一种磷光铱配合物及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种磷光铱配合物及其制备方法与应用。该磷光铱配合物的化学式为：[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6，其中pba表示4-(2-吡啶基)苯甲醛，DMSO表示二甲亚砜；其结构式如式(I)所示；本发明提供的磷光铱配合物的制备方法包括如下步骤：结构式如式(II)所示配合物与二甲亚砜进行反应；向所述反应后的反应体系中加入六氟磷酸钾经搅拌即得产品；本发明还提供了上述磷光铱配合物在检测谷氨酰胺中的应用。本发明提供的铱配合物能够实现谷氨酰胺的高选择性、高灵敏度检测，为构建一种高选择性、高灵敏度检测谷氨酰胺的荧光化学传感器提供了可能；且本发明提供的磷光铱配合物对细胞内的谷氨酰胺具有较强的染色功能，有望用于生理、病理过程中的Gln的检测。

权利要求

1.一种磷光铱配合物，其化学式为：[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6，其中pba表示4-（2-吡啶基）苯甲醛，DMSO表示二甲亚砜；

所述磷光铱配合物的结构式如式（Ⅰ）所示，

2.权利要求1所述磷光铱配合物的制备方法，包括如下步骤：结构式如式（Ⅱ）所示配合物与二甲亚砜进行反应；

向所述反应后的反应体系中加入六氟磷酸钾经搅拌即得产品；

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：式（Ⅱ）所示配合物与二甲亚砜的摩尔份数比为1：（3～5）。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述反应的温度为110℃～150℃；

所述反应的时间为2小时～4小时。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：式（Ⅱ）所示配合物与六氟磷酸钾的摩尔份数比为1：（4～6）。

6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：式（Ⅱ）所示配合物是按照包括如下步骤的方法制备的：三水合三氯化铱与4-（2-吡啶基）苯甲醛在乙二醇乙醚和水的混合溶液中进行反应即得。

说明书

一种磷光铱配合物及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种磷光铱配合物及其制备方法与应用。

背景技术

[0002] 谷氨酰胺(Glutamine，简称Gln)是哺乳动物体内含量最丰富的氨基酸之一，正常人血浆中浓度为0.6～0.9mmol/L，占血浆总游离氨基酸的20％，占机体内总游离氨基酸的60％。1935年，Kerbs首次发现哺乳动物肾脏合成和分解Gln的能力，强调“多数氨基酸都有多种功能，但Gln的功能是最丰富的。”Eagle(H.Eagle.J.Biol.Chem.1955，214，839-852)、Windmueller(H.G. Windmueller.Advanced in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology.1982，53，210-237)、Kapadia(C.R.Kapadia，M.F.Colpoys，Z.M.Jiang，D.J.Johnson，R.J.Smith，D.W. Wilmore.J.Parenter. Enter. Nutr.1985，
9，583-589)、Alverdy(J.C.Alverdy.J.Parenter. Enter.Nutr. 1990，14，S109-S113)、Souba(W. W. Souba.Ann. Surg.1993，218，715-728；217，655-667)分别指出培养的哺乳动物细胞需要Gln，并强调Gln是一种重要的营养素，是合成氨基酸、蛋白质、核酸和许多其他生物分子的前体物质，不仅在肝、肾、小肠和骨骼肌代谢中起重要调节作用，而且也是机体内各器官转运氨基酸和氮的主要载体，是生长迅速细胞的主要燃料。Gln作为一种特殊的营养物质，已经引起人们普遍关注，并成为近几年来的研究热点。1998年，Pittner等人发展了一种基于酶联免疫间接检测细胞培养基中谷氨酰胺含量的流动注射方法；1998年，Hernandez等报导了一种基于毛细管区域电泳-激光诱导荧光方法检测甲流患者脑脊液中的谷氨酰胺含量，但这些方法均存在操作繁琐、仪器价格昂贵、检测限高等缺点。

[0003] 磷光金属配合物(ReI、RuII、OsII、RhIII、IrIII)等一般具有独特的d6、d8、d10电子结构，重金属原子之间能够发生自旋耦合，使单重态和三重态混杂，三重态激子的对称性被破坏，衰减变快，发生金属-配体电荷转移(MLCT)，同时使得单重态也具有某些三重态性质，衰减时间变长，提高了从单重态到三重态系间蹿跃(ISC)效率，从而发出高效磷光。与有机荧光染料相比，磷光重金属配合物具有较大的Stokes位移和较长的发射寿命，其长的发射寿命有利于使用时间分辨技术使磷光信号与背景的荧光信号相区分。

[0004] 在常见的几种重金属配合物中，IrIII配合物由于磷光寿命相对较短、发光量子产率高、发光颜色在整个可见区域可调等优点在电致发光、荧光探针、生物成像等领域备受关III注，因此，有必要对Ir 配合物进行进一步研究。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种磷光铱配合物及其制备方法与应用。

[0006] 本发明提供的一种磷光铱配合物，其化学式为：[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6，其中pba表示4-(2-吡啶基)苯甲醛，DMSO表示二甲亚砜；

[0007] 所述磷光铱配合物的结构式如式(I)所示，

[0008]

[0009] 本发明还提供了上述磷光铱配合物的制备方法，包括如下步骤：

[0010] 结构式如式(II)所示配合物(化学式为[(pba)2Ir(μ-Cl2)Ir(pba)2]，pba表示4-(2-吡啶基)苯甲醛)与二甲亚砜进行反应；

[0011] 向所述反应后的反应体系中加入六氟磷酸钾经搅拌即得产品；

[0012]

[0013] 上述的制备方法中，式(II)所示配合物与二甲亚砜的摩尔份数比可为1∶(3～5)，如1∶5。

[0014] 上述的制备方法中，所述反应的温度可为110℃～150℃，如120℃；所述反应的时间可为2小时～4小时，如2小时。

[0015] 上述的制备方法中，式(II)所示配合物与六氟磷酸钾的摩尔份数比可为1∶(4～6)，如1∶4。

[0016] 上述的制备方法中，式(II)所示配合物可按照包括如下步骤的方法制备：三水合三氯化铱与4-(2-吡啶基)苯甲醛在乙二醇乙醚和水的混合溶液中进行反应即得，乙二醇乙醚和水的体积份数比可为3∶1，具体可在回流条件下反应24小时。

[0017] 本发明还提供了上述磷光铱配合物在检测谷氨酰胺中的应用；所述应用中，可在二甲亚砜和磷酸盐缓冲溶液中对谷氨酰胺进行检测，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值可为7.0，浓度为50mM。

[0018] 本发明提供的磷光铱配合物，在365nm紫外灯照射下发橙光，最大发射波长位于557nm左右；常温条件下，该铱配合物与谷氨酰胺作用一段时间后(谷氨酰胺既能III与Ir 配位，形成一个五元环结构，而且也能与配体上的-CHO形成氢键，实现金属和配体之间的能量转移)，能够发出较亮的蓝光，其最大发射峰位于475nm，其发射强度较[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6配合物提高了近100倍；相同条件下，其它氨基酸和含谷氨酰胺残基的多肽(如：精氨酸、组氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷胱甘肽、L-丙-谷二肽)与该铱配合物作用后，其发射强度没有明显的变化，因而本发明提供的铱配合物能够实现谷氨酰胺的高选择性、高灵敏度检测，为构建一种高选择性、高灵敏度检测谷氨酰胺的荧光化学传感器提供了可能；且本发明提供的磷光铱配合物对细胞内的谷氨酰胺具有较强的染色功能，有望用于生理、病理过程中的Gln的检测。

附图说明

[0019] 图1为本发明提供的铱配合物与不同氨基酸作用后于365nm紫外灯照射下的图像，其中，图1(a)为本发明提供的铱配合物与不同氨基酸作用后于365nm紫外灯照射图，图1(b)为本发明铱配合物与谷氨酰胺作用前后于365nm紫外灯照射图。

[0020] 图2为本发明提供的铱配合物与不同氨基酸作用后的发射光谱图。

[0021] 图3为本发明提供的铱配合物与谷氨酰胺作用后的循环伏安图。

[0022] 图4为本发明提供的铱配合物与谷氨酰胺作用后的激光共聚焦成像，其中，图4(a)为Hela细胞的激光共聚焦成像，图4(b)为Hela细胞经[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6配合物孵育后的激光共聚焦成像，图4(c)为Hela细胞经[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6配合物和谷氨酰胺的混合溶液孵育后的激光共聚焦成像。

具体实施方式

[0023] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0024] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0025] 式(I)所示磷光铱配合物的制备及其应用

[0026] 1、式(II)所示配合物[(pba)2Ir(μ-Cl2)Ir(pba)2]的制备

[0027] 参照文献(W. Tan，Q.Zhang，J.J.Zhang，H.Tian.Org.Lett.2009，11，161-164)。

[0028] 称取1mmol的IrCl3·H2O和2.5mmol 4-(2-吡啶基)苯甲醛溶于乙二醇乙醚和水的混合溶液中(体积比3∶1)，加热、搅拌回流24h，得黄色沉淀；抽滤干燥即得[(pba)2Ir(μ-Cl2)Ir(pba)2]。

[0029] 1H NMR(300MHz CDCl3)δppm：9.52(s，4H；CHO)，9.27(dd，4H)，8.06(d，4H)，7.94(dt，4H)，7.68(d，4H)，7.31(dd，4H)，6.98(dt，4H)，6.37(d，4H)。MALDI-TOF 质 谱 m/+ +
z[M]：556.62{[Ir(pba)2]}。

[0030] 2、式(I)所示磷光铱配合物[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6的制备

[0031] 称 取0.085g(0.079mmol)[(pba)2Ir(μ-Cl2)Ir(pba)2]和30mL DMSO反 应，其中，[(pba)2Ir(μ-Cl2)Ir(pba)2]与DMSO的摩尔比为1∶5，加热至120℃并保持反应2h，得黄色溶液，冷却至室温，再加入六氟磷酸钾，加入的六氟磷酸钾与[(pba)2Ir(μ-Cl2)Ir(pba)2]的摩尔比为4∶1，搅拌1h，然后抽滤、减压蒸馏；固体以二氯甲烷与丙酮(体积比15∶1)为洗脱剂，用硅胶柱分离，即得式(I)所示橙红色固体[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6，产率：65.8％。

[0032] 1HNMR(300MHz，DMSO-d6，TMS)δppm：9.88(s，2H；CHO)，9.58(s，2H)，8.49(d，2H)，8.25(t，2H)，8.00-8.07(m，4H)，7.74(t，1H)，7.64(t，1H)，7.47(m，1H)，7.43(m，2H)，+ +
6.75(s，1H)，2.51(s，4H)。MALDI-TOF质谱m/z[M]：556.62{[Ir(pba)2]}。元素分析：理论计算值(按C28H28IrN2S2O4·H2O·CH2Cl2计算)：C：42.66；N：3.44；H：3.92；实测值：C：42.99；
N：3.29；H：3.89。

[0033] 3、式(I)所示磷光铱配合物[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6和不同氨基酸分子的相互作用[0034] 将制备的[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6固体粉末溶于DMSO溶液中，并用DMSO/(磷酸盐缓冲溶液，PBS(pH 7.0，50mM))(体积比1∶49)稀释，最终制备浓度为10μM的Ir配合物溶液，再加入等体积、等浓度的不同氨基酸(终浓度为500μM)，常温反应两天，然后对其分别进行光物理性质的测定。

[0035] 测试结果如图1和2所示，与[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6配合物溶液相比，当加入谷氨酰胺后，溶液呈现出较强的蓝光，发射波长由557nm蓝移至475nm，荧光强度增加近100倍，磷光寿命也由100ns缩减至7ns，这是由于谷氨酰胺取代DMSO后，该配合物三重态激发转变为单重态激发，激发态电子返回基态的时间大大缩短；相同条件下，其它氨基酸及含谷氨酰胺残基的多肽(如：精氨酸、组氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷胱甘肽和L-丙-谷二肽)与[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6配合物作用后，其发射强度没有明显的变化，因而本发明提供的铱配合物探针能够实现谷氨酰胺的高选择性和高灵敏度检测；由上述实验可知，本发明提供的铱配合物对谷氨酰胺的最低测定限可达500nmol/L。

[0036] 4、式(I)所示磷光铱配合物[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6的电化学测试

[0037] 采用三电极体系，玻碳电极为工作电极，铂电极为辅助电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极为参比电极，溶剂：无水乙腈，支持电解质：六氟磷酸四丁基胺，采用循环伏安法在电化学工作站(CHI 660B)上完成。

[0038] 测试结果如图3所示，从图中可以看出[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6配合物在+1.22V(vsAg/AgCl，饱和KCl)附近出现良好的氧化还原可逆峰，且氧化还原峰峰电位差值ΔE＝67mV，基本接近于理论值59mV。加入谷氨酰胺后，氧化峰峰电流有明显增加，而还原峰峰电流几乎保持不变，这也从另一个角度说明该铱配合物与谷氨酰胺之间存在相互作IV III用，而峰电流变化不一致的可能原因是氧化态Ir 和还原态Ir 与谷氨酰胺配位能力不同，氧化态铱配合物从溶液本体扩散到电极表面的扩散系数变快，从而导致氧化还原峰峰电流变化不一致。

[0039] 5、式(I)所示磷光铱配合物[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6的细胞毒性试验

[0040] 本发明实验采用的细胞均为Hela细胞(宫颈癌细胞)，购于北京协和医院。

[0041] 制备不同浓度(10、20、40、60、80、100μM)的[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6配合物溶液，待细胞在96孔板里贴壁生长5～6小时后，用PBS溶液清洗两次，再各加100μL不同浓度的[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6溶液孵育2h，再用PBS溶液清洗两次，最后加CCK-8染色试剂，2小时后在酶标仪上测吸光度变化。

[0042] 实验结果显示，Hela细胞在浓度为10μM和20μM的[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6配合物溶液中孵育2h后，细胞活力仍可达95％及90％以上，说明本发明提供的铱配合物具有低毒性。

[0043] 6、式(I)所示磷光铱配合物[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6的激光共聚焦成像

[0044] 将[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6配合物溶解在DMSO/PBS(体积比1∶49)(pH 7.0，50mM)中，在PBS中加入终浓度为10μM的该配合物溶液孵育Hela细胞2h后，用PBS溶液清洗两次，然后在奥林巴斯FV1000激光扫描共聚焦显微镜下于405nm激发，采集440～480nm范围内的发射光。

[0045] 结果如图4所示，细胞自荧光较弱，当加入[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6溶液孵育一段时间后，细胞质部分发光变强；且加入[Ir(pba)2(DMSO)2]PF6和Gln的混合溶液孵育一段时间后，细胞质部分荧光变得更亮，说明本发明提供的铱配合物能够通过细胞膜进入细胞，对细胞内的谷氨酰胺具有较强的染色功能，对生物成像及研究生理、病理过程中谷氨酰胺的变化具有重要的意义。