一类三萜类化合物、其制备方法及用途

摘要

本发明涉及一类从中药两头尖中得到的化合物、其制备方法及用途，所述化合物为三萜类化合物及其药学上可接受的盐；涉及该类化合物的制备方法及其药物组合物，以及所述化合物用于制备抗癌药物的用途，特别是用于白血病、肺癌、结肠癌、肝癌、肉瘤等癌症的治疗。

权利要求

1.一类如下式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：

2_1 3_1 6_1 4_1

其中，R1=-ara rha Glc，R2=-glc glc rha或-H。

2.一种权利要求1化合物的制备方法，包括下列步骤：

1)将两头尖或粉碎后的两头尖加乙醇进行提取，得提取液；

2)将提取液过滤，浓缩至无醇，得浓缩液；

3)将浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得正丁醇萃取液；

4)将正丁醇萃取液浓缩后，经柱层析，高压液相制备即得。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其中乙醇浓度的体积百分比范围是40％-95％。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其中柱层析所用介质可以是硅胶、氧化铝、大孔树脂。

5.一种药物组合物，含有权利要求1所述任一化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

6.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐、权利要求5所述药物组合物在制备抗癌药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其中的癌为白血病、肺癌、结肠癌、肝癌、肉瘤。

说明书

一类三萜类化合物、其制备方法及用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一类从中药两头尖中得到的化合物、其制备方法及用途，所述化合物为三萜类化合物及其药学上可接受的盐；涉及该类化合物的制备方法及其药物组合物，以及所述化合物用于制备抗癌药物的用途，特别是用于白血病、肺癌、结肠癌、肝癌、肉瘤等癌症的治疗。

背景技术

[0002] 中药两头尖为毛茛科植物多被银莲花(Anemone raddeana Regel.)的根茎，始载于明代刘文泰所著《本草品汇精要》。临床上具有祛风湿、消痈肿的作用，用于治疗风湿寒痹，四肢拘挛，痈肿溃烂等疾病。本发明所涉及的化合物为三萜类化合物。

[0003] 三萜类化合物是广泛存在自然界的一类有机化合物，具有广泛的生物活性，如抗炎【Chikako M，Kiyomi I，Mitsuru H.Biochim Biophys Acta(BBA)，2002，1596：193-200】、抗菌【Angeh JE，Huang X.J Ethnopharmacol，2007，110(1)：56-60】、抗病毒【Gong YH，Raj KM.Antiviral Research，2004，64：127-130】、抗癌等活性。3β-trans-sinapoyloxylup-20(29)-en-28-ol对人类肺癌Lu1、直肠癌Co12、前列腺癌LNCaP及KB等具有细胞毒【Bang YH，Chai HB，Phytochemistry，2003，62：197-201】；从植物Coussarea brevicaulis Krause茎中分离出的Coussaric acid对老鼠的肝细胞瘤的代谢酶具有明显的诱导作用【SuBN，Kang YH，Rosa EP.Phytochemistry，2003，64：293-302】。

发明内容

[0004] 本发明经过广泛的植物抗癌活性筛选，首次发现中药两头尖中含有的一类三萜类化合物的抗癌活性。

[0005] 第一个方面，本发明涉及一类如下式(I)的化合物或其药学上可接受的盐[0006]

[0007] 其中，R1＝-ara2-1rha3-1Glc，R2＝-glc6-1glc4-1rha或-H。

[0008] 第二个方面，本发明涉及上述化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，包括下列步骤：

[0009] 1)将两头尖或粉碎后的两头尖加乙醇进行提取，得提取液；

[0010] 2)将提取液过滤，浓缩至无醇，得浓缩液；

[0011] 3)将浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得正丁醇萃取液；

[0012] 4)将正丁醇萃取液浓缩后，经柱层析，高压液相制备即得。

[0013] 其中乙醇浓度的体积百分比范围是40％-95％，柱层析所用介质可以是硅胶、氧化铝、大孔树脂。

[0014] 第三个方面，本发明涉及一种药物组合物，含有任一式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。所述式(I)化合物的理化性质与波谱数据如下：

[0015] 化合物A(R1＝-ara2-1rha3-1Glc，R2＝H)：白色粉末，分子式C47H76O17，ESI-MS1 13 1 1
分子量912，综合分析 HNMR、CNMR、H-H COSY、HSQC、HMBC等，确认该化合物为：27-羟基-3-O-β-D-葡萄糖(1-3)-α-L-鼠李糖(1-2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸。

[0016] 化合物B(R1＝-ara2-1rha3-1Glc，R2＝-glc6-1glc4-1rha)：白色粉末，分子式1 13 1 1
C65H106O31，ESI-MS分子量1382，综合分析 HNMR、CNMR、H-H COSY、HSQC、HMBC等，确认该化合物为：27-羟基-3-O-β-D-葡萄糖(1-3)-α-L-鼠李糖(1-2)-α-L-阿拉伯糖齐墩果酸
28-O-α-L-鼠李糖(1-4)-β-D-葡萄糖(1-6)-β-D-葡萄糖苷。

[0017] 表1化合物A和B的氢谱数据(C5D5N)

[0018]

[0019] 表2化合物A和B母核的碳谱数据(C5D5N)

[0020]

[0021] 表3化合物A和B的糖部分碳谱数据(C5D5N)

[0022]

[0023]

[0024] 第四个方面，本发明涉及所述化合物或其药学上可接受的盐及第三方面中所述药物组合物在制备抗癌药物中的用途。其中的癌为白血病、肺癌、结肠癌、肝癌、肉瘤。

[0025] 经动物实验证实，本发明涉及的化合物A、B对癌症小鼠具有明显的治疗作用。

[0026] 而且，本发明的化合物A、B对正常细胞没有细胞毒作用。

[0027] 本发明涉及的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，均可以单独或与其他抗癌药物联合使用。

[0028] 本发明的药物组合物含有任一式(I)化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受载体或赋形剂，所述的载体或赋形剂包括药剂学常规应用的载体和赋形剂，如填充剂、黏合剂、防腐剂、矫味剂、稀释剂、着色剂等。按照药剂学领域的常规方法，本发明的式(I)化合物或其药学上可接受的盐，均可以制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊、注射剂等。

[0029] 按照本领域普通技术人员的理解，化合物A、B的给药剂量应根据治疗对象的年龄、体重和疾病严重程度等因素而定，一般可以是30mg/d。

附图说明

[0030] 附图1：化合物A的1H-NMR图谱

[0031] 附图2：化合物A的13C-NMR图谱

[0032] 附图3：化合物A的ESI-MS图谱

[0033] 附图4：化合物A的1H-1H COSY图谱

[0034] 附图5：化合物A的HSQC图谱

[0035] 附图6：化合物A的HMBC图谱

[0036] 附图7：化合物B的1H-NMR图谱

[0037] 附图8：化合物B的13C-NMR图谱

[0038] 附图9：化合物B的ESI-MS图谱

[0039] 附图10：化合物B的1H-1H COSY图谱

[0040] 附图11：化合物B的HSQC图谱

[0041] 附图12：化合物B的HMBC图谱

具体实施方式

[0042] 下面的实施例、实验例将对本发明做更详细的说明，它们并不构成对本发明的限制。除非特别言明，本发明中所有百分比均为体积百分比。

[0043] 中药两头尖(中国药典)：石家庄乐仁堂有限公司

[0044] 柱层析硅胶(300-400目)：青岛海洋化工厂

[0045] 薄层层析用硅胶板及色谱纯乙腈：默克公司

[0046] HPLC：Waters 996

[0047] HPLC色谱柱：Phenomenex 250×21.2mm，10um

[0048] INVOA 500型核磁共振波谱仪(Volian公司)，TMS为内标

[0049] ZMD Micromass型质谱仪：英国Micromass公司

[0050] CO2恒温细胞培养箱：美国SHELLAN公司

[0051] PMI1640培养液：GIBCO公司

[0052] MTT：Sigma公司

[0053] 人白血病细胞K562：美国菌种保藏中心

[0054] 人肺癌细胞A549：美国菌种保藏中心

[0055] 人结肠癌细胞HCT-15：美国菌种保藏中心

[0056] 人胚肝细胞株L02：中国科学院上海细胞生物学研究所

[0057] Victor 2 1420多标计数仪：美国PE公司

[0058] 实施例

[0059] 实施例1：式(I)化合物的制备

[0060] 将中药两头尖2.5公斤，粉碎后，用4倍80％乙醇加热回流提取，提取2次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩至无醇，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取2次，浓缩正丁醇萃取液得浸膏，用水溶解过AB-8大孔树脂，用40％乙醇洗脱4个柱体积后用80％乙醇洗脱，80％乙醇洗脱液浓缩得后再经硅胶柱层析，氯仿-甲醇-水(7∶3∶1体积比)洗脱，收集2倍柱体积洗脱液，浓缩，经HPLC制备(62％乙腈-水)得化合物A(Rt＝
13.5min，60mg)。收集4倍柱体积洗脱液浓缩，浓缩，经HPLC制备(25％乙腈-水)得化合物B(Rt＝10.5min，55mg)。

[0061] 实验例

[0062] 实验例1：MTT法体外抑瘤实验

[0063] 实验材料：K562，A549，HCT-15。

[0064] 采用常规MTT法。收集处于对数生长期的上述各肿瘤细胞，用0.25％的胰蛋白酶5
消化细胞，然后用10％的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1.0×10/ml，接种于96孔细胞培养板，每孔100ul，分别加入不同浓度的化合物A、B，阴性对照药为磷酸盐缓冲液。每组均设3个复孔。置于37℃，5％CO2培养箱中培养72h，于培养结束前4h，各培养孔加入10ul MTT(5mg/m1)，培养结束后，吸去培养上清，每孔加入10％的SDS 100ul，震荡10min，使结晶物充分溶解，放置过夜，最后用酶标仪于490nm波长处测定各孔OD值，进行细胞增殖分析，统计数据并进行t检验。

[0065] 实验结果显示，本发明所述提取物以及式(I)所示化合物A、B对K562，A549，HCT-15细胞生长有明显的抑制作用。它们对肿瘤细胞的IC50值见下表：

[0066] 本发明提取物以及化合物A、B对肿瘤细胞的IC50值(IC50：ug/ml)

[0067]

[0068] 实验例2：肝癌小鼠体内抑瘤实验

[0069] 实验材料：BALb/c纯系小鼠，雄性8-12周龄，体重20-22g，购自河北医科大学实验动物中心。H-22肝癌小鼠，购自河北医科大学实验动物中心。

[0070] 实验方法：无菌抽取荷H-22肝癌小鼠第7天腹水，用生理盐水稀释10倍，于受试小鼠右前肢腋窝皮下注射0.2ml。随机分成5组，每组动物10只，同时记录每组小鼠体重。设生理盐水组和顺铂阳性对照组，化合物A、B给药剂量均为5.0mg/Kg，于接种后次日连续腹腔注射给药8天，第9天脱颈椎处死动物，记录小鼠体重，解剖取出瘤块，称重，根据下式计算抑瘤率。

[0071]

[0072] 实验结果：本发明所述提取物以及式(I)所示化合物A、B对H-22肝癌小鼠的肿瘤生长具有一定的抑制作用，而对小鼠的体重无明显影响。

[0073] 本发明化合物对H-22肝癌小鼠(BALb/c小鼠)的抑瘤率

[0074]

[0075] **：与空白对照组相比P＜0.01；*：与空白对照组相比P＜0.05

[0076] 实验例3：S180肉瘤小鼠体内抑瘤实验

[0077] 实验材料：小鼠S180，河北医科大学。清洁级昆明种小鼠，雄性，体重18-22g，购自河北省实验动物中心。顺铂，山东省德州制药厂生产。

[0078] 实验方法：采用昆明种小鼠皮下接种S-180肉瘤模型。瘤种体外培养至对数生长6
期，记数，调节细胞数为6×10 个/ml，接种于小鼠右前肢腋下，每只0.2ml，随机分成5组，每组动物10只，同时记录每组小鼠体重。设生理盐水组和顺铂空白对照组和阳性对照组，受试化合物设5.0mg/Kg剂量组，于接种后次日连续腹腔注射给药8天，第9天脱颈椎处死动物，记录小鼠体重，解剖取出瘤块，称重，根据下式计算抑瘤率。

[0079]

[0080] 实验结果：本发明所述提取物以及式(I)所示化合物A、B对S180小鼠肉瘤的生长具有明显的抑制作用，而对小鼠体重无明显影响。

[0081] 化合物A、B对昆明种S180肉瘤小鼠的抑瘤率

[0082]

[0083] **：与空白对照组相比P＜0.01；*：与空白对照组相比P＜0.05

[0084] 实验例4：LDH法细胞毒性测定

[0085] LDH法细胞毒性检测原理：LDH(乳酸脱氢酶)是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH即被释放到细胞外；通过检测细胞培养上清中LDH的酶活性，来检测细胞毒性。

[0086] 具体的测定过程：用含5％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞L02调整到4 5
5×10 ～2×10/ml；在96孔圆底细胞培养板中加入L02细胞，每孔加100μl，置37℃5％CO2的二氧化碳培养箱中培养4～6小时；然后加入被测化合物，保温24小时，每个实验设置三个复孔；取上清，用LDH试剂盒测定，在酶联检测仪上测定各孔的光密度(OD值)，检测波长492nm，参考波长650nm。测定结果显示：化合物A、B在0.04-100ug/ml浓度下对正常细胞L02没有细胞毒作用。