开发具有抗肿瘤的天然药物成为目前研究的热点，中药配伍增进疗效是研究抗肿瘤药物的新方向。

[0004] 穿山龙具有祛风除湿，舒筋活络，活血止痛的功效，近些年，关于穿山龙提取物具有抗肿瘤活性的报道越来越多，从中分离出单体薯蓣皂苷等也具有抗癌活性。蒺藜具有平肝解郁，活血祛风等功效，从中提取出的哈尔满碱具有抗菌活性，发明人前期工作发现其也具有抗肿瘤功效。

[0005] 细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与肿瘤的发生、发展有着密切的关系，1992年英国科学家Hickman等提出将诱导肿瘤细胞凋亡作为以后肿瘤治疗研究中的主要目标和手段。细胞凋亡的途径主要有两条：一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase；一条是通过胞内线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的caspase可降解细胞内的重要蛋白，引起细胞凋亡。caspase-3蛋白是细胞凋亡过程中的主要效应因子。

[0006] 判断联合用药效果的方法和数学模型有很多种，其中等效曲线-相互指数法(Isobole-Interaction index method)是诸方法中最实用、最具操作性和最可靠的方法。合理的联合用药有单用药物不可比拟的优越性，联合用药针对多靶点进行靶向治疗将不仅旨在减少或延缓耐药性的出现、降低毒性，而且通过多种药物对癌细胞杀伤的协同作用取得更好的疗效。

发明内容

[0007] 针对以上技术问题，本发明提供一种药物组合物及其在制备抗肿瘤药物中的应用，具体为含有穿山龙提取物与哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物的药物组合物及其在制备治疗肝癌、胃癌、肺癌、肾癌、脑瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌或结肠癌的药物中的应用。

[0008] 本发明含有穿山龙提取物与哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物的药物组合物中，所述哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物可以为哈尔满碱、其衍生物及其结构类似物。

[0009] 本发明药物组合物中的哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物优选为哈尔满碱。

[0010] 本发明药物组合物中，所述组分包括但不限于哈尔满碱药物本身，还可以是其可药用的盐、水合物或衍生物等。

[0011] 本发明中，所述穿山龙提取物(extract from Dioscoreae nipponicae Rhizoma，DNR)是将穿山龙药材粗粉用浓度为60％～80％乙醇提取后过滤，合并滤液，减压浓缩干燥后得粗提物，将所述粗提物用水溶解后再用石油醚萃取，取萃取后剩余的水层，再用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯萃取液得穿山龙提取物。

[0012] 本发明药物组合物中穿山龙提取物优选是将穿山龙药材粗粉用浓度为70％乙醇提取3次后过滤，合并滤液，减压浓缩干燥后得粗提物，将所述粗提物用水溶解后再用石油醚萃取，取萃取后剩余的水层，再用乙酸乙酯萃取，减压回收得穿山龙提取物。

[0013] 本发明含有穿山龙提取物与哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物的药物组合物中，穿山龙提取物与哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物的重量比为0.25～4∶1；进一步优选穿山龙提取物与哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物的重量比为0.5～2∶1；更优选的，穿山龙提取物与哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物的重量比为2∶1。

[0014] 本发明含有穿山龙提取物与哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物的药物组合物可以用于制备治疗各种肿瘤的药物，所述肿瘤包括但不限于肝癌、胃癌、肺癌、肾癌、脑瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌或结肠癌。

[0015] 本发明粉穿山龙提取物与哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物的药物组合物优选用于制备治疗肝癌的药物中的应用。

[0016] 本发明药物组合物在制备治疗肝癌的药物中的应用中，穿山龙提取物与哈尔满碱的重量比为0.25～4∶1；进一步优选穿山龙提取物与哈尔满碱的重量比为0.5～2∶1；更优选的，穿山龙提取物与哈尔满碱的重量比为2∶1。

[0017] 含有穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物的组合物在制备治疗肝癌、胃癌、肺癌、肾癌、脑瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌或结肠癌的药物的应用中，在将本发明组合物制成同时给药的药剂的方案中，穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物可以含在同一种药物制剂如片剂或胶囊中，也可以将穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物分别做成制剂，如分别做成片剂或胶囊，并采用本领域常规的方式将它们包装或结合在一起，患者然后按照药品说明书的指示同时服用；在将本发明组合物制成先后给药的药剂的方案中，可以将穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物分别做成不同的制剂，并采用本领域常规的方式将它们包装或结合在一起，患者然后按照药品说明书指示的先后顺序进行服用，或将上述组合物中的两种成分制成一种控释的制剂，先释放组合物中的一种成分、然后再释放组合物中的另一种成分，患者只需要服用该控释组合物制剂；在将本发明组合物制备成交叉给药的药剂的方案中，可以将穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物分别做成不同的制剂，并采用本领域常规的方式将它们包装或结合在一起，患者然后按照药品说明书指示的交叉顺序服用，或者将该药物组合物制备成穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物交叉释放的控释制剂。

[0018] 穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物组合物在制备治疗肝癌、胃癌、肺癌、肾癌、脑瘤、肉瘤、神经胶质瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌或结肠癌的药物中的应用中，所述组合物中的穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物可以同时使用或以任何先后的顺序使用，如可以将穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物同时给患者服用；也可以先将穿山龙提取物给患者服用、然后服用哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物药物，或先服用哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物药物、然后服用穿山龙提取物，对于两者服用的时间间隔没有特别要求，但优选服用两种药物的时间间隔不超过一天；或者两种药物交替给药。

[0019] 本发明中，可将本发明穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物采用本领域常规的方法制备成适于胃肠道给药或非胃肠道给药的药物制剂，本发明优选将穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物制成胃肠道给药的药物制剂，其制剂形式可以为常规片剂或胶囊、或控释、缓释制剂。在本发明穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物组合物的药物制剂中，根据不同的制剂形式和制剂规格，所述组合物在制剂中的含量可以为质量计为1-99％，优选为10％-90％；制剂使用的辅料可采用本领域常规的辅料，以不和本发明组合物发生反应或不影响本发明药物的疗效为前提；所述制剂的制备方法可采用本领域常规的制备方法进行制备。

[0020] 本发明中，组合物的制备方法没有什么限制，穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物两者可以进行直接混合然后做成制剂，或分别和/或相应的辅料混合分别做成制剂，然后再按照本领域常规的方式包装在一起，或分别和相应的辅料混合然后再混合做成制剂。

[0021] 本发明中的药物组合物的给药剂量根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同可以进行适当的变化，但以保证该药物组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。

[0022] 本发明通过MTT法检测了穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物进行联合对癌症细胞增殖的影响；进一步应用等效曲线-相互指数法(Isobole-Interaction index method)评价两药的相互作用；还应用倒置显微镜观察细胞形态学变化；应用流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率；Western印迹法检测凋亡蛋白procaspase-3的表达。结果显示，本发明穿山龙提取物和哈尔满碱及哈尔满碱类衍生物组合治疗肝癌具有显著的协同效应，提高了药物的疗效，降低了给药剂量，减少了副作用的发生。

附图说明

[0023] 图1至图3所示为DNR联合哈尔满碱对HepG2细胞增殖的抑制作用；

[0024] 图4所示为DNR联合哈尔满碱对肿瘤细胞形态学的观察结果；

[0025] 图5和图6所示为DNR联合哈尔满碱对HepG2细胞凋亡的影响。

具体实施方式

[0026] 结合以下实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明并不受限于此。

[0027] 取一定量穿山龙药材粗粉，分别用浓度为60％、65％、70％、75％、80％的乙醇进行超声提取，每个浓度下分别进行了2次提取和3次提取，获得相应的提取物。分别合并提取的滤液，减压回收乙醇，干燥后得相应的粗提物。将所得粗提物用水溶解后，用石油醚萃取后弃掉石油醚萃取层，剩余水层再用乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，获得相应的穿山龙提取物(DNR)。分别对获得的提取物的活性进行考察，活性结果显示，上述提取物都具有较好的活性。为了便于后续活性实验操作和对比，本发明活性实验选取70％的乙醇提取3次后获得的提取物进行。具体见样品的提取分离部分所述。

[0028] 发明人考察了穿山龙提取物与哈尔满碱联合用药对多种有代表性的癌细胞模型的抗癌效果，如：肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌、食道癌、鼻咽癌、结肠癌等，实验结果显示，本发明穿山龙提取物与哈尔满碱联合用药对上述癌细胞都具有不同程度的协同(增强)或相加作用。为了进一步采用相互作用指数评价联合作用效果，以及验证联合用药对癌症细胞的增殖抑制作用和诱导凋亡作用，选取较常见的人肝癌细胞株HepG2细胞进行具体细胞观察实验。

[0029] 仪器：N-1100D型旋转蒸发器(日本东京理化)；Maxi-dry lyo冻干机(美国Heto-Holten公司)；CO2培养箱(美国Thermo Forma公司)；倒置显微镜(德国Leica)；全波长酶标仪(美国Thermo Forma公司)；XS105DU型电子天平(瑞士mettler toledo)；
超净工作台(美国Thermo Forma公司)；流式细胞仪(美国Beckman公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

[0030] 穿山龙(Dioscoreae nipponicae Rhizoma)购自辽宁省医药实业有限公司；哈尔满碱(美国ALDRICH，纯度98％)；石油醚(分析纯，广州化学试剂厂，批号20100901-2)；乙酸乙酯(分析纯，广州化学试剂厂，批号20100805-2)；无水乙醇(分析纯，天津市永大化学试剂有限公司，批号20100908)；胎牛牛血清(FBS，美国GIBCO公司，批号709778)；
DMEM培养基(美国Hyclone公司，批号NVM0345)；0.25％胰蛋白酶(美国GIBCO公司，批号
842964)；青霉素，链霉素(美国GIBCO公司，批号691025))；DMSO(二甲基亚砜)，MTT(四甲基噻唑蓝)，碘化吡啶(PI)(均购自美国Sigma公司)；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检验试剂盒(购自Clontech公司)；Procaspase-3(半胱天冬酶-3酶原)(购自南京凯基生物发展有限公司)；抗β-actin抗体(购自美国eBioscience)。人肝癌细胞株HepG2(购自上海细胞生物研究所细胞库)。

[0031] 样品的提取分离：取一定量穿山龙药材粗粉，用70％乙醇超声提取3次，合并滤液，减压回收乙醇，干燥后得粗提物。将所得粗提物用水溶解后，用石油醚萃取后弃之，剩余水层再用乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，得穿山龙提取物(DNR)。用DMSO溶解配成-1100mg·mL ，置于-20℃冰箱密闭避光保存。临用前用DMEM培养基稀释成所需浓度。

[0032] 细胞培养及细胞悬液的制备：人肝癌细胞株HepG2培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中，置37℃、5％CO2的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

[0033] 方法1：肿瘤细胞体外增殖抑制实验

[0034] 采用MTT法，设空白组、对照组、DNR、哈尔满碱和联合用药组，取对数生长期的细5 -1
胞1×10 个mL 接种于96孔板上，每孔接种100μL，置37℃、5％CO2的培养箱中培养24h后，弃上清，实验组每孔分别加入100μL培养液稀释的药物，继续培养48h，在终止培养前-1
4h，每孔加入10μL MTT(5g·L )，再培养4h，小心吸弃上清，并加入100μL DMSO，用振荡器混匀后，在酶标仪上用570nm，630nm处测定吸光度值(absorbance，A)。每组设4个复孔，实验重复3次。

[0035] 按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：肿瘤细胞生长抑制率(Inhibitory rate，IR)＝(1-实验组A570，630值/对照组A570，630值)×100％。

[0036] 方法2：药物联合作用评价

[0037] 采用两药相互作用指数(Interaction index，I)评价两药相互作用的性质，为了研究DNR和哈尔满碱联合用药的效果，实验分别选取DNR和哈尔满碱浓度比为4∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶4五个联合用药组，根据等效线图的方法，药物单独作用时的IC50为等效线图线X和Y轴的基点，连接两者的联线就为理论上的等效线，在线上的任何一点都代表联合用药对细胞的抑制效应都为50％。当产生协同(增强)效应时，等效线图(连接联合用药和单独用药产生50％抑制作用的点的曲线)呈凹形；当等效线图与理论等效线接近重合时，产生相加作用；当产生拮抗作用时，等效线图呈凸形。

[0038] 按下列公式计算：Ix＝ax/A+bx/B。根据活细胞数(吸光度)进行计算，ax、bx表示联合用药产生半数抑制率的药物浓度；A、B表示单独用药产生50％抑制效应时的药物浓度。当I＜1时，表示协同(增强)作用，点将落在等效曲线的下方；当I＝1时，表示相加作用，点落在等效曲线上；当I＞1时，表示拮抗作用，点落在等效曲线的上方。

[0039] 方法3：细胞形态学观察

[0040] 取对数生长期细胞于96孔板中，每孔加入1×105个mL-1细胞100μL，分别用不同浓度的DNR、哈尔满碱及联合用药组处理细胞48h，倒置显微镜下观察细胞形态学变化。

[0041] 方法4：流式细胞术检测细胞凋亡

[0042] 取对数生长期HepG2细胞，以DMEM完全培养基将细胞浓度稀释至2×105个mL-1，接种于12孔板中，每孔1mL。37℃、5％CO2条件下培养过夜贴壁。次日分组加药，实验对照组、DNR、哈尔满碱及联合用药组，每组设3个复孔培养48h、72h后，用0.25％的胰酶消化收集细胞，2000rpm离心5min弃上清，用1×binding buffer清洗细胞一次，加入200μL Buffer，按AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检验试剂盒说明，分别加入AnnexinV-FITC 5μL和PI 10μL，室温避光孵育30min，上流式细胞仪，激发波长488nm测定细胞凋亡率。

[0043] 方法5：统计学处理

[0044] 对实验数据进行统计学分析，所有数据均用 表示，用单因素方差分析进行多样本均数间的显著性检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

[0045] 实验结果如下：

[0046] DNR联合哈尔满碱对HepG2细胞增殖的抑制作用：MTT结果显示，DNR和哈尔满碱单独用药时的IC50分别为8.43μg·mL-1和13.34μg·mL-1，当两者浓度比在0.25～4∶1时，等效线图呈凹形或与理论等效线接近，相应的I＜1或I与1接近，表明两者联合用药在产生50％抑制效果时没有拮抗作用。当两者浓度比在0.5～2∶1时，等效线图呈凹形或与理论等效线接近重合，相应的I＜1或I≈1，表明两者联合用药在产生50％抑制效果时有相加或协同(增强)作用。最优选的，当浓度比为2∶1时，IC50为DNR 4.92μg·mL-1和哈尔满碱2.46μg·mL-1，等效线图呈凹形且I＝0.768＜1，表明此时DNR和哈尔满碱能协同(增强)抑制HepG2细胞的增殖，且用量分别为单独用药时的1/5，比单独用药时有极大的降低，见图1至图3和表1所示。

[0047] 图1(a)和图1(b)所示为DNR和哈尔满碱单独用药时对HepG2细胞的抑制效果，HepG2细胞被作用于不同浓度的DNR或哈尔满碱，作用时间是48小时。

[0048] 图2(a)和图2(b)所示为DNR和哈尔满碱联合用药时对HepG2细胞的抑制效果，以等体积的DNR和哈尔满碱二者浓度比为2∶1和1∶2的不同浓度的DNR和哈尔满碱作用于HepG2细胞。

[0049] 图3(a)和图3(e)所示为DNR和哈尔满碱联合用药对HepG2细胞IC50等效线图，分别以浓度比为4∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶4对HepG2细胞联合用药。对角直线反映的是DNR和哈尔满碱的IC50值，表示添加不同的固定的剂量比例的理论线。直线之下的凹形曲线表示协同(增强)作用，与直线接近重合的线表示相加作用，接近直线的凸形曲线表示非拮抗作用。

[0050] 图3(a)表示DNR/Harmane＝4∶1，图3(b)表示DNR/Harmane＝2∶1，图3(c)表示DNR/Harmane＝1∶1，图3(d)表示DNR/Harmane＝1∶2，图3(e)表示DNR/Harmane＝1∶4。

[0051] 表1所示是DNR、哈尔满碱、DNR和哈尔满碱联合用药的IC50值。

[0052] 表1、DNR、哈尔满碱、DNR和哈尔满碱联合用药对细胞的作用效果。

[0053]

[0054] 肿瘤细胞形态学观察：倒置显微镜下观察结果显示，对照组细胞生长旺盛，大小均-1一，贴壁增长呈梭行，细胞轮廓清楚，透明饱满，细胞间结构紧密。经DNR 8μg·mL 和哈-1
尔满碱4μg·mL 联合用药作用48h后，细胞密度减少，细胞呈圆形或椭圆形。并可见典型的凋亡细胞形态特征：核固缩、体积缩小。图4所示为经48h用药后肿瘤细胞的形态学-1 -1
变化(×200)，A：对照组；B：DNR(8μg·mL )；C：哈尔满碱(4μg·mL )；D：联合用药(DNR -1 -1
8μg·mL +哈尔满碱4μg·mL )

[0055] DNR联合哈尔满碱对HepG2细胞凋亡的影响：流式细胞仪结果表明，药物作用48h-1后，对照组和哈尔满碱(4μg·mL )的凋亡百分率分别为4.99％，4.52％，两组间无显著性-1
差异。DNR(8μg·mL )细胞凋亡率为42.34％，联合用药组的细胞凋亡率达到52.78％，比DNR细胞凋亡率增加10.44％，且联合用药组与单独用药组细胞凋亡率的差异有统计学意义(P＜0.05)；药物作用72h后，DNR进入晚期凋亡，哈尔满碱细胞凋亡率增加，与对照组相比，具有统计学意义(P＜0.05)，联合用药后细胞凋亡率高达96％，细胞出现大面积的晚期凋亡。见图5和图6以及表2所示。

[0056] 图5是DNR(8μg·mL-1)、哈尔满碱(4μg·mL-1)以及联合用药48小时后HepG2细-1 -1胞的凋亡情况，A：对照组；B：DNR(8μg·mL )；C：哈尔满碱(4μg·mL )；D：联合用药(DNR -1 -1
8μg·mL +哈尔满碱4μg·mL )

[0057] 图6是DNR(8μg·mL-1)、哈尔满碱(4μg·mL-1)以及联合用药72小时后HepG2细-1 -1胞的凋亡情况，A：对照组；B：DNR(8μg·mL )；C：哈尔满碱(4μg·mL )；D：联合用药(DNR -1 -1
8μg·mL +哈尔满碱4μg·mL )

[0058] 表2、DNR(8μg·mL-1)、哈尔满碱(4μg·mL-1)以及联合用药对HepG2细胞凋亡影响(n＝3， )

[0059]

[0060] *与对照组有显著性差异，P＜0.05；△与单独用药组有显著性差异，P＜0.05。

[0061] 联合用药对HepG2细胞Procaspase-3蛋白表达的影响：Caspase-3是细胞凋亡中起最终执行的重要剪切酶，它以低活性酶原procaspase-3(半胱天冬酶-3酶原)的形式合成出来，许多活细胞中都存在procaspase-3(半胱天冬酶-3酶原)的蛋白，procaspase-3被激活后转化为caspase-3，从而引发程序性细胞死亡。Western blot结果显示：-1 -1 -1
DNR(8.43μg·mL )，Harmane(13.34μg·mL )和联合用药(DNR 5.64μg·mL +Harmane -1
2.82μg·mL )对HepG2细胞凋亡作用的机理和procaspase-3表达有关。这表明影响procaspase-3蛋白的表达是其两者联合用药诱导HepG2细胞凋亡的可能机制之一。

[0062] 以上实验结果显示，FCM法检测联合用药48h，72h细胞凋亡率与单独用药相比分别增加了10.44％、50.06％，与单独用药有显著性差异(P＜0.05)。联合用药48h，细胞主要在早期凋亡，药物作用72h后95％细胞出现晚期凋亡。联合用药后显著性的抑制了肿瘤细胞的增殖，且随着作用时间的延长而增强，说明两药联合后可增强对HepG2细胞的凋亡作用。Western印迹法检测联合用药后细胞的凋亡和Procaspase-3有关，Procaspase-3被激活后转化caspase-3从而引发程序性细胞死亡。