水稻稻曲病菌毒素UstiloxinA的提取纯化方法

摘要

本发明涉及一种水稻稻曲病菌毒素UstiloxinA的提取纯化方法，本发明涉及一种稻曲病菌毒素A的制备纯化方法，从稻曲球或稻曲病菌毒素培养物中提取毒素，发明中所使用的提取液为2%甲酸溶液，所用净化小柱为阳离子交换柱；采用半制备型高效液相色谱仪进行分离，分离条件：流动相为甲醇与水体积比为2:8的混合液、流速为1.5ml/min，检测波长为254nm；采用薄层层析进一步纯化，展层剂为二氯甲烷与甲醇体积比为7:3的混合液。本发明突破毒素来源的限制，步骤简便效率高，所得稻曲病菌毒素UstiloxinA纯度大于90%，可做标品使用。

权利要求

1.一种水稻稻曲病菌毒素Ustiloxin A的提取纯化方法，其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行：a)取稻曲球粉末或稻曲病菌毒素培养物粉末，加入其重量1/5的PEG，再加入其重量

4-5倍的2%甲酸溶液，置于摇床，摇床条件为室温、200转/分钟，30分钟后取出，转速为

8000转/分钟离心10分钟，取上清液；

b)滤渣中加入其重量等体积的甲醇，同上摇床条件，15分钟后取出，同上条件离心10分钟，取上清液；

c)合并步骤a和步骤b的上清液，蒸发浓缩获得毒素的粗提取液1；

d)先后用甲醇和5N 的氢氧化钠冲洗平衡阳离子交换柱，当溶剂液面到达氨基柱吸附层表面时，立即加入步骤c获得的毒素的粗提取液1，控制流速在1滴/秒，再先后用1/5样品体积的5%氨水和甲醇分别淋洗阳离子交换柱，最后以1/5样品体积的甲醇洗脱液洗脱下目标毒素，旋转蒸发浓缩获得粗毒素干粉；所述的甲醇洗脱液为含有5%甲酸的甲醇；

e)将粗毒素干粉溶于干粉重量10-20倍的甲醇溶剂中，通过半制备型高效液相色谱仪的分离，对照稻曲病菌毒素Ustiloxin A标样峰值的保留时间收集得到毒素的粗提取液2；

所述的甲醇溶剂中甲醇与水的体积比为2:8，所述的半制备型高效液相色谱仪的分离条件为：流动相为所述的甲醇溶剂、流速为1.5ml/min，检测波长为254nm；

f)将步骤e获得的毒素的粗提取液2与稻曲病菌毒素Ustiloxin A标样分别均匀点在硅胶GF254薄层层析板的下端，将层析板放入层析缸中，于展层剂中展开，直至展层剂跑至距层析板顶端2厘米处，拿出层析板，晾干；展层剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，二氯甲烷与甲醇的体积比为7:3；

g)于紫外灯下照射，对照稻曲病菌毒素Ustiloxin A的标样，挖下与标样在同一位置的条带；

h)将硅胶放入甲醇中浸泡，摇床15分钟后取出，室温、10000转/分钟离心，取上清，旋转蒸发浓缩，即得含量大于90%的稻曲病菌毒素Ustiloxin A。

2.根据权利要求1所述的水稻稻曲病菌毒素Ustiloxin A的提取纯化方法，其特征在于：步骤a中所述的稻曲球粉末是这样获得的：在发生稻曲病的水稻生长后期，从水稻穗部采摘墨绿色或棕黄色的球状物即为稻曲球，晾干，磨成粉末，过20目筛，获得稻曲球粉末，于-20℃保藏备用。

3.根据权利要求1所述的水稻稻曲病菌毒素Ustiloxin A的提取纯化方法，其特征在于：步骤a中所述的稻曲病菌毒素培养物粉末是这样获得的：首先取适量稻米，浸泡过夜，

121℃ 20分钟高压灭菌；然后按5%的接种量接入活化的稻曲病菌菌丝，28℃-30℃黑暗光照交替培养20-25天，获得稻曲病菌毒素培养物；再将稻曲病菌毒素培养物低温烘干，磨成粉末，过20目筛，获得稻曲病菌毒素培养物粉末，于-20℃保藏备用。

说明书

水稻稻曲病菌毒素Ustiloxin A的提取纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种提取并纯化稻曲病菌毒素Ustiloxin A的方法。

背景技术

[0002] 稻曲病是一种世界性水稻真菌病害，其病原菌Ustilaginoidea virens 侵染水稻穗部产生稻曲球。近年来，随着水稻栽培模式的改变，稻田氮肥施用量的增加，加上新型高产密穗型杂交稻的大面积推广，稻曲病的发生日趋严重。稻曲病不仅严重影响水稻的产量，更为严重的是稻曲病菌能产生对人畜有害的稻曲病菌毒素。

[0003] 稻曲病菌毒素Ustiloxins是一类抗真核细胞有丝分裂的杂环肽，包含一个13员环，环中有一个乙醚键。1994，Koisoetal等首次国从稻曲球中分离得到了6种毒素，分别为Ustiloxin A、Ustiloxin B、Ustiloxin C、Ustiloxin D、Ustiloxin F和Ustiloxin E，并鉴定了其分子式与化学结构。其中Ustiloxin A的含量最为丰富且活性最强。

[0004] Suwa(1915)首先报道了稻曲球的水提液对兔子的毒性，Nakamura(1992)等报道食用了被稻曲病菌毒素污染的饲料能引起动物严重的肝肾疾病（代谢紊乱），1993通过电镜组织化学证明稻曲病菌毒素可引起老鼠肝、肾和尿道细胞凋亡和前胃溃疡.Koiso等(1994)发现，用Ustiloxin A进行一次性注射，可以使小鼠离体的肝细胞和肾管状细胞急剧坏死，并能遏制器官细胞有丝分裂或引起不正常的有丝分裂，这与用秋水仙素处理引起的症状相似。黄世文(2002)报道用稻曲病粒拌饲料喂家兔、白洛克小公鸡和本地母鸡，经35-84d喂饲，可引起死亡和内脏器官病变；用带稻曲病菌的谷糠喂猪，母猪出现产死胎、干尸胎和畸形胎等。随后大量研究结果表明，稻曲病菌毒素能够阻止微管蛋白的聚合反应，干扰细胞骨架的形成，并且对现有的微管蛋白具有解聚作用，继而抑制细胞的的有丝分裂，但它或由于不能穿透细胞膜而不具备细胞毒性，因而不会影响细菌或真菌的生长。目前研究认为，Ustiloxin A和Ustiloxin B还能够抑制多种人类肿瘤细胞的有丝分裂，对植物和动物细胞都有广泛的生物活性。

[0005] 随着近年来稻曲病的发生越来越重，对稻曲病菌毒素研究也相继广泛开展，科研领域对稻曲病菌毒素标准品的需求量也越来越大，然而目前市场上并没有稻曲病菌毒素的标准品出售，这给科学研究带来了极大的不便。查阅相关文献，目前只有日本东京大学的Kobayashi 博士从稻曲球中分离纯化到了稻曲病菌毒素，该方法利用稻曲球作为毒素的来源，采用C18小柱、硅胶柱等多步净化手段，步骤比较繁琐、耗时。

[0006] 稻曲病菌毒素的种类目前共鉴定有6种，然而稻曲病菌毒素Ustiloxin A是其中含量最多、活性最大的一种毒素，因此，本发明专利针对这一实际问题，建立一种新的，能够大规模、安全、高效的在实验室提取纯化稻曲病菌毒素Ustiloxin A的方法，具有重要的研究意义和应用价值。

[0007] 发明内容：

[0008] 本发明的目的在于：针对目前市场上没有稻曲病菌毒素Ustiloxin A标准品出售，而现有的稻曲病菌毒素Ustiloxin A提取方法比较复杂等一系列现实问题，提供一种在实验室能够大规模、安全、高效的提取纯化稻曲病菌毒素Ustiloxin A的方法。

[0009] 本发明的目的是这样实现的：一种水稻稻曲病菌毒素Ustiloxin A的提取纯化方法，其特征在于，该方法按下列步骤顺序进行：

[0010] a)取稻曲球粉末或稻曲病菌毒素培养物粉末，加入其重量1/5的PEG，再加入其重量4-5倍的2%甲酸溶液，置于摇床，摇床条件为室温、200转/分钟，30分钟后取出，转速为8000转/分钟离心10分钟，取上清液；

[0011] b)滤渣中加入其重量等体积的甲醇，同上摇床条件，15分钟后取出，同上条件离心10分钟，取上清液；

[0012] c)合并步骤a和步骤b的上清液，蒸发浓缩获得毒素的粗提取液1；

[0013] d)先后用甲醇和5N 的氢氧化钠冲洗平衡阳离子交换柱，当溶剂液面到达氨基柱吸附层表面时，立即加入步骤c获得的毒素的粗提取液1，控制流速在1滴/秒，再先后用1/5样品体积的5%氨水和甲醇分别淋洗阳离子交换柱，最后以1/5样品体积的甲醇洗脱液洗脱下目标毒素，旋转蒸发浓缩获得粗毒素干粉；所述的甲醇洗脱液为含有5%甲酸的甲醇；

[0014] e)将粗毒素干粉溶于干粉重量10-20倍的甲醇溶剂中，通过半制备型高效液相色谱仪的分离，对照稻曲病菌毒素Ustiloxin A标样峰值的保留时间收集得到毒素的粗提取液2；所述的甲醇溶剂中甲醇与水的体积比为2:8；

[0015] f)将步骤e获得的毒素的粗提取液2与稻曲病菌毒素Ustiloxin A标样分别均匀点在硅胶GF254薄层层析板的下端，将层析板放入层析缸中，于展层剂中展开，直至展层剂跑至距层析板顶端2厘米处，拿出层析板，晾干；

[0016] g)于紫外灯下照射，对照稻曲病菌毒素Ustiloxin A的标样，挖下与标样在同一位置的条带；

[0017] h)将硅胶放入甲醇中浸泡，摇床15分钟后取出，室温、10000转/分钟离心，取上清，旋转蒸发浓缩，即得含量大于90%的稻曲病菌毒素Ustiloxin A。

[0018] 在本发明中，步骤a中所述的稻曲球粉末是这样获得的：在发生稻曲病的水稻生长后期，从水稻穗部采摘墨绿色或棕黄色的球状物即为稻曲球，晾干，磨成粉末，过20目筛，获得稻曲球粉末，于-20℃保藏备用。

[0019] 在本发明中，步骤a中所述的稻曲病菌毒素培养物粉末是这样获得的：首先取适量稻米，浸泡过夜，121℃ 20分钟高压灭菌；然后按5%的接种量接入活化的稻曲病菌菌丝，28℃-30℃黑暗光照交替培养20-25天，获得稻曲病菌毒素培养物；再将稻曲病菌毒素培养物低温烘干，磨成粉末，过20目筛，获得稻曲病菌毒素培养物粉末，于-20℃保藏备用。

[0020] 在本发明中，步骤e中所述的半制备型高效液相色谱仪的分离条件为：流动相为所述的甲醇溶剂、流速为1.5ml/min，检测波长为254nm。

[0021] 在本发明中，步骤f中的展层剂为二氯甲烷与甲醇的混合液，二氯甲烷与甲醇的体积比为7:3。

[0022] 本发明的优点在于：除了可以从田间采摘的稻曲球中提取毒素，更可以利用稻米培养基使稻曲病菌在实验室条件下产毒，避免了稻曲球的采摘受时间、发病程度等限制，从而限制了毒素提取的来源。

[0023] 本发明的优点还在于：与现有的技术方法采用C-18柱进行净化不同的是，本发明采用阳离子交换柱对毒素进行净化处理，能够得到纯度更高、杂质更少的毒素粗提液，方便了进一步的纯化。

[0024] 本发明的优点还在于：采用半制备液相色谱与薄层层析相连用的纯化方法，使得到的毒素纯度更高，并且方便浓缩，与现有技术相比，具有效率高、安全性高、纯度高，所得毒素的纯度经HPLC-UV/DAD检测达到90%以上，可做标准样品。

[0025] 本发明的优点还在于：填补国内空白，为大规模、安全、高效的在实验室提取纯化稻曲病菌毒素Ustiloxin A建立了可行的方法。

附图说明

[0026] 图1 稻曲病菌毒素Ustiloxin A标准样品的高效液相色谱图；

[0027] 图2 从稻曲球中提取稻曲病菌毒素Ustiloxin A的高效液相色谱图；

[0028] 图3 从人工接种稻米培养物中提取稻曲病菌毒素Ustiloxin A的高效液相色谱图。

具体实施方式

[0029] 实施例1

[0030] 标样高效液相色谱图的获得方法

[0031] 本发明所用毒素Ustiloxin A标准品对照为日本东京大学的Kobayashi 博士赠送。

[0032] 将稻曲病菌毒素Ustiloxin A的标准品用甲醇溶剂配成终浓度为2ppm的标准溶液，利用半制备型高效液相色谱仪的分离，分离条件为：流动相为所述的甲醇溶剂（甲醇与水的体积比为2:8）、流速为1.5ml/min，检测波长为254nm。在8.98分钟出现目标峰（图1），前面在3.553分钟出现的峰为溶剂峰，以此标准毒素的保留时间为下面提取毒素的定性参照。

[0033] 实施例2

[0034] 稻曲球是这样获得的：

[0035] 在水稻生长后期于水稻田中（有稻曲病发生的田块），在水稻穗部采摘墨绿色或棕黄色的球状物即稻曲球，晾干，磨成粉末，过20目筛，获得稻曲球粉末，于-20℃保藏备用。

[0036] 实施例3

[0037] 从稻曲球粉末中提取纯化稻曲病菌毒素Ustiloxin A的方法：

[0038] 溶液的配置

[0039] 甲醇洗脱液：由甲醇和甲酸复配，洗脱液中含有5%的甲酸，余量为甲醇。

[0040] 甲醇溶液：甲醇用水稀释，稀释时甲醇与水的体积比为2:8。

[0041] 展层剂：由二氯甲烷与甲醇复配，二氯甲烷与甲醇的体积比为7:3。

[0042] 提取纯化方法：

[0043] a)取实施例2获得的稻曲球粉末加入10g的PEG，再加入200ml的2%甲酸溶液，置于摇床，摇床条件为室温、200转/分钟，30分钟后取出，转速为8000转/分钟离心10分钟，取上清液。

[0044] b)滤渣中再加入50ml的甲醇，同上摇床条件，15分钟后取出，同上条件离心10分钟，取上清液。

[0045] c)合并步骤1和步骤2的上清液，蒸发浓缩获得50ml毒素的粗提取液1。

[0046] d)先后用甲醇和5N 的氢氧化钠各10ml冲洗平衡阳离子交换柱，当溶剂液面到达氨基柱吸附层表面时，立即加入步骤C获得的毒素的粗提取液1，控制流速在1滴/秒，再先后用10ml的5%氨水和甲醇分别淋洗阳离子交换柱，最后以10ml甲醇洗脱液洗脱下目标毒素，旋转蒸发浓缩获得粗毒素干粉。

[0047] e)取粗毒素干粉5mg溶于50ml的甲醇溶液中，通过半制备型高效液相色谱仪的分离，分离条件为：流动相为甲醇溶液、流速为1.5ml/min，检测波长为254nm，对照稻曲病菌毒素Ustiloxin A标样峰值的保留时间收集得到毒素的粗提取液2。

[0048] f)将获得的毒素的粗提取液2与稻曲病菌毒素Ustiloxin A标样分别均匀点在硅胶GF254薄层层析板的下端的同一直线处，将层析板放入层析缸中，于展层剂中展开，直至展层剂跑至距层析板顶端2厘米处，拿出层析板，晾干。

[0049] g)于紫外灯下照射，对照稻曲病菌毒素Ustiloxin A标样，挖下与稻曲病菌毒素Ustiloxin A标样在同一位置的条带。

[0050] h)将硅胶放入30ml甲醇中浸泡，摇床15分钟后取出，室温、10000转/分钟离心，取上清，旋转蒸发浓缩，得到稻曲病菌毒素Ustiloxin A。

[0051] 利用实施例1相同的方法，获得从稻曲球粉末中提取稻曲病菌毒素Ustiloxin A的高效液相色谱图（见图2）。

[0052] 纯度经高效液相色谱串联质谱及核磁共振鉴定分析，测得稻曲病菌毒素Ustiloxin A的含量为94%。

[0053] 实施例4

[0054] 稻曲病菌毒素培养物粉末是这这样获得的：

[0055] 取浸泡过夜好的稻米100g，置于三角瓶，121℃高压灭菌20分钟。将稻曲病菌从冷藏斜面转接到PDA培养基平板上活化，28℃-30℃黑暗光照交替培养7-10天，由于该病菌气生菌丝生长不繁盛，取菌落1/4接种于步骤1的三角瓶中，28℃-30℃黑暗光照交替培养20-25天，获得稻曲病菌毒素培养物。再将获得的稻米培养物低温烘干，磨成粉末，过20目筛，既得稻曲病菌毒素培养物粉末，于-20℃保藏备用。

[0056] 实施例5

[0057] 从稻曲病菌毒素培养物粉末中提取纯化稻曲病菌毒素Ustiloxin A的方法：

[0058] 本实施例与实施例3的区别仅止于：步骤a是用实施例4获得的稻曲病菌毒素培养物粉末直接替换了实施例3中采用的实施例2获得的稻曲球粉末。整个提取纯化过程均与实施例3相同。

[0059] 利用实施例1相同的方法，获得从稻曲病菌毒素培养物粉末中提取稻曲病菌毒素Ustiloxin A的高效液相色谱图（见图3）。

[0060] 本实施例得到稻曲病菌毒素Ustiloxin A，纯度经高效液相色谱串联质谱及核磁共振鉴定分析，测得稻曲病菌毒素Ustiloxin A的含量为94%。