一种pH敏感型聚电解质微囊给药载体的制备方法

摘要

本发明公开了一种pH敏感型聚电解质微囊给药载体的制备方法：将白蛋白加入氯化钙水溶液和碳酸钠水溶液中，搅拌均匀，获得白蛋白碳酸钙微粒；取白蛋白碳酸钙微粒分散在聚电解质A溶液中，室温孵育10～20min，离心，取沉淀洗涤分散在聚电解质B溶液中，室温孵育10～20min，离心，完成1次双层包衣，反复包衣3～5次，获得核壳结构的胶体微粒；(3)将核壳结构的胶体微粒用0.2mol/L的EDTA溶液溶解去核，70～80℃加热使白蛋白分子充分凝胶化，获得pH敏感型聚电解质微囊；本发明可以通过调节pH来控制该微囊对药物的负载与释放，达到智能化效果；本发明方法设计合理，制备工艺简单，具有很好的研究与应用前景。

权利要求

1.一种pH敏感型聚电解质微囊给药载体的制备方法，其特征在于所述方法为：（1）将白蛋白加入0.025 mol/L～0.33 mol/L氯化钙水溶液中使白蛋白的浓度为0.5 mg/mL～

5 mg/mL，搅拌溶解，加入与所述的氯化钙水溶液相同摩尔浓度等体积的碳酸钠水溶液，继续搅拌均匀，静置，取沉淀，干燥，获得白蛋白碳酸钙微粒；（2）取步骤（1）获得的白蛋白碳酸钙微粒按如下步骤操作①分散在0.5 mg/mL～2 mg/mL聚电解质A溶液中，室温搅拌孵育10～20min，离心分离，取沉淀洗涤，所述白蛋白碳酸钙微粒的质量用量以聚电解质A溶液的体积计为100～200mg/mL；②再将洗涤后的沉淀分散在0.5 mg/mL～2 mg/mL与聚电解质A溶液等体积的聚电解质B溶液中，室温搅拌孵育10～20min，离心分离，取沉淀洗涤，取洗涤后的沉淀即得到完成1次双层包衣的白蛋白碳酸钙微粒，③将1次包衣后的白蛋白碳酸钙微粒反复操作①与②步骤3~5次，完成多次双层包衣，离心，洗涤，获得核壳结构的胶体微粒；所述聚电解质A和聚电解质B为两种具有相反电荷的聚电解质，所述聚电解质A和聚电解质B分别为聚烯丙基胺盐酸盐、聚苯乙烯磺酸钠或壳聚糖、海藻酸钠；（3）将步骤（2）获得的核壳结构的胶体微粒用0.2 mol/L的EDTA溶液溶解去核，离心，取沉淀分散于去离子水中，70~ 80℃加热使白蛋白分子充分凝胶化，离心，沉淀即为所述pH敏感型聚电解质微囊给药载体。

2.如权利要求1所述pH敏感型聚电解质微囊给药载体的制备方法，其特征在于步骤（1）所述白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白。

3.如权利要求1所述pH敏感型聚电解质微囊给药载体的制备方法，其特征在于步骤（1）所述白蛋白在0.025 mol/L～0.33 mol/L氯化钙水溶液中的浓度为2.0 mg/mL～3.0 mg/mL。

4.如权利要求1所述pH敏感型聚电解质微囊给药载体的制备方法，其特征在于步骤（1）取沉淀方法为：反应结束后，将反应液4000~7000r/min离心5~10min，取沉淀，真空干燥

48~72h，获得白蛋白碳酸钙微粒。

5.如权利要求1所述pH敏感型聚电解质微囊给药载体的制备方法，其特征在于步骤（2）按如下步骤进行：将步骤（1）获得的白蛋白碳酸钙微粒用去离子水洗涤后按如下步骤进行：①取洗涤后的白蛋白碳酸钙微粒分散在2 mg/mL聚烯丙基胺盐酸盐水溶液中，室温搅拌孵育15min，4000 r/min离心5min，取沉淀水洗，获得水洗后的沉淀；所述白蛋白碳酸钙微粒的质量用量以聚烯丙基胺盐酸盐水溶液的体积计为100～200mg/mL；②再将水洗后的沉淀分散在与聚烯丙基胺盐酸盐水溶液等体积的2 mg/mL聚苯乙烯磺酸钠水溶液中，室温搅拌孵育15min，4000 r/min离心5min，取沉淀水洗，取水洗后的沉淀即获得完成1次双层包衣的白蛋白碳酸钙微粒，③将1次包衣后的白蛋白碳酸钙微粒反复操作①与②步骤

3~5次，完成多次双层包衣，离心，取最终包衣后的白蛋白碳酸钙微粒水洗，获得核壳结构的胶体微粒。

6.如权利要求1所述pH敏感型聚电解质微囊给药载体的制备方法，其特征在于步骤（2）按如下步骤进行：将步骤（1）获得的白蛋白碳酸钙微粒用pH值为5.0的0.2 mol/L NaCl水溶液洗涤后按如下步骤进行：①取洗涤后的白蛋白碳酸钙微粒分散在pH值为5.0的壳聚糖与0.5mol/L NaCl水溶液的混合溶液中，所述混合溶液中壳聚糖的终浓度为1mg/mL，室温搅拌孵育15min，4000r/min离心5min，取沉淀用pH值为5.0的0.2 mol/L NaCl水溶液洗涤，获得洗涤后的沉淀；所述白蛋白碳酸钙微粒的质量用量以壳聚糖和NaCl水溶液的混合溶液的体积计为100～200mg/mL；②再将洗涤后的沉淀分散在pH值为5.0的海藻酸钠与0.5 mol/L NaCl水溶液的混合溶液中，所述混合溶液中海藻酸钠的终浓度为1mg/mL，室温搅拌孵育15min，4000r/min离心5min，取沉淀用pH值为5.0的0.2 mol/L NaCl水溶液洗涤后，取沉淀即获得完成1次双层包衣的白蛋白碳酸钙微粒，所述海藻酸钠和NaCl水溶液的混合溶液的体积与壳聚糖和NaCl水溶液的混合溶液的体积相同，③将完成1次双层包衣后的白蛋白碳酸钙微粒反复操作①与②步骤3~5次，然后将最终包衣后的沉淀加入体积浓度1%的戊二醛水溶液中，室温搅拌12h，完成多次双层包衣，离心，取沉淀用pH值为5.0的0.2 mol/L NaCl水溶液洗涤，获得核壳结构的胶体微粒。

7.如权利要求1所述pH敏感型聚电解质微囊给药载体的制备方法，其特征在于步骤（3）所述核壳结构胶体微粒用0.2 mol/L的EDTA溶液去核方法为：将核壳结构胶体微粒分散在0.2 mol/L的EDTA溶液中，搅拌15~30 min，离心，取沉淀分散于0.2 mol/L的EDTA溶液重复上述操作3~5次，使碳酸钙充分溶解，离心，取沉淀用去离子水洗涤即完成去核过程。

说明书

一种pH敏感型聚电解质微囊给药载体的制备方法

(一)技术领域

[0001] 本发明涉及一种pH敏感型给药载体的制备方法，尤其涉及一种预先填充白蛋白的聚电解质微囊给药载体的制备方法。(二)背景技术

[0002] 随着医药领域的不断发展，为了提高药物的生物利用度、降低药物的毒副作用以及取得药物疗效的最大化，同时具备长循环、靶向和环境敏感等多重性质的多功能药物载体已成为近些年药剂学领域的研究热点之一。环境敏感作为一个重要的组成部分，药物被包封在此类载体中能够保护药物在血液循环中不被降解，而在特定的部位进行释放。

[0003] 层层自组装(Layer-by-layer，LBL)是将两种具有相反电荷的聚电解质囊材交替吸附在母核上，达到理想层数后选择适宜的溶剂去除母核，得到中空的聚电解质微囊的一种方法。基于层层自组装技术的聚电解质微囊在药物传递、催化、传感等多个领域已引起广泛的关注。作为药物传递载体，该微囊除了能够在纳米尺度上对微囊的大小、组成、结构、形态和囊壁厚度进行精确的控制，且制备条件温和外，其显著的优越性还在于它的多功能性以及对环境的敏感性。pH、温度、离子强度、光等均可调节其囊壁的渗透性从而控制药物的释放。但是作为药物载体，它的载药量比较低，这极大影响了它作为药物载体的发展前景。自沉积作用是指药物分子通过与预先填充在聚电解质微囊里面的聚合物的静电吸引作用而被高浓度地富集于微囊内部，从而极大地提高载药量，在聚电解质微囊的载药方面展示了独特的优势。但是如何按照需要控制这种自沉积作用以及如何释放这些被静电紧紧吸引的药物是一项挑战与意义并存的工作。

[0004] 白蛋白被认为是一种生物相容性很好的天然的脂溶性药物的载体，已经广泛应用于药物传递系统，如紫杉醇白蛋白纳米粒。牛血清白蛋白(BSA)是一种来源丰富且价格低廉的白蛋白，它的分子量约为66kD，加热至70℃左右会发生凝胶化。BSA的等电点为4.8，当pH值大于4.8时BSA带负电，而小于4.8时BSA带正电。这一特性为其应用于pH敏感型载体提供了依据。将BSA预先填充在聚电解质微囊中，再通过调整pH值改变BSA的电荷，不仅可以将药物高浓度地富集到微囊内部，而且还可以对药物的释放进行控制。(三)发明内容

[0005] 本发明目的是针对聚电解质微囊研究现状的不足，提供一种pH敏感型聚电解质微囊给药载体的制备方法。

[0006] 本发明采用的技术方案是：

[0007] 一种pH敏感型聚电解质微囊给药载体的制备方法，所述方法为：(1)将白蛋白加入0.025mol/L～0.33mol/L氯化钙水溶液中使白蛋白的浓度为0.5mg/mL～5mg/mL，搅拌溶解，在搅拌下迅速加入与所述的氯化钙水溶液相同摩尔浓度等体积的碳酸钠水溶液，继续搅拌均匀，静置，取沉淀，干燥，获得白蛋白碳酸钙微粒；(2)取步骤(1)获得的白蛋白碳酸钙微粒按如下步骤操作①分散在0.5mg/mL～2mg/mL(优选1～2mg/mL)聚电解质A溶液中，室温(20℃)搅拌孵育10～20min，离心分离，取沉淀洗涤，所述白蛋白碳酸钙微粒的质量用量以聚电解质A溶液的体积计为100～200mg/mL(即每1mL聚电解质A溶液中分散100～200mg的白蛋白碳酸钙微粒，优选100mg/mL)；②再将洗涤后的沉淀分散在0.5mg/mL～2mg/mL(优选1～2mg/mL)与聚电解质A溶液等体积的聚电解质B溶液中，室温(20℃)搅拌孵育10～20min，离心分离，取沉淀洗涤，取洗涤后的沉淀即得到完成1次双层包衣的白蛋白碳酸钙微粒，③将1次包衣后的白蛋白碳酸钙微粒反复操作①与②步骤3～5次，完成多次双层包衣，离心，洗涤，获得核壳结构的胶体微粒；所述聚电解质A和聚电解质B为两种具有相反电荷的聚电解质；(3)将步骤(2)获得的核壳结构的胶体微粒用0.2mol/L的EDTA溶液溶解去核，离心，取沉淀分散于去离子水中，70～80℃加热使白蛋白分子充分凝胶化，离心，沉淀即为所述pH敏感型聚电解质微囊给药载体。

[0008] 步骤(1)所述白蛋白为牛血清白蛋白或人血清白蛋白，优牛血清白蛋白选。

[0009] 步骤(1)所述白蛋白在0.025mol/L～0.33mol/L氯化钙水溶液中的浓度为2.0mg/mL～3.0mg/mL。

[0010] 步骤(1)取沉淀方法为：反应结束后，将反应液4000～7000r/min离心5～10min，取沉淀，真空干燥48～72h，获得白蛋白碳酸钙微粒。

[0011] 本发明所述聚电解质A和B可以是各种具有相反电荷的聚电解质，分别优选为聚烯丙基胺盐酸盐、聚苯乙烯磺酸钠；壳聚糖、海藻酸钠。

[0012] 步骤(2)所述聚电解质A为聚烯丙基胺盐酸盐，所述聚电解质B为聚苯乙烯磺酸钠。

[0013] 进一步，步骤(2)按如下步骤进行：将步骤(1)获得的白蛋白碳酸钙微粒用去离子水洗涤后按如下步骤进行：①取洗涤后的沉淀(即白蛋白酸钙微粒)分散在0.5～2mg/mL(优选2mg/mL)聚烯丙基胺盐酸盐水溶液中，室温(20℃)搅拌孵育15min，4000r/min离心5min，取沉淀水洗，获得水洗后的沉淀；所述白蛋白碳酸钙微粒的质量用量以聚烯丙基胺盐酸盐水溶液的体积计为100～200mg/mL(优选100mg/mL)；②再将水洗后的沉淀分散在与聚烯丙基胺盐酸盐水溶液等体积的0.5～2mg/mL(优选2mg/mL)聚苯乙烯磺酸钠水溶液中，室温(20℃)搅拌孵育15min，4000r/min离心5min，取沉淀水洗，取水洗后的沉淀即获得完成1次双层包衣的白蛋白碳酸钙微粒，③将完成1次包衣后的白蛋白碳酸钙微粒反复操作①与②步骤3～5次，完成多次双层包衣，离心，取最终包衣后的白蛋白碳酸钙微粒水洗，获得核壳结构的胶体微粒。

[0014] 步骤(2)所述聚电解质A为壳聚糖，所述聚电解质B为海藻酸钠。

[0015] 进一步，步骤(2)按如下步骤进行：将步骤(1)获得的白蛋白碳酸钙微粒用pH值为5.0的0.2mol/L NaCl水溶液洗涤后按如下步骤进行：①取洗涤后的沉淀(即白蛋白碳酸钙微粒)分散在pH值为5.0的壳聚糖与0.5mol/L NaCl水溶液的混合溶液中，所述混合溶液中壳聚糖的终浓度为0.5～2mg/mL(优选1mg/mL)，室温(20℃)搅拌孵育15min，4000r/min离心5min，取沉淀用pH值为5.0的0.2mol/L NaCl水溶液洗涤，获得洗涤后的沉淀；所述白蛋白碳酸钙微粒的质量用量以壳聚糖和NaCl水溶液的混合溶液的体积计为
100～200mg/mL(优选100mg/mL)；②再将洗涤后的沉淀分散在pH值为5.0的海藻酸钠与0.5mol/L NaCl水溶液的混合溶液中，所述混合溶液中海藻酸钠的终浓度为0.5～2mg/mL(优选1mg/mL)，室温(20℃)搅拌孵育15min，4000r/min离心5min，取沉淀用pH值为
5.0的0.2mol/L NaCl水溶液洗涤后，取洗涤后的沉淀即获得完成1次双层包衣的白蛋白碳酸钙微粒，所述海藻酸钠和NaCl水溶液的混合溶液的体积与壳聚糖和NaCl水溶液的混合溶液的体积相同，③将完成1次双层包衣后的白蛋白碳酸钙微粒反复操作①与②步骤3～5次，然后将最终包衣后的白蛋白碳酸钙微粒加入体积浓度1％的戊二醛水溶液中，室温搅拌
12h，完成多次双层包衣，离心，取沉淀用pH值为5.0的0.2mol/L NaCl水溶液洗涤，获得核壳结构的胶体微粒。

[0016] 步骤(3)所述核壳结构胶体微粒用0.2mol/L的EDTA溶液去核方法为：将核壳结构胶体微粒分散在0.2mol/L的EDTA溶液中，搅拌15～30min，离心，取沉淀分散于0.2mol/L的EDTA溶液重复上述操作3～5次，使碳酸钙充分溶解，离心，取沉淀用去离子水洗涤即完成去核过程。然后再将去核后的微囊(即沉淀)分散于去离子水中加热使微囊内部的白蛋白凝胶化即得所述pH敏感型聚电解质微囊给药载体。

[0017] 本发明所述pH敏感型聚电解质微囊给药载体的适用各种pH值范围，通常为2～12。

[0018] 本发明所述pH敏感型聚电解质微囊给药载体的载药量以微囊内药物浓度表示，用公式(1)计算，测试方法为：

[0019] 将所述pH敏感型聚电解质微囊(如牛血清白蛋白凝胶微囊)加入离心管中，每支7
离心管中凝胶微囊的数量为(2.5±0.3)×10 个，再加入药物溶液(如阿霉素)，室温搅拌孵育12h，离心，取上清，去离子水稀释，紫外分光光度计测定药物最大吸收波长处(如阿霉素253nm处)的吸光度值，根据所载药物(如阿霉素(DOX))的标准曲线计算上清液中药物的(如阿霉素)浓度。

[0020] Cc＝(CfVf-CsVs)/Vc 公式(1)

[0021] 公式(1)中Cc，Vc分别代表载药后微囊内的药物浓度和微囊的总体积，Cf，Vf分别代表给药浓度和给药体积，Cs，Vs分别代表上清液中药物浓度和上清液的体积。在激光共聚焦显微镜下随机选择100个微囊测量直径，求平均值，并由此计算微囊的总体积。凝胶微囊的数量通过血球计数器在显微镜下目测读数得到，取三次平均值。

[0022] 本发明所述pH敏感型聚电解质微囊给药载体的载药释放性能考察方法为：将所述pH敏感型聚电解质微囊(如牛血清白蛋白凝胶微囊)置于离心管中，每支离心管中凝胶7
微囊的数量为(2.5±0.3)×10 个，加入药物溶液(如阿霉素)，室温搅拌孵育12h后，离心，取沉淀用去离子水洗涤一次，去上清，分别往离心管中加入不同pH值(pH 2.0，5.0，7.4)的PBS缓冲液，置于37℃的恒温振荡箱中，孵育使药物释放，间隔一定时间，将凝胶微囊悬液离心，取出上清，同时加入pH值对应的等量PBS缓冲液，以保持释放体系体积不变。将上清用对应pH值的PBS缓冲液稀释，测定所载药物最大吸收波长(如阿霉素253nm)处的吸光度，根据所载药物(如DOX)的标准曲线计算上清液中药物(如阿霉素)浓度，绘制药物的累积释放曲线。每个pH条件下取三组平行实验数据的平均，绘制释放曲线。

[0023] 本发明所述室温通常为20℃。

[0024] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明将白蛋白凝胶预先填充在聚电解质微囊中，一方面，由于白蛋白是一种两性聚电解质，其所带电荷随着pH的变化而变化，因而可以通过调节pH来控制该微囊对药物的负载与释放，当白蛋白凝胶所带电荷与药物分子的电荷相反时能通过静电吸引将药物分子高浓度地富集到微囊内部，极大地提高微囊的包封率和载药量，当改变pH使白蛋白凝胶与药物分子的静电吸引作用减弱时，药物又可以较快地释放出来，从而达到智能化效果；另一方面，利用白蛋白凝胶的网状结构贮存药物，可以降低因为微囊内外药物浓度梯度过大而引起的药物突释；本发明方法设计合理，制备工艺简单，具有很好的研究与应用前景。(四)附图说明

[0025] 图1是pH敏感型聚电解质微囊给药载体的制备示意图；

[0026] 图2是实施例3异硫氰酸荧光素标记的白蛋白碳酸钙微粒的激光共聚焦显微镜(CLSM)图片(A所示)和实施例2白蛋白碳酸钙微粒扫描电子显微镜(SEM)图片(B所示)；

[0027] 图3是实施例4pH敏感型聚电解质微囊给药载体的透射电子显微镜(TEM)图片(A所示)和SEM图片(B所示)；

[0028] 图4是实施例7不同pH条件下负载阿霉素的pH敏感型聚电解质微囊给药载体的CLSM图片：pH 2.0(A所示)；pH 6.5(B所示)；

[0029] 图5是实施例7阿霉素溶液不同pH值与负载DOX后pH敏感型聚电解质微囊给*药载体内DOX浓度的关系图，横坐标为pH值，纵坐标为微囊给药载体内DOX浓度，表示P＜0.05，存在显著性差异；

[0030] 图6是实施例8不同浓度阿霉素负载后pH敏感型聚电解质微囊给药载体内DOX浓度以及上清液中DOX浓度的曲线图，横坐标为给药DOX浓度，纵坐标为测得的DOX浓度；

[0031] 图7是实施例9不同pH条件下阿霉素从pH敏感型聚电解质微囊给药载体的释放曲线图。(五)具体实施方式

[0032] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0033] 实施例1：牛血清白蛋白碳酸钙微粒的制备

[0034] 分别配制0.025mol/L的氯化钙水溶液和0.025mol/L的碳酸钠水溶液各100mL。称取50mg的牛血清白蛋白(BSA)(南京奥多福尼生物科技有限公司)溶于100mL的0.025mol/L氯化钙水溶液中，在搅拌条件下迅速加入100mL的0.025mol/L碳酸钠水溶液，继续搅拌30s，所得溶液静置10min，4000r/min离心5min，沉淀用去离子水洗涤后，真空干燥48h，即得牛血清白蛋白碳酸钙微粒约250mg。

[0035] 实施例2：牛血清白蛋白碳酸钙微粒的制备

[0036] 分别配制0.33mol/L的氯化钙水溶液和0.33mol/L的碳酸钠水溶液各100mL。称取500mg的牛血清白蛋白(BSA)(南京奥多福尼生物科技有限公司)溶于100mL 0.33mol/L氯化钙水溶液中，在搅拌条件下迅速加入100mL的0.33mol/L碳酸钠水溶液，继续搅拌30s，所得溶液静置10min，4000r/min离心5min，沉淀用去离子水洗涤后，真空干燥48h，即得牛血清白蛋白碳酸钙微粒约3.3g，牛血清白蛋白碳酸钙微粒SEM图，见图2中的B所示。

[0037] 实施例3：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的牛血清白蛋白碳酸钙微粒的制备[0038] 分别配制0.33mol/L的氯化钙水溶液和0.33mol/L的碳酸钠水溶液各100mL。称取500mg异硫氰酸荧光素(FITC)标记的牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL 0.33mol/L氯化钙水溶液中，在搅拌条件下迅速加入100mL的0.33mol/L碳酸钠水溶液，继续搅拌30s，所得溶液静置10min，4000r/min离心5min，沉淀用去离子水洗涤后，真空干燥48h，即得FITC标记的牛血清白蛋白碳酸钙微粒约3.3g，FITC标记的牛血清白蛋白碳酸钙微粒的CLSM图，见图2中的A所示。

[0039] 实施例4：pH敏感型聚电解质微囊给药载体—牛血清白蛋白凝胶微囊的制备[0040] 将聚烯丙基胺盐酸盐(PAH)和聚苯乙烯磺酸钠(PSS)分别用去离子水溶解，配制成2mg/mL的PAH水溶液和2mg/mL的PSS水溶液。称取实施例2制备的约100mg干燥的牛血清白蛋白碳酸钙微粒，用去离子水洗涤，4000r/min离心5min，沉淀重复洗涤3次，将洗好后的微粒(沉淀)分散在1mL上述PAH水溶液中室温(20℃)孵育15min，然后4000r/min离心5min，去上清液，取沉淀再用去离子水洗涤后离心，重复3次，再将洗涤3次后的微粒(沉淀)分散在1mL上述PSS水溶液中室温(20℃)孵育15min，4000r/min离心5min，去除上清，取沉淀用去离子水洗涤后离心，重复3次，取沉淀即获得完成1次双层包衣的白蛋白碳酸钙微粒，重复上述包衣4次，即得核壳结构的胶体微粒。向上述核壳结构的胶体微粒中加入0.2mol/L EDTA水溶液，搅拌15min，离心，取沉淀再次分散于0.2mol/L的EDTA水溶液重复上述操作3次，取沉淀用去离子水洗涤3次，即得填充牛血清白蛋白分子的聚电解质微囊。最后，将填充牛血清白蛋白分子的聚电解质微囊分散于去离子水中，80℃搅拌加热1h，使白蛋白分子充分凝胶化，离心，沉淀即为预先填充牛血清白蛋白凝胶的聚电解质微囊，我们简称为“牛血清白蛋白凝胶微囊”，即pH敏感型聚电解质微囊给药载体，制备示意图见图1所示。

[0041] 实施例5：pH敏感型聚电解质微囊给药载体--牛血清白蛋白凝胶微囊的制备[0042] 将壳聚糖(CTS)和海藻酸钠(ALG)分别用0.5mol/L NaCl水溶液溶解，分别得到CTS终浓度1mg/mL的CTS-NaCl水溶液和ALG终浓度1mg/mL的ALG-NaCl水溶液，并分别用0.1mol/L HCl水溶液或0.1mol/L NaOH水溶液调节pH值为5.0。

[0043] 称取实施例2制备的约100mg干燥的牛血清白蛋白碳酸钙微粒，用0.2mol/L NaCl水溶液(pH 5.0)洗涤，4000r/min离心5min去上清，重复3次。将洗好后的牛血清白蛋白碳酸钙微粒分散在1mL上述CTS-NaCl水溶液中室温(20℃)孵育15min，然后4000r/min离心5min，去除上清液，取沉淀再用0.2mol/LNaCl水溶液洗涤后离心，重复3次，再将洗涤后的微粒(沉淀)分散在1mL上述ALG-NaCl水溶液中室温(20℃)孵育15min，离心去除上清，取沉淀用0.2mol/L NaCl水溶液洗涤后离心，重复3次，取沉淀即获得完成1次双层包衣的白蛋白碳酸钙微粒，重复上述包衣4次，再向上述最终包衣的胶体微粒中加入1mL体积浓度1％戊二醛水溶液，室温(20℃)搅拌反应12h使壳聚糖交联，完成4次包衣，4000r/min离心5min去上清，沉淀用去离子水洗涤3次，即得核壳结构的胶体微粒。然后，向上述核壳结构的胶体微粒中加入0.2mol/LEDTA水溶液，搅拌30min，离心，取沉淀再次分散于0.2mol/L的EDTA水溶液重复上述操作3次，离心去上清，沉淀用去离子水洗涤3次，得填充牛血清白蛋白的聚电解质微囊。最后，将填充牛血清白蛋白的聚电解质微囊分散于去离子水中，80℃搅拌加热1h，使白蛋白分子充分凝胶化，获得牛血清白蛋白凝胶微囊，即pH敏感型聚电解质微囊给药载体。

[0044] 实施例6：牛血清白蛋白碳酸钙微粒及pH敏感型聚电解质微囊给药载体的表征[0045] (1)将实施例2制备的牛血清白蛋白碳酸钙微粒置于去离子水中制成悬液，将悬液滴于盖玻片上，自然干燥，喷金，采用扫描电子显微镜(SEM)(SIRION，FEI，Netherlands)进行观察，结果见图2中B所示；将实施例3制备的用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的牛血清白蛋白碳酸钙微粒置于去离子水中制成悬液，将悬液滴在载玻片上，立即用盖玻片封片，在激光共聚焦显微镜(LSM 510 META，ZEISS，Germany)下观察，结果见图2中A所示；

[0046] (2)将实施例4制备的牛血清白蛋白凝胶微囊(pH敏感型聚电解质微囊给药载体)与去离子水混合，制成悬液并滴于含有碳膜的铜网上，自然干燥，在透射电镜(TEM)(JEM 1230，JEOL，Japan)下观察其形态，结果见图3中A所示；将实施例4制备的牛血清白蛋白凝胶微囊水悬液滴于盖玻片上，自然干燥，喷金，采用扫描电子显微镜(SEM)(SIRION，FEI，Netherlands)进行观察，结果见图3中所示B。

[0047] 实施例7 牛血清白蛋白凝胶微囊在不同pH条件下的载药行为考察

[0048] 精密称取适量阿霉素(DOX)，分别以不同pH值(2.0，4.0，5.0，6.5)的PBS缓冲液为溶剂，超声溶解，配成浓度均为1000μg/mL的DOX溶液(pH值分别为2.0，4.0，5.0，6.5)。

[0049] 分别往4支离心管中加入实施例4制备的等量牛血清白蛋白凝胶微囊，每支离心7
管中凝胶微囊的数量为(2.5±0.3)×10 个，再分别往其中加入500μL 1000μg/mL上述配好的不同pH值的DOX溶液(pH值分别为2.0，4.0，5.0，6.5)，室温(20℃)搅拌孵育12h，离心，取200μL上清，去离子水稀释至10mL，用紫外分光光度计测定253nm处的吸光度值。
每组pH条件下的实验重复3次，取均值，根据DOX的标准曲线计算上清液中阿霉素浓度。

[0050] DOX的标准曲线方程同样采用253nm处的吸光度值获得：分别配制5μg/mL，7μg/mL，10μg/mL，12μg/mL，17μg/mL系列浓度的DOX水溶液，紫外分光光度计测定253nm处的吸光度值，以吸光度值对DOX浓度进行线性回归，得标准曲线方程为：y＝0.0402x+0.023(r＝0.9998)。

[0051] 牛血清白蛋白凝胶微囊的载药量以微囊内阿霉素浓度表示，用公式(1)计求算：

[0052] Cc＝(CfVf-CsVs)/Vc 公式(1)

[0053] 公式(1)中Cc，Vc分别代表载药后微囊内的DOX浓度和微囊的总体积，Cf，Vf分别代表给药浓度和给药体积，Cs，Vs分别代表上清液的DOX浓度和上清液的体积。在激光共聚焦显微镜下随机选择100个微囊测量直径，求平均值，并由此计算微囊的总体积。凝胶微囊的数量通过血球计数器在显微镜下目测读数得到，取三次平均值。

[0054] 结果表明，牛血清白蛋白凝胶微囊对DOX的负载能力随DOX溶液pH增大而显著增强，在pH 2.0，5.0，6.5条件下均存在显著性差异，结果见图5。

[0055] 此外，pH对牛血清白蛋白凝胶微囊的载药行为存在显著影响还通过CLSM进行了直观的验证：将pH 2.0和pH 6.5条件下载入DOX后的微囊进行CLSM观察，在pH 2.0条件下DOX主要吸附在微囊表面，微囊内部未见DOX的红色荧光，见图4中A所示；而在pH 6.5条件下DOX却能大量沉积在微囊内部，见图4中B所示。这主要是因为DOX带正电，而BSA在pH 2.0时带正电，在pH 6.5时带负电，BSA与DOX之间的静电作用是DOX负载的主要驱动力。

[0056] 实施例8 牛血清白蛋白凝胶微囊对不同浓度DOX溶液的载药行为考察[0057] 根据实施例7实验结果，我们选择pH 6.5为负载条件。

[0058] 精密称取适量DOX，pH 6.5的PBS缓冲液为溶剂，超声溶解，配成50μg/mL，100μg/mL，250μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL系列浓度的DOX溶液，其他操作和条件同实施例7，考察不同DOX浓度条件下的负载行为。

[0059] 结果表明随着DOX溶液浓度的增加微囊内DOX浓度不断增大，并且在所有的浓度条件下微囊内DOX浓度总是比上清液中DOX的浓度高数十倍至百倍，结果见图6，显示了明显的自沉积作用。

[0060] 实施例9 载DOX的牛血清白蛋白凝胶微囊在不同pH条件下的释放性能考察[0061] 分别往3支离心管中加入实施例4方法制备的等量牛血清白蛋白凝胶微囊，凝胶7
微囊数量为(2.5±0.3)×10 个，3支离心管中分别加入0.5mL浓度为1000μg/mL的DOX溶液(pH值为6.5，配制方法同实施例7)，室温(20℃)搅拌孵育12h后，离心，取沉淀用去离子水洗涤一次，去上清，往3支离心管中分别加入1mL PBS缓冲液(pH＝7.4，5.0，2.0)，置于37℃的恒温振荡箱中，振荡孵育使药物释放，间隔不同时间点(15min、30min、45min、1h、
2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h)，将凝胶微囊悬液离心，取出800μL上清，同时加入pH值对应的800μL 37℃的PBS缓冲液，以保持释放体系体积不变。将800μL上清用对应pH值的PBS缓冲液稀释到3mL，测定在253nm处的吸光度，绘制阿霉素的累积释放曲线。每个pH条件下取三组平行实验数据的平均，结果见图7。

[0062] 图7结果表明，随着释放介质pH值的降低，DOX的释放速率显著增大。这主要是因为pH降低导致BSA的正电荷逐步减少，使得BSA与DOX之间的静电吸引作用逐渐降低。