中华鲟抗菌肽及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种中华鲟抗菌肽及其制备方法和应用，具体是指一种新的中华鲟天然抗菌肽pen-hepcidin和编码该基因的氨基酸序列，以及该蛋白在制备治疗感染性疾病药物和饲料添加剂中的应用。本发明用RT-PCR方法，从中华鲟血液总RNA中克隆获得该抗菌肽基因pen-hepcidin，其DNA序列如序列表中SEQ ID：1序列所示。该基因编码的蛋白(pen-hepcidin)，其氨基酸序列如序列表SEQ ID：3序列所示。经氨基酸序列分析，在目前的蛋白质数据库内没有发现有与该抗菌肽相似的蛋白质多肽，属于一种新型的抗菌肽。本发明的抗菌肽对部分革兰氏阳性菌和阴性菌均具有抑菌活性，且对耐药菌株也有明显的作用，可用于制备治疗感染性疾病的药物或作为抗菌饲料添加剂等应用。

权利要求

1.一种中华鲟抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

2.编码权利要求1所述中华鲟抗菌肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1所述的中华鲟抗菌肽在制备治疗葡萄球菌属、大肠杆菌属、链球菌属、气单胞菌属感染性疾病的药物中的应用。

说明书

中华鲟抗菌肽及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，涉及一种新天然抗菌肽，具体是指一种中华鲟抗菌肽及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 抗菌肽是一类小分子多肽，一般由小于100个氨基酸残基组成，大多数带有一定量的正电荷。抗菌肽具有抑制细菌、真菌、原生生物(Nicolas et al.，1995)及抗病毒(Mohan et al.，2010)、抗肿瘤(Papo et al.，2005)等活性，是一类广谱抗菌多肽，并对真核细胞无毒。目前抗菌肽成为近年来研究的新热点，研究的内容包括：抗菌肽的分离与纯化，氨基酸序列的分析，抗菌肽在各个组织中的表达水平，蛋白质构型与功能的关系，抗菌肽的作用机理(Cammue et al.，1994；Cuesta et al.，2008)，动植物转抗菌肽基因工程(李文楚等，1996)，改造合成抗菌肽基因并应用基因工程表达抗菌肽基因。

[0003] 抗菌肽由于具有独特的杀菌机制，稳定的理化性质，广谱抗菌活性，不容易产生耐药性等特点，被认为是抗菌药物的潜在替代品，存在于动物体上的抗菌肽是免疫系统的重要组成部分，具有重要的生物学作用，主要表现在具有广谱抗菌活性、抗病毒作用、抗原虫作用、抗肿瘤活性、免疫佐剂等几个方面。

[0004] 抗菌肽具有广谱抗菌活性。大量的研究报道了抗菌肽的抗菌功能，几乎所有的抗菌肽对一些革兰氏阳性菌和阴性菌都有抑制作用。抗菌肽的氨基酸带有正电荷，而细菌细胞膜脂质富含磷脂首基而带有负电荷，因此抗菌肽可以选择性的吸附在细菌细胞膜表面，降解细胞膜，已经证明抗菌肽epinecidin-1及其类似的合成物，可以破坏革兰氏阴性菌外膜(Pan et al.，2009)。研究表明，合成的epinecidin-1，TH1-5和TH2-3多肽可以降解鸭疫里默氏杆菌的外膜(Pan et al.，2010)。

[0005] 日本比目鱼hepcidin的研究结果表明26个氨基酸的JF2短肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和格氏乳球菌具有抗菌活性，但对迟缓爱德华氏菌没有抗菌活性；另一个19个氨基酸的JF1短肽没有表现出抗菌活性(Hirono et al.，2005)。表达罗非鱼肝脏抗菌多肽(TH)2-3的转基因斑马鱼，可以抵抗革兰氏阴性菌海洋弧菌的感染(Hsieh et al.，2010)。在罗非鱼，大西洋鲑和其他一些种类的鱼上发现了编码hepcidin多拷贝的区域(Douglas et al.，2003；Huang et al.，2007)。除此之外，细菌内毒素和脂多糖(LPS)能够诱导THs，TH2-3基因的表达，但是却不能诱导TH1-5，TH2-2基因的表达(Huang et al.，2007)，可能是hepcidin的多拷贝在鱼类进化过程中演变为不同的功能，而hepcidin在哺乳动物中主要参与铁离子调控和宿主防御。与哺乳动物不同的是，JF1的功能可能是铁离子调控，JF2的功能可能是抗菌，当然还需要进一步的研究证实这个假说。目前，蛋白质数据库内没有发现有关与中华鲟天然抗菌肽相似的蛋白质多肽。

发明内容

[0006] 本发明的目的就是要提供一种中华鲟抗菌肽和编码该氨基酸的基因序列，以及从中华鲟血液总RNA中克隆获得该抗菌肽基因pen-hepcidin及其重组表达蛋白的方法和该蛋白多肽在制备治疗感染性疾病药物和抗菌饲料添加剂中的应用。

[0007] 本发明通过以下技术方案实现：本发明提供的一种中华鲟抗菌肽，其特殊之处在于：其核苷酸序列如序列表SEQ NO：1所示；插入载体的核苷酸序列如序列表SEQ NO：2所示；其氨基酸序列如序列表SEQNO：3所示；其扩增pen-hepcidin基因的引物，它的DNA序列如下所示：

[0008] 正向引物：5′ACAYCAGAACWAACAYTC3′，

[0009] 反向引物：5′CYACTTTTAYAAGGCWTA3′。

[0010] 作为优选方案，其DNA序列及其编码的氨基酸序列如下：

[0011] DNA序列：GAA TTC AGC AGA ACG AAC ACT CGA CAG AAA CAACAG AAA CAC AGG GAC AAA CAA ATC CCC TGG CAT TTT TCA GGACAA AAC GTC AAA GCC ATC TTT CCC TGT GCA GAT ACT GCT GCAACT GCT GTC GTA ACA AAG GCT GTG GAT ATT GCT GTA AAT TAA[0012] 编码的相应氨基酸序列：

[0013] SRTNTRQKQQKHRDKQIPWHFSGQNVKAIFPCADTAATAVVTKAVDIAVN

[0014] 本发明还提供一种制备中华鲟抗菌肽核苷酸的方法，其特殊之处在于它包括以下步骤：

[0015] (1)设计PCR引物，所述的引物对的DNA序列如下：

[0016] 正向引物：5′ACAYCAGAACWAACAYTC3′，

[0017] 反向引物：5′CYACTTTTAYAAGGCWTA3′；

[0018] (2)提取中华鲟血液总RNA，反转录后进行PCR扩增，PCR产物纯化和测序，获得如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

[0019] 本发明还提供一种中华鲟抗菌肽的应用，其特殊之处在于所述的中华鲟抗菌肽在制备治疗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌或耐药菌株感染性疾病的药物中或者作为饲料添加剂的应用。

[0020] 本发明使用的微生物：

[0021] 巴斯德毕赤氏酵母GS115/pPICZαA-pen-hepcidin Pichiapastoris GS115/pPICZαA-pen-hepcidin，已于2012年1月11日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为NO.M2012007。

[0022] 本发明用RT-PCR方法，从中华鲟血液总RNA中克隆获得该抗菌肽基因pen-hepcidin及其重组表达蛋白。

[0023] 根据序列的保守性，设计一对兼并引物(F1，R1)；表达引物(F2，R2)加入EcoR I和Not I酶切位点，并在下游引物中加入终止密码子。引物设计如下：

[0024] F1：5’-ACAYCAGAACWAACAYTC-3’

[0025] R1：5’-CYACTTTTAYAAGGCWTA-3’

[0026] F2：5’-CGGAATTCAYCAGAACWAACAYTCG-3’

[0027] EcoR I

[0028] R2：5’-TAGCGGCCGCTTAATTTACAGCAATATCCAC-3’

[0029] Not I

[0030] 用表达引物(F2，R2)对重组质粒进行PCR扩增，目的片段与表达载体pPICZαA都经过限制性内切酶EcoR I和Not I分步双酶切，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌TOP10，构建真核重组表达质粒pPICZαA-抗菌肽，并送华大基因公司测序鉴定。

[0031] 重组表达质粒pPICZαA-抗菌肽通过BstX I单酶切线性化、电泳，纯化回收酶切产物。电转化感受态的毕赤酵母工程菌GS115，转化后涂布含ZeocinTM培养基，筛选具有高抗性的转化子。先用BMGY培养液(含甘油)激活培养约24h，OD600值达2-6时，收集菌液，换BMMY培养液，在28℃，250rpm条件下开始甲醇诱导表达。每隔24h，向锥形瓶中加入终浓度为0.8％的甲醇，并补充适量的无菌水，同时诱导pPICZαA空载体酵母菌。72h后收集上述甲醇诱导表达后的上清液，用饱和度为85％的硫酸铵浓缩酵母诱导菌表达上清，对重组酵母菌表达上清液进行抑菌活性、抑菌效价和热稳定性测定，初步判断中华鲟抗菌肽的生物活性。

[0032] 本发明的抗菌肽对部分革兰氏阳性菌和阴性菌均具有抑菌活性，且对耐药菌株也有明显的作用，可用于制备治疗感染性疾病的药物或作为饲料添加剂等应用。

附图说明

[0033] 图1：是本发明中华鲟抗菌肽pen-hepcidin基因RT-PCR扩增产物。

[0034] 图2：是本发明中重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌抑菌活性测定

[0035] 图3：是本发明中重组抗菌肽对大肠杆菌抑菌活性测定

[0036] 图4：是本发明中重组抗菌肽对无乳链球菌抑菌活性测定

[0037] 图5：是本发明中重组抗菌肽对温和气单胞菌抑菌活性测定

[0038] 图6：是本发明中重组抗菌肽对嗜水气单胞菌抑菌活性测定

[0039] 图7：是本发明中核苷酸序列的序列表SEQ NO：1

[0040] 图8：是本发明中插入载体的核苷酸序列的序列表SEQ NO：2

[0041] 图9：是本发明中氨基酸序列的序列表SEQ NO：3

[0042] 图中：图1中M：DL2000DNA标准；1、2：中华鲟抗菌肽pen-hepcidin扩增产物。

[0043] 图2中重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌抑菌活性测定：1：氨苄青霉素10μg；2：pPICZ αA酵母转化子诱导产物；3：pPICZ αA-pen-hepcidin转化子诱导产物I；4：
pPICZαA-pen-hepcidin转化子诱导产物II。

[0044] 图3中重组抗菌肽对大肠杆菌抑菌活性测定：1：氨苄青霉素10μg；2：pPICZαA酵母转化子诱导产物；3：pPICZαA-pen-hepcidin转化子诱导产物I；4：
pPICZαA-pen-hepcidin转化子诱导产物II。

[0045] 图4中重组抗菌肽对无乳链球菌抑菌活性测定：1：氨苄青霉素10μg；2：pPICZαA酵母转化子诱导产物；3：pPICZαA-pen-hepcidin转化子诱导产物I；4：
pPICZαA-pen-hepcidin转化子诱导产物II。

[0046] 图5中重组抗菌肽对温和气单胞菌抑菌活性测定：1：氨苄青霉素10μg；2：pPICZαA酵母转化子诱导产物；3：pPICZαA-pen-hepcidin转化子诱导产物I；4：
pPICZαA-pen-hepcidin转化子诱导产物II。

[0047] 图6中重组抗菌肽对嗜水气单胞菌抑菌活性测定：1：氨苄青霉素10μg；2：pPICZαA酵母转化子诱导产物；3：pPICZαA-pen-hepcidin转化子诱导产物I；4：
pPICZαA-pen-hepcidin转化子诱导产物II。

具体实施方式

[0048] 实施例1：中华鲟抗菌肽基因的克隆

[0049] (1)引物设计

[0050] 根据NCBI/GenBank上已登录鱼类hepcidin序列信息，根据序列的保守性，用Primer 5.0软件在cDNA序列ORF的上下游区域，设计一对兼并引物(F1，R1)；F1：5’-ACAYCAGAACWAACAYTC-3’

[0051] R1：5’-CYACTTTTAYAAGGCWTA-3’。

[0052] (2)Trizol法提取血液总RNA

[0053] 从中华鲟尾动脉用无菌一次性注射器吸取血液，常温静置一段时间后，常温下1000rpm离心30min，弃上清液，沉淀即为血细胞。

[0054] 实验用的玻璃器皿经0.1％的DEPC水处理，150℃烘烤4h。塑料器皿经0.1％DEPC水浸泡过夜，121℃、20min高温高压灭菌。金属用具经1mol/L的NaOH浸泡2h，经0.01％的DEPC水彻底冲洗后，37℃烘干。各试剂用无RNase的0.01％DEPC水配置。总RNA抽提按Trizol说明书进行。

[0055] (3)cDNA第一条链的合成及PCR扩增

[0056] 1)反转录合成第一链，以提取的中华鲟血液总RNA为模板进行反转录，反应体系为40μL，即：

[0057]

[0058] 70℃下10min，立即冰浴冷却，之后分别加入：

[0059]

[0060] 2)混匀，反转录反应条件为：42℃下20min，70℃下15min，4℃保存。

[0061] 3)PCR扩增目的基因，以反转录产物(cDNA)为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL，即：

[0062]

[0063] 4)混匀。PCR扩增反应条件为：94℃下预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为94℃下变性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min；循环结束后在72℃下再延伸10min。

[0064] 5)扩增完成后，取PCR产物5μL用6×核酸上样缓冲液点样，1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE，120V，电泳20min观察结果。

[0065] (4)目的基因的克隆与筛选

[0066] 取pMD19-T载体1μL(50ng/uL)与胶回收的目的片段3μL混合后，加入6μL Sultion I，混匀后置16℃连接过夜。取10μL连接产物，无菌条件下加入大肠杆菌TOP10感受态细胞中，用移液器温和反复吹打混匀，冰浴放置30min。42℃水浴，热激90s，之后立即冰浴3min使之冷却，注意不要晃动。转移菌液至装有500μL预热至37℃的LB培养液中，150rpm 37℃温和振荡45min，使细菌恢复抗药性。向含AMP(100μg/mL)的LB琼脂平板上加入40μL X-gal(20mg/mL)、4μLIPTG(200mg/mL)，均匀涂布，37℃放置半小时后，取150μL菌液涂布于平板上。倒置平皿于37℃恒温培养箱培养12-16h，置于4℃使蓝色充分显现，挑白色菌落接种于含150μg/mLAMP的LB培养液中，剧烈振摇(230rpm)12-16h后鉴定。将PCR扩增为阳性的克隆，取菌液送华大基因生物工程技术服务公司，用双脱氧链终止法测序。得到一条长度为327bp的CDS序列。

[0067] (5)DNA序列同源性检索鉴定

[0068] 通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网 站 的 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件对所测抗菌肽氨基酸序列进行分析。用DNAstar软件包里的Megalign软件，通过ClustalW方法比较的不同物种之间核苷酸序列相似度。同时，用自展法(Bootstrap)进行1000次重复，获得一致系统树，并用一致性指数(consistency index，CI)来衡量分析结果的可靠性。

[0069] 序列表SEQ ID：是本发明表达的中华鲟抗菌肽基因的氨基酸序列；

[0070] 中华鲟pen-hepcidin核苷酸序列：

[0071] ACAGCAGAACGAACACTCGACAGAAACAACAGAAACACAGGGACAAACAAATCCCCTGGCATTTTTCAGGACAAAACGTCAAAGCCATCTTTCCCTGTGCAGATACTGCTGCAACTGCTGTCGTAACAAAGGCTGTGGATATTGCTGTAAATTCTGATCACATGGGCATTTGATGTGCACTTGGGAAAAGAGTTTCTTTGAAACATTAACTTATTTGGAATTCTGTCTTCAAAATCCCTGCTGAAATGATTTTCCCTGTCGCACCATGTTGTTTAAAACGGGTATAAATGCAGGCTGTGTCTCCATGCATATGCCTTGTAAAAGTTG

[0072] 表达载体测序结果：

[0073] GTGGAAACGACTTTTACGACACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATTATTCGAAACG ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCT GTT TTA TTCGCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT CCA GTC AAC ACT ACA ACAGAA GAT GAA ACG GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGTTAC TCA GAT TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT GCT GTT TTG CCA TTTTCC AAC AGC ACA AAT AAC GGG TTA TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATTGCC AGC ATT GCT GCT AAA GAA GAA GGG GTA TCT CTC GAG AAAAGA GAG GCT GAA GCT GAA TTC AGC AGA ACG AAC ACT CGA CAGAAA CAA CAG AAA CAC AGG GAC AAA CAA ATC CCC TGG CAT TTTTCA GGA CAA AAC GTC AAA GCC ATC TTT CCC TGT GCA GAT ACTGCT GCA ACT GCT GTC GTA ACA AAG GCT GTG GAT ATT GCT GTAAAT TAA GCG GCC GCC AGC TTT CTA GAA CAA AAA CTC ATC TCAGAA GAG GAT CTG AAT AGC GCC GTC GAC CAT CAT CAT CAT CATCAT TGA

[0074] GTTTGTAGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCGGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGACCTTCGTTTGTGCGGATCCCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCGCATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTCCCCTCTTTCTTCCTCTAGGTGTCGTATTACCGTACTAAAGGTTTGAAAAGAAAAGAGACGCTCGTTCTTTTTCTCGTCGAAAAGCATAAAATTTTATCACGTTCTTTCTGAAATTTTTTTTTTGATTTTCCCTTCGATGACTCATGAATTAGTATACGGCTCATCCCAAGGTTCAGGTTCCATCGCCATGTCGATTAACAC

[0075] 实施例2：重组真核表达载体在毕赤酵母中的表达与抗菌活性分析[0076] (1)重组质粒的线性化

[0077] 将重组表达质粒pPICZαA-pen-epcidin和pPICZαA空载体分别用限制性内切酶BstX I酶切，体系如下：

[0078]

[0079] 45℃反应5h，酶切产物用DNA清洁试剂盒进行纯化，20μLddH2O进行洗脱，-20℃保存。

[0080] (2)线性化重组质粒电转化酵母感受态细胞

[0081] 将毕赤酵母GS115感受态细胞(Pichia pastoris)80μL与经BstX I线性化后的pPICZαA-抗菌肽质粒(20μL)相混合，转移至预冷的0.2cm电转杯(Bio-Red)中，置于冰上5min，2kV，25μF，400Ω，电击8毫秒后，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，取200μL分别涂布于含ZeocinTM(100μg/mL，500μg/mL，1000μg/mL)的YPDS平板上，28℃培养72h，培养至单个菌落出现。同时电转化未加入任何外源基因的pPICZαA空载体。

[0082] (3)阳性酵母菌落的筛选

[0083] 挑取阳性菌落用YPD+ZeocinTM 250rpm振荡培养后，采用煮冻煮法提取重组酵母基因组DNA。将1mL菌液2500g离心5min，弃上清，沉淀中加入500μL TE悬浮沉淀；2500g离心3min，弃上清；重复上步骤一次；最后沉淀溶于100μL TE，沸水浴10min，-80℃冷冻30min，再次沸水浴10min；1500g离心5min；取上清2μl为模板做PCR。以重组酵母基因组为模板进行PCR扩增，反应体系为20μL，即：

[0084]

[0085] 混匀。PCR扩增反应条件为：94℃下预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为94℃下变性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸45min；循环结束后在72℃下再延伸10min。

[0086] 扩增完成后，取PCR产物5μL用6×核酸上样缓冲液点样，1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE，120V，电泳20min观察结果。

[0087] (4)高拷贝阳性菌株的诱导表达

[0088] 选择PCR鉴定为阳性的重组酵母菌落接种于含20mL BMGY培养基的250mL锥形瓶中，28℃，250rpm振荡培养12-16h，使OD600＝2-6，离心收集菌体弃去BMGY培养基。把适量菌体转移到含100mL BMMY培养基的1000mL锥形瓶中，4层纱布包扎瓶口，使起始OD600为1左右。在28℃，250rpm条件下开始甲醇诱导表达。每隔24h，向锥形瓶中加入终浓度为
0.8％的甲醇，并补充适量的无菌水，同时诱导pPICZαA空载体酵母菌。

[0089] (5)体外抑菌实验

[0090] 甲醇诱导72h后，10000rpm离心收集表达上清，0.45μm滤膜过滤表达上清，在冰上搅拌加入固体硫酸铵，使饱和度为85％，硫酸铵完全溶解后，4℃静置过夜，14000rpm超速冷冻离心30min，弃上清，用5mLPBS溶液溶解沉淀，4℃保存。同样的方法浓缩pPICZαA空载体酵母菌表达上清。

[0091] 采用牛津杯法对重组酵母菌表达上清液进行抑菌活性测定：在LB培养基上划线金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，在BHI培养基上划线无乳链球菌、嗜水气单胞菌和温和气单胞菌，培养至单克隆长出。用0.65％无菌生理盐水稀释待测菌株至OD600为0.5-1，吸取50μL待测菌液加至已冷却到50℃以下的液态LB和BHI固体培养基和中，混匀后倒平板。
在凝固的平板上放置已灭菌的牛津杯，向牛津杯中加入100μL浓缩20倍的诱导表达上清(如无特殊说明，所用样品均是浓缩20倍的上清，下略)，以加入相同体积AMP(0.1mg/mL)，浓缩pPICZαA空载体酵母菌表达上清为阴性对照。培养至菌体长出，观察抑菌圈大小。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养温度为37℃，无乳链球菌、嗜水气单胞菌和温和气单胞菌培养温度为28℃。抗菌效果见附图2-6。