一株生产耐碱耐盐木聚糖酶的海洋绿色产色链霉菌菌株及其应用

摘要

一株生产耐碱耐盐木聚糖酶的海洋绿色产色链霉菌菌株及其应用，属于生物技术领域。该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为5565。该菌株在pH11的极端碱性环境下正常生长，并表现了良好的耐受寡营养的特性，能降解多种含半纤维素的生物质，包括玉米秸秆、稻草、菊芋秸秆、海带纤维等，在利用廉价生物质资源生产生物基化学品方面具有广阔的应用前景。该菌株在最适条件下生产木聚糖酶，木聚糖酶酶活最高可达68.9U/ml。生产的木聚糖酶具有以下性质：最适pH值6.0，最适温度70℃，最适底物为山毛榉木聚糖，所产的木聚糖酶无纤维素酶活性，具有良好的pH稳定性、热稳定性，且可耐受高浓度NaCl。作为一种海洋来源的酶制剂，可广泛用于造纸、食品、饲料、酿酒、能源等工业。

权利要求

1.一株生产耐碱耐盐木聚糖酶的海洋绿色产色链霉菌菌株（Streptomyces viridochromogenes），其特征在于：所述菌株的登记入册编号为CGMCC No. 5565，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2011年12月9日。

2.根据权利要求1所述的一株生产耐碱耐盐木聚糖酶的海洋绿色产色链霉菌菌株的应用，其特征在于：所述海洋绿色产色链霉菌菌株应用于工业生产耐碱耐盐木聚糖酶。

说明书

一株生产耐碱耐盐木聚糖酶的海洋绿色产色链霉菌菌株及

其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株生产耐碱耐盐木聚糖酶的海洋绿色产色链霉菌(M11)菌株及其应用，特别适用于大规模工业化生产耐碱耐盐木聚糖酶，属于生物技术领域。 背景技术

[0002] 利用廉价生物质资源生产高附加值产品是生物技术的重要研究内容。木聚糖是自然界中的一种丰富的可再生资源，是最具代表性的半纤维素成分，占半纤维素的1/3-1/2，是除纤维素外自然界中最丰富的多糖。因此，如何利用木聚糖成为目前国内外研究的热点。 [0003] 木聚糖是由D-木糖主链(以β-1，4键相连)和L-阿拉伯糖分枝(α-1，2和α-1，3相连)所组成的聚合物，与木质素和纤维素以4-O-methyl-D-glucuronic acid键相连，形成了交联复杂的结构，为降解半纤维素带来困难。目前，工业降解木聚糖常用的方法有酸法、碱法和酶法，其中酸法、碱法应用较为广泛，但酸碱水解液中含有较多的有毒物质，对于后期微生物发酵有抑制作用；另外，采用酸法或碱法降解木聚糖，生产环保压力很大，因此受到国家的限制，故从长期生产效果来看，酶法降解木聚糖将是未来木聚糖降解的主要的方式。

[0004] 木聚糖酶是木聚糖水解酶系中最关键的水解酶。木聚糖被降解时，起主要作用的酶是β-1，4-内切木聚糖酶和β-D-木糖苷酶。β-1，4-内切木聚糖酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的β-1，4木糖苷键，其主要水解产物为低聚木糖、木寡糖、木二糖等；β-D-木糖苷酶通过水解低聚木糖、木寡糖等的非还原性末端来催化释放木糖残基。 [0005] 木聚糖酶在饲料工业、食品工业、造纸工业、能源工业等众多领域具有巨 大的应用价值和广阔的应用前景。例如，在纸浆漂白的初始阶段，向纸浆中加入木聚糖酶可以增加纸浆的光亮度和水解度，从而减少了在后期漂白中氯化物的用量，降低了对环境的污染；在面包烘烤过程中，向面团中加入木聚糖酶，可缩短面团的发酵时间，改善面包心的弹性和硬度，增加面包的体积和比容，有效地改善面包焙烤品质；向饲料中添加木聚糖酶可以显著提高畜禽的生产性能。木聚糖酶可以破坏植物细胞壁结构，提高各种类型饲料的利用率，减少畜禽肠道疾病，增进畜禽健康，提高畜禽成活率；减少粘粪，降低空气中氨气和硫化物浓度，减少环境污染，减少粘粪排出和脏蛋，使畜禽体重均匀。因此，伴随着人类对于可持续性发展和环境的重视，木聚糖酶在工业上的应用将更加受到人们的重视。

[0006] 海洋放线菌主要分布在海底沉积物、海洋生物表面以及海水中。海洋环境的特殊性造就了海洋放线菌独特的代谢方式和代谢产物。近年来人们不断从各种海洋环境中寻找到能产生具有新型作用机制的抗生素、酶制剂(蛋白酶、淀粉酶、和纤维素酶等)、维生素(B12)和有机酸的放线菌。在海洋高压、低温、高盐的生命极限环境中，海洋放线菌拥有独特的代谢途径和合成能力，这不仅确保其在极端环境中生存，也提供了产生特殊代谢产物的潜力。海洋微生物生产的酶一般具有与其生存环境相关的特性，例如，耐盐性、耐高温性、适冷性等，这些特性在工业极端条件下有广阔应用前景。此外，放线菌的遗传操作简单，便于进行遗传改造，与霉菌相比更具有生物安全性。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一株生产耐碱耐盐木聚糖酶的海洋绿色产色链霉菌(M11)菌株及其应用，该菌株具有寡营养、pH、NaCl耐受性性质，可用于发酵制备耐碱耐盐木聚糖酶；上述的耐碱耐盐木聚糖酶所具有的独特酶学性质，使之可广泛应用于工业生产中。 [0008] 本发明涉及一株生产耐碱耐盐木聚糖酶的海洋绿色产色链霉菌(M11)菌株，分类命名为Streptomyces viridochromogenes，所述菌株的登记入册编号为 CGMCC No.5565，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2011年12月9日。

[0009] 所述海洋绿色产色链霉菌(以下省略M11)菌株可生产耐碱耐盐木聚糖酶，适合在造纸、饲料、食品、酿酒以及能源工业中使用。

[0010] 所述菌株在Bennett固体培养基上生长时，菌落为圆形，致密，经过2-3天菌落表面生长出白灰色孢子，基底为墨绿色，产生黑色色素，生长速度较快。该菌株具有较好的寡营养性、pH、NaCl耐受性，在pH值为11的极端碱性条件下，菌株依然生长良好；在1％的NaCl中生长最佳。本发明菌株可在以木聚糖为唯一碳源的培养基中生长，所产生的发酵液具有降解木聚糖的能力。发酵7天时发酵酶活最高，可达68.9U/ml。

[0011] 所述菌株所生产的木聚糖酶同时具有较好的pH稳定性、NaCl耐受性和热稳定性等特性。本发明筛选到的绿色产色链霉菌所生产的木聚糖酶，其最适pH值为6.0，在pH5-9的范围内维持80％以上的酶活性；最适温度为70℃，在45℃下处理60min，酶活性维持在88％以上；在60℃下处理60min，酶活性维持在在75％以上；本发明中的木聚糖酶最适底物为山毛榉木聚糖，无纤维素酶活性；该木聚糖酶具有很好的NaCl耐受性，当NaCl终浓度为
1mol/L时，木聚糖酶酶活维持在86.6％；当NaCl终浓度为2M时，残留酶活70.4％；当NaCl终浓度为5mol/L时，残留酶活46.8％。本专利所描述的具有这些特性的木聚糖酶还未见报道。

[0012] 所述菌株所生产的木聚糖酶可降解多种农业废弃物及廉价生物质，对菊芋秸秆的降解效果最佳。此外，对海洋来源的海带纤维也具有较好的降解性能，表明该木聚糖酶在利用海洋大型海藻生产高值产品方面有应用价值。

[0013] 所述木聚糖酶在pH为9时，残留酶活为最大酶活性的83.3％，表现了较好的耐碱性，且在60℃下保持较高的酶活力，能够满足造纸中的生物漂白工艺，一定程度上水解纸浆中的半纤维素，使纸张成色、硬度、质量有所提高。更重要的是，代替或部分降低了氯化物的使用量，减少对环境的污染。本发明中木聚糖酶还可应用于酿酒工业，降低物料粘度，提高淀粉的利用率，增加酒精的 产率。本发明中的木聚糖酶在能源工业中也显示出巨大的应用潜力，该酶在45℃下可长时间维持较高酶活，与目前同步糖化工艺温度一致，且可降解农业废弃物中的半纤维素为单糖，供下游工艺发酵利用，产生清洁可再生能源。 [0014] 本发明的有益效果是：该菌株分离自大连海泥样品中，2011年12月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为5565。该菌株在pH值为11的极端碱性环境下正常生长，并表现了良好的耐受寡营养的特性，能降解多种含半纤维素的生物质，包括玉米秸秆、稻草、菊芋秸秆、海带纤维等，在利用廉价生物质资源生产生物基化学品方面具有广阔的应用前景。该菌株在最适条件下生产木聚糖酶，木聚糖酶酶活最高可达68.9U/ml。生产的木聚糖酶具有以下性质：最适pH值6.0，最适温度70℃，最适底物为山毛榉木聚糖，所产木聚糖酶无纤维素酶活性，具有良好的pH稳定性、热稳定性，且可耐受高浓度NaCl。做为一种海洋来源的酶制剂，可广泛用于造纸、食品、饲料、酿酒、能源等工业。

附图说明

[0015] 图1是海洋绿色产色链霉菌寡营养耐受性。a.对照；b.稀释2倍；c.稀释3倍；d.稀释5倍。

[0016] 图2是海洋绿色产色链霉菌pH耐受性。a.pH＝5；b.pH＝7；c.pH＝9；d.pH＝11。

[0017] 图3是海洋绿色产色链霉菌NaCl耐受性。a.对照；b.1％NaCl；c.2％NaCl；d.3％NaCl。

[0018] 图4是海洋绿色产色链霉菌液体发酵生产木聚糖酶结果。

[0019] 图5是海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶最适温度结果。

[0020] 图6是海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶热稳定性结果。

[0021] 图7是海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶最适pH结果。

[0022] 图8是海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶pH稳定性结果。

[0023] 图9是海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶NaCl耐受性结果。

具体实施方式

[0024] 实验材料和试剂

[0025] 1.菌株：海洋绿色产色链霉菌由本发明人2006年从大连小平岛海泥样品中分 离获得。

[0026] 2.生化试剂：

[0027] 木聚糖：山毛榉木聚糖、桦木木聚糖、燕麦木聚糖(美国SIGMA公司)； [0028] 海带纤维购自陕西慈缘生物技术有限公司。

[0029] 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Solarbio公司)；

[0030] 测序由大连宝生物工程有限公司完成；

[0031] TaKaRa rTaq大连宝生物工程有限公司；

[0032] 10xPCR Buffer大连宝生物工程有限公司；

[0033] dNTP Mixture大连宝生物工程有限公司。

[0034] 提取菌株基因组DNA试剂：

[0035] 洗涤液：50mmol/L Tris，25mmol/L EDTA，0.1％PVP，pH为8.0。

[0036] 裂解液：50mmol/L Tris，25mmol/L EDTA，1.2％PVP，3％SDS。

[0037] 抽取液：10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，0.3mmol/L NaAC，pH为8.0。 [0038] 提取液：苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1。

[0039] TE缓冲液：50mmol/L Tris，pH为8.0。

[0040] DNS试剂配方：

[0041] 甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2mL 10％的NaOH中，用蒸馏水稀释至69mL再加入6.9g NaHSO3；

[0042] 乙液：称取255g酒石酸钾钠，加入至300mL的10％NaOH中，再向其中加 入880mL1％3，5-二硝基水杨酸溶液；

[0043] 将甲乙两液相混即得到黄色DNS试剂，贮存于棕色试剂瓶中。在常温下，放置7-10天后使用，半年内有效。

[0044] 3.培养基

[0045] Bennett固体培养基：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母粉1g，牛肉膏1g，琼脂20g，pH7.0。

[0046] 木聚糖固体培养基：山毛榉木聚糖10g，NH4NO3 4g，K2HPO4·3H2O 1g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl 0.3g，琼脂20g，pH6.5-7.0。

[0047] 富集培养基：(NH4)2SO4 5g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl20.2g，山毛榉木聚糖10g，pH 7.0。

[0048] TSB液体培养基：胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3.0g，葡萄糖2.5g，K2HPO4·3H2O 2.5g，NaCl 5g，pH 7.0。

[0049] 木 聚 糖酶 产 酶 培 养 基：K2HPO4·3H2O 1.11g，KH2PO4 3.65g，(NH4)2NO3 3g，MgSO4·7H2O 2.2g，CaCl2 0.3g，葡萄糖1.5g，蛋白胨2.5g，牛肉膏3g，山毛榉木聚糖10g，pH6.5。

[0050] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

[0051] 实施例1：菌株的获得

[0052] 将来源于大连小平岛海泥样品经富集培养后，按常规稀释后涂布于木聚糖平板上，30℃培养5-6天，挑取产生透明圈菌落在木聚糖固体培养基上划线分离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化。通过此方法筛选到该分泌木聚糖酶的菌株。

[0053] 本发明菌株在Bennett平板上30℃下培养7天，菌落呈圆形，直径约为3-4cm，基底为墨绿色，菌落表面突起，产生白灰色孢子，释放大量黑色色素。其最适pH为7.0-9.0，最适温度为30℃。

[0054] 实施例2：提取海洋绿色产色链霉菌基因组DNA，以及其16SrDNA的获得 [0055] 提取海洋绿色产色链霉菌基因组DNA：

[0056] 1)将菌株接种于50mL的TSB液体培养基中，在30℃下转速170rpm培养72小时，此时正处于对数生长期。收集发酵液1mL，8000r/min离心5min后弃上清液，洗涤液清洗菌体，离心后重复一次清洗。

[0057] 2)向洗涤后的菌体中，加入100μL裂解液悬浮菌体，100℃煮沸15min后冷却至室温。

[0058] 3)加入65℃预热好的抽提液0.5ml，轻微震荡。

[0059] 4)加等体积Tris饱和酚/氯仿溶液，强烈震荡1min，10000r/min离心5min，小心吸取上清液，转移至干净的离心管。

[0060] 5)向上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻倒转混合两次，-20℃静置2小时。 [0061] 6)12000r/min离心5min，70％的乙醇洗涤一次，10000r/min离心5min，开口挥发至无醇味，干燥后溶于20μLTE缓冲液中，制得总DNA。

[0062] 16SrDNA序列的获得：

[0063] 16SrDNA PCR引物如下：

[0064] P1：5’一ATTCGGCACACAGAAAC一3‘

[0065] P2：5’一AGAGGAGAACCGIAGAC一3‘

[0066] PCR反应条件如表1所示：

[0067] 表1PCR反应条件

[0068]

[0069] PCR反应体系如表2所示：

[0070] 表2PCR反应体系

[0071]

[0072] 实施例3：海洋绿色产色链霉菌的寡营养耐受性、pH耐受性和NaCl耐受性 [0073] 将Bennett固体培养基稀释1、2、3、5倍，用以测定海洋绿色产色链霉菌的寡营养耐受性；调节Bennett固体培养基pH为5、7、9、11，以测定菌株的pH耐受性；向Bennett固体培养基中加入0％、1％、2％、3％的NaCl，以测定菌株的NaCl耐受性。取50μL孢子溶液6
(浓度约为10 个/mL)分别均匀涂布于上述各个平板，于30℃下培养6天，观察菌落生长状态。结果(见图1-3)表明菌 株在稀释5倍的Bennett平板上生长良好，说明其较好的寡营养性耐受性；菌株在pH 5的平板上生长较差，在pH为11的平板上仍能正常生长，说明本发明菌株耐碱性较强，最适生长pH为7-9；菌株在1％的NaCl平板上生长最佳，色素产量最多，表明本发明菌株具有较好的耐盐性。

[0074] 实施例4：海洋绿色产色链霉菌在产酶培养基中进行液体发酵生产木聚糖酶 [0075] 划线接种海洋绿色产色链霉菌于Bennett固体培养基上，在30℃下培养3-5天。待孢子生长良好时，用1000μL的枪头尾圆端取4块菌落接种于TSB液体培养基中，于30℃下转速170rpm培养48h，进行种子培养。吸取培养好的种子培养基，以5％的接种量接入50mL木聚糖酶产酶培养基中，在转速为170rpm，温度为30℃条件下培养。结果(图4)表明，发酵7天后木聚糖酶产量达到最高，酶活约为68.9U/mL。

[0076] 实施例5：测定海洋绿色产色链霉菌发酵液中木聚糖酶酶活

[0077] 将实施例3中的发酵液于8000rpm下离心10min，收集上清液作为粗酶液。粗酶液经过适当稀释，精确吸取粗酶液0.2mL(每个样品3支平行试管)，加底物(1％山毛榉木聚糖)1.8mL。混合后于60℃水浴中反应5min，反应结束后迅速加入DNS液3.0mL终止反应，然后在沸水中煮沸5min，取出后冷却至室温。加入蒸馏水至25mL，摇匀。于540nm下测定OD值，根据木糖标准曲线换算木糖含量。空白对照，底物1.8mL于60℃水浴中处理5min后加入DNS试剂3.0mL，再向其中加入0.2mL稀释后的粗酶液，其它处理与样品一致。以空白对照为参比测定样品吸光度A。1个酶活单位(U)定义为在上述的条件下，每分钟释放出1μmol木糖所需的酶量。

[0078] 实施例6：海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶酶学性质的测定

[0079] 1.海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶的最适温度及热稳定性

[0080] 木聚糖酶的最适温度的测定为在磷酸盐缓冲液(pH6.0)体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶分别在45、60、70℃下处理10-60min，冷却至室温后，再在60℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图5) 表明，其最适温度为70℃。木聚糖酶的热稳定性实验结果表明(图6)，在45℃下处理60min后，酶活均保持在88％以上；在60℃下处理60min后，酶活残留75％以上。

[0081] 2.海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶的最适pH和pH稳定性

[0082] 将实施例3中稀释的粗酶液在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。山毛榉木聚糖用不同pH的酶反应缓冲液配置，50mM柠檬酸盐缓冲液4.0-6.0，50mM磷酸盐缓冲液6.0-8.0，50mM Tris-HCl缓冲液8.0-9.0。在60℃下进行木聚糖酶酶活测定。结果(图7)表明，本发明菌株所产木聚糖酶的最适pH为6.0，在pH5-8的范围内，酶活性均稳持在最大酶活性的40％以上。粗酶液于上述各种不同pH的缓冲液中50℃处理30min，冷却至室温后酸碱滴定调节pH至6.0，再在pH6.0缓冲液体系中60℃下测定酶活性，以研究木聚糖酶的pH稳定性。结果(图8)表明，木聚糖酶在pH5-9的范围内稳定，在pH为9的条件下，残留木聚糖酶酶活在最大酶活性的83.3％，说明此酶具有较好的耐碱性。

[0083] 3.产酶最适底物及不同金属离子和化学试剂对酶活的影响

[0084] 分别以1％的山毛榉木聚糖、桦木木聚糖、燕麦木聚糖、滤纸为底物，在pH6.0、温度60℃体系下测定木聚糖酶活。结果(见表3)表明，本发明菌株所产木聚糖酶的最适底物为山毛榉木聚糖，对农业废弃物玉米芯木聚糖也具有很好的降解性，该木聚糖酶无纤维素酶活性。在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1mmol/L和10mmol/L。在60℃，pH6.0条件下测定酶活性。结果2+ 2+
(表4)表明，低浓度的Mn 、SDS和EDTA对木聚糖酶酶活有一定的抑制作用；高浓度的Zn
2+ 2+
和EDTA对酶活有一定的抑制作用，高浓度的Cu 、Fe 和SDS对酶活有强烈的抑制作用。高
2+ 2+ +
浓度的Ca ，Mg ，K 等离子对酶活影响不大。

[0085] 4.海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶的NaCl耐受性

[0086] 向酶促反应体系中加入NaCl，终浓度为0.5-5mol/L，研究其对木聚糖酶酶活的影响，在60℃，pH6.0条件下测定酶活性。结果(图9)表明，当NaCl终 浓度为1mol/L时，木聚糖酶酶活维持在86.6％；当NaCl终浓度为2M时，残留酶活70.4％；当NaCl终浓度为5mol/L时，残留酶活46.8％。在极端高盐环境下，本发明菌株所产木聚糖酶依然保持较高酶活力，说明该木聚糖酶具有较好的NaCl耐受性。

[0087] 5.海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶对廉价生物质的降解

[0088] 将菊芋秸秆，玉米秸秆，稻草经粉碎后过60目筛，以固液比1∶12用4％稀硫酸在121℃下处理1h，冷却至室温后用去离子水反复冲洗至pH为中性。过夜干燥后，分别称取1g上述物料与海带纤维溶于20mL50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)。60℃预热30min后，以50U/g比例加入粗酶液，60℃下反应1h，反应结束后吸取上清液，按实施例4中方法测定还原糖浓度。结果(表5)表明，本发明菌株所产木聚糖酶对菊芋秸秆和海带纤维有较好的降解性。海洋来源的海带纤维中含有一定比例的NaCl，本发明中的木聚糖酶具有较好的NaCl耐受性，可以高效降解海带纤维。本研究结果说明本发明中的木聚糖酶在生物质资源的高值化生物转化方面有广阔的应用前景。

[0089] 表3海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶最适底物

[0090]

[0091] 附：以山毛榉木聚糖为底物时的酶活为100％。

[0092] 表4金属离子和化学试剂对海洋绿色产色链霉菌木聚糖酶的影响

[0093]

[0094] 附：以未加入离子处理的样品酶活为100％。

[0095] 表5海洋绿色产色链霉菌对廉价生物质的降解

[0096]

[0097] 附：以对菊芋秸秆的降解率为100％。