含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白及制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白及制备方法与应用。该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过基因工程的方法，突变已知序列的一个氨基酸，得到编码本发明所述的融合蛋白的核苷酸序列；接着将该核苷酸序列克隆入表达载体中，通过表达、纯化，得到本发明所述的融合蛋白。本发明所提供的含有GLP-1的融合蛋白使GLP-1的生理作用具有更好的稳定性和持续性，而且，药效学结果表明，该融合蛋白具有显著的降低血糖效果。另外，经过长期注射本发明所提供的融合蛋白，能显著提高糖耐受性，刺激胰岛素的分泌，保护胰岛β细胞，延缓糖尿病病程的发展。因而本发明所提供的GLP-1融合蛋白非常具有优势和潜力应用于临床治疗。

权利要求

1.一种含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白，其特征在于氨基酸序列如下所示：LPHSHRAHSLPP FNPKTPX；

其中：

X为GLP-1（7-37）；

FNPKTP为连接体；

7 37

X的氨基酸序列为：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG 。

2.根据权利要求1所述的含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白，其特征在于：编码所述的含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白的核苷酸序列如下所示：CTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTACCTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGTGGC。

3.权利要求1或2所述的含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白的制备方法，其特征在于包含以下步骤：将如下所示的核苷酸序列克隆至表达载体中，得到的重组载体置于宿主细胞中进行表达，纯化得到含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白；

核苷酸序列为：

CTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTACCTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGTGGC。

4.根据权利要求3所述的含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的表达载体为原核表达载体。

5.根据权利要求4所述的含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的原核表达载体为pMFH载体。

6.根据权利要求3所述的含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的重组载体为pMFH-GLP-1 Der重组载体，其通过包含以下步骤的制备方法得到：通过设计引物进行PCR，使得权利要求4所述的核苷酸序列的5’端带有EcoRI酶切位点，3’端带有BamHI酶切位点，得到带有EcoRI酶切位点和BamHI酶切位点的序列A；接着将EcoRI和BamHI双酶切后的序列A和EcoRI和BamHI双酶切后的pMFH载体连接，得到pMFH-GLP-1 Der重组载体。

7.根据权利要求3所述的含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）。

8.权利要求1或2所述的含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白的应用，其特征在于：所述的含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白用于制备治疗和/或预防非胰岛素依赖型糖尿病的药物。

说明书

含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白及制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种融合蛋白，特别涉及一种含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白及制备方法与应用。

背景技术

[0002] 糖尿病已成为继心血管疾病和肿瘤后第三大非传染性疾病，世界卫生组织(WHO)预测：2030年全世界糖尿病患者将超过3.6亿，其中II型糖尿病占90％以上。II型糖尿病是非胰岛素依赖型糖尿病，是一种发病率逐年升高的常见病。

[0003] 胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1，GLP-1)类似物及其衍生物在II型糖尿病治疗中表现出广阔前景。在小肠黏膜的L细胞内，胰高血糖素原酶解产生无生物活性的GLP-1(1-37)，GLP-1(1-37)进一步水解切除N-端的6个氨基酸，成为GLP-1(7-37)，其中一部分C-端的一个氨基酸被分解，且末端被酰胺化为GLP-1(7-36)NH2。GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)在体内具有相同的生理功能。GLP-1诱导多种生物学效应，GLP-1作用于胰腺，促进胰岛素分泌，促进胰岛β细胞的增殖分化，抑制β细胞的凋亡，增强外周胰岛素敏感组织对胰岛素的敏感性，抑制高血糖素的分泌；GLP-1作用于中枢神经系统，抑制摄食中枢活性，减低食欲；GLP-1作用于胃肠道，抑制胃肠排空，控制胃酸分泌；GLP-1作用于心脏，抑制心肌细胞的凋亡，保护心脏；GLP-1作用于血管，可以舒张血管、降低血压，保护内皮细胞。

[0004] II型糖尿病患者中，其肠促胰岛素效应受损，餐后GLP-1分泌减少，因此GLP-1及其类似物可作为治疗II型糖尿病的一个重要的靶点。GLP-1的显著特征是葡萄糖依赖性方式刺激胰岛素分泌而不伴有低血糖风险，而低血糖危险常见于胰岛素治疗中。

[0005] 但是，GLP-1应用于临床面临着巨大问题，人体自身产生的GLP-1在体内很不稳定，很快被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)所清除，半衰期非常短，约为1～2min，即必须持续静脉滴注或者持续皮下注射才能产生疗效，这严重限制了其在临床治疗上的应用。

[0006] 人血清白蛋白(HAS)是血浆中含量最多的蛋白质，浓度约为600μM，占血浆总蛋白的40％-60％。它也是人体血浆中主要的药物运输蛋白，在人体内的半衰期可达19天。与人血清白蛋白结合能有效的改善某些肽分子和蛋白药物代谢动力学特性，延长其半衰期。因此，如将GLP-1与血清白蛋白亲和结合序列融合，该融合蛋白与血清白蛋白亲和结合，可以达到缓释的目的，并且不易被肾脏清除，从而延长GLP-1血浆半衰期。申请号为200810028614.5、名称为“一种缓释生物活性多肽的方法与应用”的发明专利申请提供了一种融合多肽，其中的血清白蛋白结合肽可为LPHSHRAHSLPP，连接体为：FNPRGA、FNPRGS、FNPRGP、FNPRPP、FNPRPA。但是此发明所提供的GLP-1融合多肽在糖尿病动物模型db/db小鼠中的降糖试验表明，其降糖效果仍有提高的空间。

发明内容

[0007] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白。

[0008] 本发明的另一目的在于提供所述含有胰高血糖素样肽-1或其衍生物的融合蛋白的制备方法。

[0009] 本发明的另一目的在于提供所述含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白的应用。

[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白，其氨基酸序列如下所示：

[0011] LPHSHRAHSLPP FNPKTPX；

[0012] 其中：

[0013] LPHSHRAHSLPP是与血浆白蛋白亲和结合序列；

[0014] FNPKTP为连接体，是体内特异性蛋白酶识别位点；

[0015] X为GLP-1(7-37)，

[0016] X的序列为：H7AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG37；

[0017] 编码所述的含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白的核苷酸序列如下所示：

[0018] CTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTACCTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGTGGC；

[0019] 所述的含有胰高血糖素样肽-1或其衍生物的融合蛋白的制备方法，优选包含以下步骤：将如下所示的核苷酸序列克隆至表达载体中，得到的重组载体置于宿主细胞中进行表达，纯化得到；

[0020] 核苷酸序列为：

[0021] CTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTACCTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGTGGC。

[0022] 所述的表达载体优选为原核表达载体，特别优选为pMFH质粒载体；

[0023] 所述的重组载体优选为pMFH-GLP-1 Der重组载体，其通过包含以下步骤的制备方法得到：通过设计引物进行PCR，使得上述的核苷酸序列的5’端带有EcoRI酶切位点，3’端带有BamHI酶切位点，得到带有EcoRI酶切位点和BamHI酶切位点的序列A；接着将EcoRI和BamHI双酶切后的序列A和EcoRI和BamHI双酶切后的pMFH载体连接，得到pMFH-GLP-1 Der重组载体。

[0024] 所述的含有胰高血糖素样肽-1的GLP-1融合蛋白是由大肠杆菌表达系统重组表达产生的，所述的宿主细胞优选为大肠杆菌BL21(DE3)；

[0025] 所述的含有胰高血糖素样肽-1的融合蛋白用于制备治疗非胰岛素依赖型糖尿病及其并发症的药物；

[0026] 所述的非胰岛素依赖型糖尿病和各种状况优选为II型糖尿病、糖耐量受损、肥胖、代谢综合征，更优选为II型糖尿病。

[0027] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0028] (1)本发明所提供的GLP-1融合蛋白，其中的血清白蛋白结合肽为：LPHSHRAHSLPP，其连接体为：FNPKTP，完整氨基酸序列为：LPHSHRAHSLPPFNPKTPHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。在糖尿病动物模型db/db小鼠中的试验表明，申请号为
200810028614.5、名称为“一种缓释生物活性多肽的方法与应用”的发明专利申请提供的GLP-1融合多肽(连接体分别为FNPRPP、FNPRPA、FNPRHA)在小鼠体内持续药效为8小时左右，本发明所提供的含胰高血糖素样肽-1的融合蛋白化学性质稳定，不易被体内的DPP-IV降解，持续药效达到12小时以上，从而克服了必须持续静脉滴注或者持续皮下注射GLP-1才能产生疗效的缺陷。

[0029] (2)申请号为200810028614.5、名称为“一种缓释生物活性多肽的方法与应用”的发明专利申请提供的GLP-1融合多肽(连接体分别为FNPRPP、FNPRPA、FNPRHA)在小鼠体内8小时内的降糖百分比才达到27.31％。而本发明所提供的GLP-1融合蛋白12小时内的降糖百分比达到34.3％，24小时内的降糖百分比仍达到24.83％，体内持续降糖药效达到12小时以上。因而，无论是口服糖耐量实验(OGTT)，还是即时降糖实验，本发明所提供的GLP-1融合蛋白的降糖效果均具有显著优势。所以本发明所提供的GLP-1融合蛋白非常具有优势和潜力应用于临床治疗。同时，本发明所提供的含胰高血糖素样肽-1的融合蛋白作为有效成分治疗II型糖尿时，既有显著的降糖效果，12小时内的降糖百分比达到34.3％，24小时内的降糖百分比达到24.83％，又具有很长的血浆半衰期(12小时以上)。

[0030] (3)药效学结果表明，经过长期注射本发明所提供的含胰高血糖素样肽-1的融合蛋白，能显著提高糖耐受性，刺激胰岛素的分泌，保护胰岛β细胞，延缓糖尿病病程的发展。因而本发明所提供的GLP-1融合蛋白非常具有优势和潜力应用于临床治疗。

附图说明

[0031] 图1是pMFH质粒载体图谱图。

[0032] 图2是pMFH-GLP-1Der融合蛋白质粒图谱图。

[0033] 图3是pMFH-GLP-1Der融合蛋白重组质粒的酶切鉴定图；其中：

[0034] 泳道M是DNA Marker；泳道1是pMFH-GLP-1Der重组载体经EcoRI和BamHI双酶切结果；泳道2是pMFH质粒经EcoRI和BamHI双酶切结果。

[0035] 图4是GLP-1融合蛋白HPLC制备图谱图。

[0036] 图5是GLP-1融合蛋白纯度分析图。

[0037] 图6是GLP-1融合蛋白质谱鉴定图。

[0038] 图7是GLP-1融合蛋白在体内稳定性结果图。

[0039] 图8是db/db小鼠注射GLP-1融合蛋白后降糖百分比图。

[0040] 图9是db/db小鼠连续给药一周后给药口服糖耐量结果图。

[0041] 图10是db/db小鼠连续给药六周后给药口服糖耐量结果图。

[0042] 图11是db/db小鼠连续给药七月后不给药口服糖耐量结果图。

具体实施方式

[0043] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0044] 实施例1

[0045] 构建含有编码胰高血糖素样肽-1或其衍生物的融合蛋白(简称为GLP-1融合蛋白)序列的重组质粒。

[0046] (1)编码GLP-1融合蛋白的核苷酸序列的PCR及酶切

[0047] 根据GLP-1融合蛋白的结构特点，采用大肠杆菌的密码子的偏好性设计引物，引物由上海生物工程有限公司商业化合成。

[0048] 引物序列如下：

[0049] 上游引物1(UP1)：5’-GCGC GAT CCG CTG CCG CAT AGCCAT CGC GCC CAT AGC CTG CCG CCG-3’

[0050] 上游引物2(UP2)：5’-CAT AGC CTG CCG CCG TTC AAC CCG AAG ACGCCG CAC GCT GAA GGT ACC-3’

[0051] 下游引物(DP)：5’-TCATCCGCCAAAACAGCCAAG-3’；

[0052] 采用重叠延伸PCR方法，以质粒pMFH-GLP-1(7-37)(该质粒已在申请号为“201010221511.8”、名称为“利用乳糖诱导pMFH载体生产重组蛋白的发酵方法”的发明专利申请中公开)为模板，扩增GLP-1融合蛋白cDNA序列。以pMFH-GLP-1质粒为模板，UP2和DP为引物，进行第一次PCR扩增，然后再以第一次PCR扩增产物为模板，使用UP1和DP引物进行全长片段的扩增，得到如下序列的PCR产物：

[0053] GCGC GATCCGCTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTACCTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGTGGC TAA TCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGA。

[0054] 为EcoRI酶切位点，GATCCG为甲酸酶解位点， 为BamHI酶切位点。

[0055] PCR反应体系为：

[0056]

[0057] PCR反应条件：

[0058]

[0059]

[0060] PCR扩增之后，回收PCR产物(操作见PCR清洁试剂盒说明书)。对PCR产物进行酶切，酶切反应体系如下：

[0061]

[0062] 酶切反应条件：先30℃水浴2h，再37℃水浴2h。接着采用商业化的Omega Agarose Gel DNA Purification Kit对酶切产物进行纯化。

[0063] (2)pMFH表达载体的双酶切及重组质粒的连接

[0064] pMFH 表 达 载 体 (Staphylococcal nuclease fusion proteins for the production of recombinant peptides.US 7390639B2中已经详细公开了该载体的构建过程)含有大肠杆菌编码依赖RNA聚合酶转录单位的T7启动子；且具有融合表达系统的运载蛋白片段MFH，在MFH的C末端含有6×His标签，便于融合蛋白的纯化(如图1所示)，其酶切体系如下：

[0065]

[0066] 酶切反应条件：先30℃水浴2h，再37℃水浴2h。接着采用商业化的Omega Agarose Gel DNA Purification Kit对目的DNA片段进行纯化。取经EcoRI和BamHI双酶后的pMFH质粒载体和步骤(1)制备的双酶切后的编码GLP-1融合蛋白基因序列进行连接，连接体系为：

[0067]

[0068] 连接反应条件：16℃连接16～20h。最终获得含有编码GLP-1融合蛋白序列的重组质粒pMFH-GLP-1Der(如图2所示)。

[0069] (3)pMFH-GLP-1Der转化大肠杆菌DH5α

[0070] 将构建好的重组质粒转化至感受态大肠杆菌DH5α(宝生物(大连)生物工程有限公司)中，冰浴30min，升温至42℃水浴中，维持90s，立即转移至冰浴中，静置2min。加入1ml LB培养液，置37℃恒温振荡(100rpm)培养45min，取100μl转化后的菌液均匀地涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的固体LB培养基上，37℃恒温放置至液体被平板完全吸收后，37℃倒置培养12～16h至长出明显菌落。筛选出Amp抗性的单克隆菌落。通过对阳性克隆EcoRI和BamHI的双酶切以及琼脂糖凝胶电泳鉴定(如图3所示)，结果表明GLP-1融合蛋白的cDNA序列已定向插入表达载体pMFH中。对已鉴定的重组质粒进行DNA测序，确证获得了含pMFH-GLP-1Der的重组菌。GLP-1融合蛋白核酸序列如下：

[0071] CTGCCGCATAGCCATCGCGCCCATAGCCTGCCGCCGTTCAACCCGAAGACGCCGCACGCTGAAGGTACCTTCACTTCCGACGTTTCCTCTTACCTGGAAGGTCAGGCTGCAAAAGAATTTATCGCTTGGCTGGTTAAAGGTCGTGGC。

[0072] 实施例2：pMFH-GLP-1融合蛋白发酵表达

[0073] 抽提重组质粒pMFH-GLP-1Der，进一步转化到大肠杆菌BL21(DE3)(宝生物(大连)生物工程有限公司)，得到基因工程表达菌。通过摇瓶培养逐级放大，在5L发酵罐中培养发酵GLP-1融合蛋白表达菌。所用的培养基为2YT培养基，配方为：胰蛋白胨16g/L，乳糖10g/L，NaCl 5g/L；用NaOH调pH至7.0，发酵罐内灭菌，灭菌条件为：121℃，20min。发酵培养条件如下：接种量为体积百分比1％；培养温度为37℃；装液量为体积百分比80％；氨苄青霉素(Amp)浓度为100mg/L。培养至对数生长中后期，添加0.6mM IPTG，诱导时间为
6h，放罐后12000rpm离心30min收集菌体。

[0074] 实施例3：分离纯化获得GLP-1融合蛋白

[0075] (1)将发酵菌体离心收集，用裂解液重悬，裂解液配方为：配方为：50mmol/LNaH2PO4、300mmol/L NaCL、10mmol/L咪唑(imidazole)，用NaOH调pH到8.0。采用超声破碎仪(DF-6P3C型超声细胞破碎仪，宁波新芝科器研究)在冰浴中破碎菌体，开5s，停5s，工作20min。10000rpm，4℃，30min，离心破碎菌体，收集上清。

[0076] (2)将步骤(1)中收集的上清进行Ni-NTA Agarose(nickel-charged resin，QIAGEN)亲和柱纯化，用含10mM咪唑的裂解液洗除杂蛋白后，再用含250mM咪唑的裂解液(除咪唑浓度不同，其他成分同前述裂解液)洗脱目的蛋白。

[0077] (3)甲酸水解(2)中目的蛋白，以去除目的蛋白上的His标签。反应条件如下：按30mg目的蛋白/ml甲酸溶液计算，甲酸溶液的浓度为体积百分比50％，水解温度为45℃，恒温振荡48小时，得到水解产物。

[0078] (4)将水解产物进行Ni-NTA Agarose亲和柱纯化，收集GLP-1融合蛋白组分(即上样穿透峰部分)。

[0079] (5)将步骤(4)得到GLP-1融合蛋白通过悬蒸浓缩仪进行浓缩后，利用高效液相色谱(HPLC)进一步的精制纯化。HPLC仪为半制备的Agilent 1100系列，C18柱(Agilent)规格为21.2*250mm，7μm。浓缩后的样品通过0.45μm RC滤膜过滤后进样，每次进样体积为1ml，流动相为含体积百分比0.1％三氟乙酸(TFA)的超纯H2O以及含体积百分比0.1％TFA的乙腈(ACN)，检测波长为280nm。出峰时间为：17.5min，收集此峰组分。HPLC制备条件为：

[0080]时间(min) ACN(％) V(ml/min)
0 15 10
20 55 10

[0081] 从图4可见，HPLC达到了很好的分离效果，目的融合蛋白在17.5min处出峰。

[0082] (6)将步骤(5)中得到的GLP-1融合蛋白峰组分，利用旋转蒸发仪除去大部分乙腈和H2O，冷冻干燥后获得的GLP-1融合蛋白粉末保存于-20℃。最后进行纯度分析以及质谱鉴定，结果表明GLP-1融合蛋白纯度达到99.16％(如图5所示)，分子量实测值为5467Da(如图6所示)，理论值为5468Da，表明分子量正确。

[0083] 实施例4GLP-1融合蛋白的体内稳定性

[0084] (1)实验材料：db/db小鼠(南京爱尔麦特生物科技有限公司)，GLP-1融合蛋白(给药剂量1800μg/Kg)，PBS注射液(广州精达医学科技有限公司)，SPF级颗粒饲料(广东省实验动物中心)，稳豪血糖仪及检测试纸条(美国强生公司)。所述GLP-1融合蛋白为实施例3的制备产物。

[0085] (2)实验分组：将db/db小鼠随机分成5组，每组10只，雌雄各半，5组分别为本发明制备的GLP-1融合蛋白组(简称KTP组，即实验组)、GLP-1融合多肽组(连接体为FNPRPP的融合多肽简称RPP组，连接体为FNPRPA的融合多肽简称RPA组，连接体为FNPRHA的融合多肽简称RHA组，均为对照组)、PBS为空白对照组。

[0086] (3)实验方法和步骤：9:00am皮下注射给药并记为0时，分别于0、1、2、3、4、6、8、10、12、15、18、21、24h对小鼠尾静脉采血，用血糖仪和血糖试纸测定血糖值。降糖百分比＝(空白对照组曲线下面积-给药组曲线下面积)/空白对照组曲线下面积×100％。实验结果如图7、8所示。

[0087] 如图7结果显示，RPP组、RPA组、RHA组给药后血糖值从第3小时起一直高于KTP组，第6、8小时的血糖值均恢复到给药前水平且大于11.1mmol/L(糖尿病餐后标准血糖值)，说明对照组药物已无降糖作用，其在体内降糖药效均小于6小时，因而对照组(RPP组、RPA组、RHA组)后续时间点血糖值不再测定。KTP组12小时内血糖均能维持正常水平(餐后血糖小于11.1mmol/L)，说明GLP-1融合蛋白(KTP组)具有良好的降糖效果，并且在体内稳定性好，能维持药效12小时。

[0088] 如图8结果显示，GLP-1融合多肽组8小时内的降糖百分比分别为：RPP组3.96％，RPA组19.8％，RHA组25.1％。与申请号为200810028614.5、名称为“一种缓释生物活性多肽的方法与应用”的发明专利申请提供的GLP-1融合多肽(连接体分别为FNPRPP、FNPRPA、FNPRHA)相比，本发明所提供的GLP-1融合蛋白(KTP组)8小时内的降糖百分比为33.05％，12小时内的降糖百分比达到34.3％，24小时内的降糖百分比仍达到24.83％，体内持续降糖药效达到12小时。

[0089] 如图7、8结果显示，本发明所提供的GLP-1融合蛋白的降糖效果和体内稳定性具有显著优势。

[0090] 实施例5GLP-1融合蛋白的降血糖作用

[0091] (1)实验材料：db/db小鼠(南京爱尔麦特生物科技有限公司)，D-葡萄糖(1.6g/Kg)，GLP-1融合蛋白(给药剂量1200μg/Kg)，Exentin-4(成都圣诺科技发展有限公司)，PBS注射液(广州精达医学科技有限公司)，SPF级颗粒饲料(广东省实验动物中心)，稳豪血糖仪及检测试纸条(美国强生公司)，灌胃针。所述GLP-1融合蛋白为实施例3的制备产物。

[0092] (2)实验分组：将db/db小鼠随机分成3组，每组8～10只，3组分别为本发明制备的GLP-1融合蛋白组，Exendin-4(艾塞那肽)组和PBS对照组。

[0093] (3)实验方法和步骤：每天对db/db小鼠给药二次，时间分别为8:00am和7:00pm。小鼠连续给药1周后，前一天禁食不禁水14h。测定小鼠空腹血糖并皮下给药，30分钟后灌糖并记为0min，分别于10min、20min、30min、60min、120min、180min对小鼠进行尾静脉采血，用血糖仪和血糖试纸测定血糖值，结果如图9所示；小鼠连续给药6周后进行给药后糖耐量实验，结果如图10所示；连续给药7个月后进行不给药糖耐量实验，结果如图11所示。

[0094] 图9结果显示，小鼠连续给药1周后，给药后糖负荷各时间点GLP-1融合蛋白给药组血糖值显著低于PBS对照组。PBS组、GLP-1融合蛋白给药组、Exendin-4组血糖峰值分别为：120min后GLP-1融合蛋白给药组和Exendin-4组血糖值均能恢复正常水平；GLP-1融合蛋白给药组降糖效果稍低于Exendin-4组。

[0095] 图10结果显示，小鼠连续给药6周后，给药后糖负荷各时间点GLP-1融合蛋白给药组血糖值显著低于PBS对照组。120min后GLP-1融合蛋白给药组和Exendin-4组血糖值均能恢复正常水平；GLP-1融合蛋白给药组降糖效果和Exendin-4组差异不明显。

[0096] 图11结果显示，小鼠连续给药7个月后，不给药进行口服糖耐量实验。不给药糖负荷后各时间点GLP-1融合蛋白给药组血糖值显著低于PBS对照组。灌糖120min后GLP-1融合蛋白给药组和Exendin-4组血糖值均能恢复正常水平；且GLP-1融合蛋白给药组降糖效果显著优于Exendin-4组。

[0097] 图9～11的结果表明，长期注射GLP-1融合蛋白能显著提高db/db小鼠对糖的耐受性，刺激胰岛素的分泌，保护胰岛β细胞，延缓糖尿病病程的发展。

[0098] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。