本发明公开一种抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒及其制备与应用。本发明通过将siRNA-3D的转录模板、siRNA-L的转录模板、siRNA-2B的转录模板与siRNA-VP1的转录模板分别与U6启动子连接，克隆入载体pAdeno-X，得到能分别转录、串联结构的质粒，再将该质粒线性化后通过包装细胞包装，得到重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1。该重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1的防治效果优于重组腺病毒rAdeno-2B-VP1应用的效果。可见，本发明提供的重组质粒能有效抑制口蹄疫病毒复制和抗口蹄疫病感染。
1.一种抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒，其特征在于：为腺病毒重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1线性化后，经过包装细胞包装得到；
所述的腺病毒重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1的载体为pAdeno-X，重组基因片段为四个串联的、能分别独立转录的基因片段；
所述的四个串联的、能分别独立转录的片段为U6启动子与siRNA-3D的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA- L的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA-2B的转录模板融合基因片段和U6启动子与 siRNA- VP1的转录模板融合基因片段；
5’-GTTGATCTCCGTGGCAGGAttcaagagaATCCTGCCACGGAGATCAAC-3’反义链为：
5’-GTTGATCTCCGTGGCAGGAT tctcttgaaTCCTGCCACGGAGATCAAC-3’siRNA-L的转录模板的核苷酸序列如下所示：
5’-ACACCGGAATCGGCACCGCttcaagagaGCGGTGCCGATTCCGGTGT-3’反义链为：
5’-ACACCGGAATCGGCACCGCtctcttgaaGCGGTGCCGATTCCGGTGT-3’siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示：
5’-CCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGC-3’；
5’-GCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGG-3’；
siRNA-VP1的转录模板的核苷酸序列如下所示：
5’-GAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCC-3’；
5’-GGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTC-3’； 以上序列的小写部分为茎环结构，粗体部分和斜体部分互补。
2.根据权利要求1所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒，其特征在于：所述的重组基因片段为U6启动子与siRNA-3D的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA- L的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA-2B的转录模板融合基因片段和U6启动子与 siRNA- VP1的转录模板融合基因片段依次串联得到。
3.权利要求1或2所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，其特征在于包含以下步骤：（1）将如下所示的siRNA-3D的转录模板、siRNA-L的转录模板、siRNA-2B的转录模板和siRNA-VP1的转录模板分别克隆入psiren-shuttle穿梭载体，位于U6启动子的下游，得到重组质粒pShuttle-3D、pShuttle-L、pShuttle-2B和pShuttle-VP1；
5’-GATCCGGTTGATCTCCGTGGCAGGAttcaagagaATCCTGCCACGGAGATCAACCTTTTTTTCTAGAG-3’反义链为：
5’-AATTCTCTAGAAAAAAGTTGATCTCCGTGGCAGGATtctcttgaaTCCTGCCACGGAGATCAACCG-3’siRNA-L的转录模板的核苷酸序列如下所示：正义链为：
5’-GATCCGACACCGGAATCGGCACCGCttcaagagaGCGGTGCCGATTCCGGTGTCTTTTTTTCTAGAG-3’反义链为：
5’-AATTCTCTAGAAAAAAAGACACCGGAATCGGCACCGCtctcttgaaGCGGTGCCGATTCCGGTGTCG-3’siRNA-VP1的转录模板的核苷酸序列如下所示：正义链为：
5’-GATCCGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCTTTTTTTCTAGAG-3’；
5’-AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCG-3’ siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示：
5’-GATCCGCCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGCTTTTTTTCTAGAG-3’；
5’-AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGGCG-3’；
正义链寡核苷酸的5’端突出部分是BamHI酶切位点粘性末端，反义链寡核苷酸的5’端突出部分是EcoRI酶切位点粘性末端，粗体部分和斜体部分互补，小写字体为loop环序列，下划线部分为7个连续T终止信号及其互补序列；
（2）以重组质粒pShuttle-3D、pShuttle-L、pShuttle-2B和pShuttle-VP1为模板，通过PCR分别得到U6启动子+3D融合片段、U6启动子+L融合片段、U6启动子+2B融合片段、U6启动子+VP1融合片段，再将这四个融合片段分别克隆入克隆载体上，得到串联结构、能分别独立转录的重组质粒pUC-3D-L-2B-VP1；
（3）通过体外连接法将PI-Sce I / I-Ceu I双酶切重组质粒pUC-3D-L-2B-VP1得到的目的片段与人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X载体骨架连接，得到重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1；
（4）重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1线性化后，通过包装细胞包装，得到重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1。
4.根据权利要求3所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的克隆的具体步骤为：首先通过BamHI和EcoRI双酶切psiren-shuttle穿梭载体；其次将权利要求3中所述的转录模板分别进行处理，将正义链和反义链按摩尔比1:1混合，变性处理，接着自然降温，得到有突出末端的双链；接着将有突出末端的双链与双酶切后的Psiren-shuttle穿梭载体连接，再转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到目的重组质粒。
5.根据权利要求3所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的克隆载体为pUC57载体。
6.根据权利要求3所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的线性化为通过PacI酶切线性化。
7.根据权利要求3所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的包装细胞为人胚肾细胞株HEK293。
8.一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，其特征在于：由权利要求1或2所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒制备得到。
抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒及制备与应用
技术领域
[0001] 本发明属于口蹄疫防治技术领域，特别涉及一种抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒及制备与应用。
背景技术
[0002] 口 蹄 疫 (Foot-and-mouth disease，FMD) 是 由 口 蹄 疫 病 毒(Foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起偶蹄类动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病感染率高，感染后发病率最高可达100％，易感动物多达70余种，其中重要的经济畜种如猪、牛、羊等均易感。鉴于FMD不仅降低动物生产性能，造成巨大的直接经济损失，而且还影响动物及动物产品的国际贸易，因此所造成的间接损失更大，同时还会影响一个国家的国际形象，故素有“政治经济病”之称。
[0003] 各国学者对FMDV进行了广泛而又深入的研究。FMDV属小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)成员。该病毒有7个血清型，分别为A型、O型、C型、Asia I型、SAT I型、SAT II型和SAT III型，且血清型间无血清交叉反应和交叉免疫现象。各血清型又根据抗原亲缘关系分为不同的亚型，其亚型间抗原也有很大的差异。
[0004] 目前，FMD是严重威胁畜牧业发展的重要传染病，发达国家主要采取扑杀为主的防控措施，发展中国家主要采取疫苗接种和扑杀相结合的方法。但是疫苗接种后需要至少七天的时间才能产生保护作用，同时由于FMDV血清型多，各血清型之间几乎没有交叉保护性，所以现在应用的单血清型疫苗难以达到对不同血清型和亚型的变异毒株产生保护作用。
[0005] RNA干扰(RNAinterference，RNAi)现象的发现为疾病防控开启了希望之门。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由功能性双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的序列特异性转录后同源靶基因沉默现象，是近几年迅速发展起来的一项用于抑制病毒复制的新技术。科研人员将RNAi技术应用于多种病毒性疾病的治疗研究，如艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、禽流感病毒等；RNAi技术也为抗FMDV感染方面的研究提供了新的思路。
发明内容
[0006] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒。
[0007] 本发明的另一目的在于提供所述抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法。
[0008] 本发明的再一目的在于提供所述抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的应用。
[0009] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒，为腺病毒重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1线性化后，经过包装细胞包装得到；
[0010] 所述的腺病毒重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1的载体为pAdeno-X，重组基因片段为四个串联的、能分别独立转录的基因片段；
[0011] 所述的四个串联的、能分别独立转录的片段为U6启动子与siRNA-3D的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA-L的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA-2B的转录模板融合基因片段和U6启动子与siRNA-VP1的转录模板融合基因片段；
[0012] 所述的重组基因片段优选为U6启动子与siRNA-3D的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA-L的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA-2B的转录模板融合基因片段和U6启动子与siRNA-VP1的转录模板融合基因片段依次串联得到；
[0013] siRNA-3D的转录模板的核苷酸序列如下所示：
[0014] 正义链为(5’-3’)：
[0015] ATCCTGCCACGGAGATCAAC
[0016] 反义链为(5’-3’)：
[0017] GTTGATCTCCGTGGCAGGATtctcttgaa
[0018] siRNA-L的转录模板的核苷酸序列如下所示：
[0019] 正义链为(5’-3’)：
[0020]ttcaagaga
[0021] 反义链为(5’-3’)：
[0022] ACACCGGAATCGGCACCGCtctcttgaa
[0023] siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示：
[0024] 正义链为(5’-3’)：
[0025] ttcaagagaC；
[0026] 反义链为(5’-3’)：
[0027] GCCAGATGCAGGAAGACATG CATGTCTTCCTGCATCTGG；
[0028] siRNA-VP1的转录模板的核苷酸序列如下所示：
[0029] 正义链为(5’-3’)：
[0030]ttcaagaga C：
[0031] 反义链为(5’-3’)：
[0032] GGAGTCTGCGGACCCCGTGACT AGTCACGGGGTCCGCAGACTC；
[0033] 以上序列的小写部分为茎环结构，粗体部分和斜体部分互补，以以上序列为模板，转录得到的siRNA为具有loop结构的dsRNA；
[0034] 所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，优选包含以下步骤：
[0035] (1)将如下所示的siRNA-3D的转录模板、siRNA-L的转录模板、siRNA-2B的转录模板和siRNA-VP1的转录模板分别克隆入PSIREN-shuttle穿梭载体，位于U6启动子的下游，得到重组质粒pShuttle-3D、pShuttle-L、pShuttle-2B和pShuttle-VP1；
[0036] siRNA-3D的转录模板的核苷酸序列如下所示：
[0037] 正义链为(5’-3’)：
[0038] G A T C C GttcaagagaA CTTTTTTTCTAGAG
[0039] 反义链为(5’-3’)：
[0040] AATTCTCTAGAAAAAAGTTGATCTCCGTGGCAGGATtctcttgaaCG
[0041] siRNA-L的转录模板的核苷酸序列如下所示：
[0042] 正义链为(5’-3’)：
[0043] G A T C C Gttcaagaga
[0044] CTTTTTTTCTAGAG
[0045] 反义链为(5’-3’)：
[0046] AATTCTCTAGAAAAAAAGACACCGGAATCGGCACCGCtctcttgaaCG
[0047] siRNA-VP1的转录模板的核苷酸序列如下所示：
[0048] 正义链为(5’-3’)：
[0049] G A T C C Gttcaagaga CTTTTTTTCTAGAG；
[0050] 反义链为(5’-3’)：
[0051] AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTCG
[0052] siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示：
[0053] 正义链为(5’-3’)：
[0054] G A T C C Gttcaagaga CTTTTTTTCTAGAG；
[0055] 反义链为(5’-3’)：
[0056] AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGCG
[0057] 正义链寡核苷酸的5’端突出部分是BamHI酶切位点粘性末端，反义链寡核苷酸的5’端突出部分是EcoRI酶切位点粘性末端，加粗部分为siRNA正义链，斜体部分为siRNA的反向互补链，小写字体为loop环序列，下划线部分为7个连续T终止信号及其互补序列；
[0058] (2)以重组质粒pShuttle-3D、pShuttle-L、pShuttle-2B和pShuttle-VP1为模板，通过PCR分别得到U6启动子+3D融合片段、U6启动子+L融合片段、U6启动子+2B融合片段、U6启动子+VP1融合片段，再将这四个融合片段分别克隆入克隆载体上，得到串联结构、能分别独立转录的重组质粒pUC-3D-L-2B-VP1；
[0059] (3)通过体外连接法将PI-Sce I/I-Ceu I双酶切重组质粒pUC-3D-L-2B-VP1得到的目的片段与人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X载体骨架连接，得到重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1；
[0060] (4)重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1线性化后，通过包装细胞包装，得到重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1；
[0061] 步骤(1)中所述的克隆的具体步骤优选为：首先通过BamHI和EcoRI双酶切pSIREN-shuttle穿梭载体；其次将上述的转录模板分别进行处理，将正义链和反义链按摩尔比1∶1混合，变性处理，接着自然降温，得到有突出末端的双链；接着将有突出末端的双链与双酶切后的PSIREN-shuttle穿梭载体连接，再转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到目的重组质粒；
[0062] 步骤(2)中所述的克隆载体优选为pUC57载体；
[0063] 步骤(4)中所述的线性化优选为通过PacI酶切线性化；
[0064] 步骤(4)中所述的包装细胞优选为人胚肾细胞株HEK293。
[0065] 一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，由上述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒制备得到。
[0066] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0067] 本发明提供的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒，能有效抑制口蹄疫病毒复制和抗口蹄疫病感染。通过实验证实，重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1的防治效果优于重组腺病毒rAdeno-2B-VP1应用的效果。
附图说明
[0068] 图1是筛选重组腺病毒质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1进行的质粒PCR鉴定电泳图；其中，泳道1～8为被筛选的质粒；泳道9为阴性对照；泳道M为DNAMarker DL2000。
[0069] 图2是重组腺病毒质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1的PacI酶切鉴定电泳图；其中，泳道M为DNA Marker DL15000；泳道N为DNA Marker DL2000；泳道1和泳道2为重组腺病毒质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1 PacI酶切产物。
[0070] 图3是不同时间点上清中FMDV滴度的测定图。
[0071] 图4是预防和治疗方式结合下不同重组腺病毒对感染FMDV豚鼠的保护率。
具体实施方式
[0072] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0073] 实施例1
[0074] 本发明是以不同年代和地区分离的O型FMDV为基础，选择FMDV 3D、L、2B、VP1基因高度保守序列设计合成siRNA，克隆入PSIREN-shuttle穿梭载体，构建重组质粒pShuttle-3D、pShuttle-L、pShuttle-2B和pShuttle-VP1，具体过程如下(以下构建过程连接反应按照T4 DNA连接酶说明书操作，阳性克隆筛选按照分子克隆实验指南操作，其中所用的感受态细胞为大肠杆菌DH5α(宝生物工程公司)：
[0075] (1)将siRNA-3D的转录模板、siRNA-L的转录模板、siRNA-2B的转录模板和siRNA-VP1的转录模板分别用去离子水稀释成相同的浓度(5pmol/μL)，分别把互补的两段寡核苷酸(各5μL混合)混匀后放在PCR扩增仪上，95℃2min，然后自然降到常温进行处理。将处理后形成的双链siRNA寡核苷酸片段分别与经BamHI和EcoRI双酶切处理后的pSIREN-Shuttle(Clontech公司)连接，得到pShuttle-3D(siRNA-3D的转录模板位于U6启动子下游)、pShuttle-L(siRNA-L的转录模板位于U6启动子下游)、pShuttle-2B(siRNA-2B的转录模板位于U6启动子下游)和pShuttle-VP1(siRNA-VP1的转录模板位于U6启动子下游)。
[0076] siRNA-3D的转录模板的核苷酸序列如下所示：
[0077] 正义链为(5’-3’)：
[0078] G A T C C GttcaagagaA CTTTTTTTCTAGAG；
[0079] 反义链为(5’-3’)：
[0080] AATTCTCTAGAAAAAAGTTGATCTCCGTGGCAGGATtctcttgaaCG。
[0081] siRNA-L的转录模板的核苷酸序列如下所示：
[0082] 正义链为(5’-3’)：
[0083] G A T C C Gttcaagaga CTTTTTTTCTAGAG；
[0084] 反义链为(5’-3’)：
[0085] AATTCTCTAGAAAAAAAGACACCGGAATCGGCACCGCtctcttgaaCG。
[0086] siRNA-VP1的转录模板的核苷酸序列如下所示：
[0087] 正义链为(5’-3’)：
[0088] G A T C C Gttcaagaga CTTTTTTTCTAGAG；
[0089] 反义链为(5’-3’)：
[0090] AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTCG。
[0091] siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示：
[0092] 正义链为(5’-3’)：
[0093] G A T C C Gttcaagaga CTTTTTTTCTAGAG；
[0094] 反义链为(5’-3’)：
[0095] AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGCG。
[0096] (2)①设计引物P3D-F/P3D-R，以pShuttle-3D为模板，用PCR方法扩增U6启动子与siRNA-3D融合片段(理论扩增片段长为420bp)、融合片段连入pUC57(宝生物工程公司，按照说明书操作)的EcoRV位点，得到pUC57-3D。引物序列如下(5’-3’)：
[0097] P3D-F：gactaggtaccACCTGACGTAACTATAACGGTCCTAAGG；
[0098] P3D-R：gtgtaCTGCAGTTCCTCGAGCTCCGCACCCGACATAGATGAATTC。
[0099] 反应程序：94℃5min，94℃45s，54℃30s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
[0100] ②设计引物PL-F/PL-R，引物序列如下：
[0101] PL-F：GACATCTCGAGGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCC
[0102] PL-R：GTGATCTGCAGTGCCATTTCATTACCTCTTTCTCCGCAC
[0103] 以pShuttle-L为模板，用PCR方法扩增U6启动子与siRNA-L融合片段(理论扩增片段长为390bp)、融合片段连入pUC57-3D的Xhol/PstI位点，构建重组质粒pUC-3D-L。
[0104] 反应程序：94℃5min，94℃45s，52℃45s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
[0105] ③分别设计2对引物PVP1-F/PVP1-R与P2B-F/P2B-R，模板分别为pShuttle-VP1和pShuttle-2B，用PCR方法分别扩增U6启动子与siRNA-VP1融合片段(理论扩增片段长为329bp)、U6启动子与siRNA-2B融合片段(理论扩增片段长为325bp)，引物序列如下(5’-3’)：
[0106] PVP1-F：CCGCTCGAGGGGCAGGAAGAGGGCCTA；
[0107] PVP1-R：AAAACTGCAGTGCCATTTCATTACCTCTTTCTC；
[0108] P2B-F：ATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCG；
[0109] P2B-R：AACTGCAGACTCTCGAGGCACCCGACATAGATGAATTC。
[0110] PCR体系按TaKaRa公司Ex-Taq DNA聚合酶使用说明进行，反应程序：94℃5min，94℃30s，60℃15s，72℃45s，30个循环，最后72℃延伸3min。
[0111] 将U6启动子与siRNA-VP1融合片段、U6启动子与siRNA-2B融合片段分别克隆入pMD19-T simple载体(宝生物工程公司，按照说明书操作)中，得到的连接产物转化感受态细胞大肠杆菌DH5α(宝生物工程公司)后，筛选得到质粒TVP1和质粒T2B。用限制性内切酶Pst I、Xho I进行双酶切质粒TVP1，回收和纯化大小约为350bp的片段，用限制性内切酶Pst I、Xho I进行双酶切质粒T2B，回收载体。酶切体系如下表所示：
[0112]
[0113] 反应条件：37℃酶切6h。
[0114] 将长度为350bp的含有U6启动子与siRNA-VP1的片段克隆入质粒T2B载体中，得到含2B-VP1双基因串联shRNA表达盒的重组质粒T2B-VP1，VP1和2B的排列顺序为U6-2B-U6-VP1。
[0115] 以限制性内切酶PI-Sce I/I-Ceu I双酶切(参照NEB产品说明操作)重组质粒T2B-VP1和人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X(Clontech公司)，利用体TM外连接法(参照BD Adeno-X Expression System说明书操作)获得了重组质粒；
经过PCR扩增鉴定(上游引物P1：5′-CGGGAAAACTGAATAAGACG-3′和下游引物P2：
5′-CATCAAACGAGTTGGTGCT-3′)、酶切鉴定(PacI酶切鉴定)及序列测定，证实成功构建了重组腺病毒质粒pAdeno-2B-VP1。
[0116] PCR扩增鉴定条件：94℃5min，94℃45s，50℃45s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
[0117] 以pAdeno-2B-VP1为模板，引物为P2B-F-2/PVP1-R-2，扩增得到760bp的融合片段，通过Acc65I/HindIII酶切位点克隆入pUC57载体，得到重组质粒pUC-2B-VP1。引物序列如下(5’-3’)：
[0118] P2B-F-2：TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGGGTACCTCTAAGCTTGGGCAGGA；
[0119] PVP1-R-2：GTAGTCTGCCATTTCATTACCTCTTTCTCCGCAC。
[0120] ④以步骤②得到的pUC-3D-L为模板，引物P3D-F和PL-R，扩增长度约750bp的片段，克隆入pUC-2B-VP1的Acc65I/HindIII位点，构建串联siRNA表达盒的重组质粒pUC-3D-L-2B-VP1，排列顺序为U6-3D-U6-L-U6-2B-U6-VP1。
[0121] 反应程序：94℃5min，94℃45s，55℃45s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
[0122] (3)以限制性内切酶PI-Sce I/I-Ceu I双酶切(参照NEB产品说明操作)重组质粒pUC-3D-L-2B-VP1和人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X(Clontech公司)，利用TM体外连接法(参照BD Adeno-X Expression System说明书操作)获得了重组质粒；经过PCR扩增鉴定(上游引物P1和下游引物P2：)、酶切鉴定(PacI酶切鉴定)及序列测定，证实成功构建了重组腺病毒质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1(图1、图2)。该含有4个串联的FMDV特异性siRNA片段，且每个独立片段前均带有U6启动子基因序列。
[0123] PCR扩增鉴定条件：94℃5min，94℃45s，50℃45s，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min。
[0124] 本发明构建的重组腺病毒质粒pAdeno-3D-L-2B-VP1用PacI酶切线性化，参照TMBD Adeno-X Expression System说明书，将纯化后的酶切产物转染人胚肾细胞(HEK293细胞，中国科学院细胞库)，包装含有FMDV 3D、L、2B、VP1多基因串联的siRNA片段的重组TM
腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1，病毒经增殖、纯化(参照BIOMIGA ViraTrap Adenovirus Puricication Miniprep Kit说明书操作)。利用终点稀释法分别测定纯化前和纯化后的重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1，纯化前的病毒滴度为108pfu/mL，纯化后的病毒滴度为
10
3×10 pfu/mL。同样的方法通过处理重组腺病毒质粒pAdeno-2B-VP1，得到包装含有FMDV
2B、VP1基因串联的siRNA片段的重组腺病毒rAdeno-2B-VP1，病毒经增殖、纯化(参照TM
BIOMIGA ViraTrap Adenovirus Puricication MiniprepKit说明书)，利用终点稀释法测
10
定病毒滴度为4×10 pfu/mL，将其用于做对照。
[0125] 本发明中将猪肾细胞IBRS-2细胞(美国模式培养物集存库ATCC)以细胞密度5
为3×10/mL，按每孔100μL的量加到96孔细胞培养板上，细胞达到90％融合时，用重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1以10MOI的量感染IBRS-2细胞，12h后再接种100TCID50 FMDV O型(FMDV O/HKN/2003)(已在文献《口蹄疫病毒对猪树突状细胞的免疫生物学特性影响的研究》，中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第七次研讨会论文集，2008，502-508”中公开)，其后立即以10 MOI的量的重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1感染IBRS-2细胞。重组腺病毒rAdeno-2B-VP1的操作同前。检测结果显示，相对于重组腺病毒rAdeno-2B-VP1，本发明提供的rAdeno-3D-L-2B-VP1采用预防和治疗相结合的方式72h内可以100％抑制FMDV在IBRS-2细胞中的复制，重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1在细胞水平上对FMDV感染具有较好的保护效果。
[0126] 应用豚鼠(250～300g/只豚鼠(雌雄各半)购自广东省医学实验动物中心)作为动物模型，评估重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1在动物个体内对FMDV感染的抑制效应。各组豚鼠(5只/组)，将豚鼠分别预先接种未纯化(即纯化前)重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1、纯化重组腺病毒rAdeno-2B-VP1及纯化重组腺病毒8
rAdeno-3D-L-2B-VP1，接种量分别为10PFU；24h后感染FMDV，并分别立即以未纯化重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1、纯化重组腺病毒rAdeno-2B-VP1及纯化重组腺病毒
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rAdeno-3D-L-2B-VP1分别进行治疗，接种量分别为10PFU。结果发现，两次注射纯化重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1保护率(未发病率)在4天内达到了100％，至第7d保护率维
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持在60％。以上结果说明用10PFU纯化重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1进行预防和治疗能最大程度地增强豚鼠对FMDV的抵抗力，而且纯化的重组腺病毒比未纯化的重组腺病毒防控效果较高(对豚鼠的保护率高20％)。虽然rAd-3D-L-2B-VP1相比rAdeno-2B-VP1，在
7d内对豚鼠的保护率基本相当，但较后者可以推迟豚鼠的发病时间。
[0127] 可见，rAd-3D-L-2B-VP1在动物水平上对FMDV感染具有较好的保护效果。
[0128] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
