甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA及其克隆方法与重组应用

摘要

本发明属于生物基因工程领域，甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3具有SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的序列。本发明克隆方法是：从甘蔗条螟预蛹期幼虫中提取总RNA，反转录合成cDNA；根据不同鳞翅目昆虫蜕皮调节转录因子的保守序列设计简并引物，PCR扩增甘蔗条螟CsHR3基因的中间片段，再通过3’-RACE技术设计特异性引物，成功获得CsHR3基因1266bp片段。本发明采用细菌介导RNAi技术在RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌HT115中表达dsRNA，获得具有生物活性的dsRNA，通过饲喂甘蔗条螟幼虫来沉默甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3基因，使甘蔗条螟不能蜕皮或破坏其正常生长发育过程，从而用于甘蔗条螟害虫的生物防治；或者通过基因工程方法将甘蔗条螟蜕皮调节转录因子转入作物，获得具有抗虫能力的作物。

权利要求

1.一种甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3 的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。

2.权利要求1所述甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所述。

3.权利要求1所述甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA的重组应用，采用细菌介导RNAi技术在RNaseIII缺陷型大肠杆菌HT115中表达dsRNA，获得具有生物活性的dsRNA，通过饲喂甘蔗条螟幼虫，来沉默甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3 基因，使甘蔗条螟不能蜕皮或破坏其正常生长发育过程，从而用于甘蔗条螟害虫的生物防治。

说明书

甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA及其克隆方法与重组应

用

技术领域

[0001] 本发明属于生物基因工程技术领域中的克隆、表达技术，具体涉及甘蔗条螟生长发育关键基因——蜕皮调节转录因子CsHR3 基因克隆及细菌介导RNAi技术表达CsHR3 dsRNA，来沉默甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3基因，使甘蔗条螟不能蜕皮或破坏其正常生长发育过程。

背景技术

[0002] 随着世界人口的急剧增长，如何提高农作物产量是一个迫在眉睫的问题。据统计，因虫害引起的粮食损失占整个粮食收成的20%。因此，如何有效控制虫害是提高作物产量的一个重要因素。大量使用化学农药虽然可以抑制虫害，但容易引起昆虫的抗性，而且对环境破坏极大，不利于人类的可持续发展。随着生物技术的快速发展，通过转基因方法改造植物，提高植物自身的抗虫害能力已成为农作物育种的主流。上世纪九十年代，科学家们利用转基因手段使农作物表达Bt蛋白以提高农作物对农业害虫的生物防治在全球被广泛使用。然而，最近的研究发现：有些昆虫的中肠上皮细胞中丢失了一类能与Bt蛋白结合的受体而使昆虫对Bt蛋白产生了抗性。最近，在农业上RNAi技术已发展成为一种控制虫害、提高作物品质的新方法。

[0003] RNA干扰（RNAi）是一种新发现的基因调控机制。人们从植物的基因表达共抑制和真菌的抑菌作用现象发现了RNA干扰这一古老的生物体基因调控机制。早在1998年，Fire等人发现双链RNA（dsRNA）可导致靶基因的表达抑制。不久，RNA干扰已发展成为一种成熟技术，被广泛应用于靶基因的功能研究中。 在昆虫中，通过dsRNA诱导的RNA干扰（RNAi）可用来研究昆虫基因的功能。尤其是近年来，细菌介导或植物介导RNAi表达dsRNA的方法已在多种昆虫中诱导靶标基因的沉默。然而，还有很多科学问题需要去探讨和研究，如通过RNAi介导沉默害虫非中肠基因能否诱导害虫死亡表型的出现；RNAi介导表达dsRNA量与害虫死亡表型或生长发育阻碍是否呈正相关；RNAi介导沉默靶标基因的周期与害虫生测表型之间的相关性；选择哪一靶标基因在害虫生物防治中周期短、生测效果好、更加高效等，这一系列问题都需要在试验探索和研究中验证。

[0004] RNAi技术在昆虫中研究功能基因的方法主要是注射法，一般通过把预干扰靶标基因dsRNA或siRNA用微量注射器导入昆虫的胚胎或体腔，从而实现对靶标基因mRNA表达的抑制。注射法RNAi虽然在昆虫功能基因方面取得了巨大的成绩，但也存在以下诸多问题：首先，注射法RNAi对实验操作人员技术要求很高、难度大、强度大，极易因操作不当而导致数据不准及昆虫死亡。其次，注射法RNAi制备dsRNA或siRNA均需要借助昂贵的国外试剂盒完成，增加了实验成本，所制备dsRNA或siRNA的量却很少。最后，注射法RNAi往往需要对单一昆虫逐个进行注射操作，为其广泛应用田间害虫生物防治增加了难度。为了能满足方便地研究昆虫功能基因需要，特别是为探索新的害虫生物防治方法，需要更好的细菌介导或植物介导RNAi技术在昆虫功能基因研究应用。

[0005] 蜕皮调节转录因子是一类同时启动蜕皮早期基因簇表达，又抑制蜕皮晚期基因簇表达的调节因子，在昆虫蜕皮过程中发挥重要的基因表达调控作用。现有研究发现，可从多种昆虫中获得HR3 家族的生长发育关键基因，如棉铃虫HaHR3、烟草天蛾MHR3、果蝇DHR3等。Josefa等从德国小蠊中克隆到蜕皮调节转录因子BgHR3，并通过RNAi技术抑制BgHR3基因表达，结果发现幼虫不能脱掉旧表皮，发生皮层溶离，表明BgHR3 基因直接参与德国小蠊幼虫蜕皮。昆虫若不能正常蜕皮，则无法变成成虫，从而形成取食量降低、没有生命力甚至死亡表型的个体。蜕皮调节转录因子是蜕皮过程中关键因子，同时也受到机体相关基因的严格调控，当表达水平降低或异常提高时都会影响昆虫的正常蜕皮。因此，打破蜕皮基因的平衡，干扰昆虫蜕皮，破坏其正常的生长发育过程，可达到杀灭害虫和控制害虫种群的目的。

[0006] 国外已对果蝇、烟草天蛾、德国小蠊等蜕皮调节转录因子进行了基因克隆和作用机理研究。其中果蝇的DHR3研究较为深入，该基因在果蝇蜕皮和变态生长发育中起关键作用。GenBank数据库中目前尚无关于甘蔗条螟蜕皮调节因子基因的记录和研究报道。

发明内容

[0007] 本发明目的在于提供一种从甘蔗条螟幼虫中提取的甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA，并提供甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法以及重组应用，还提供了一种细菌介导RNAi技术防治甘蔗条螟的新方法。

[0008] 为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

[0009] 本发明从甘蔗条螟中克隆到甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3 基因的cDNA，它具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列：

[0010] （1）SEQ ID NO.1 的信息

[0011] （a）序列特征：

[0012] *长度：1266碱基对

[0013] *类型：核酸

[0014] *链型：双链

[0015] *拓扑结构：线性

[0016] （b）分子类型：cDNA

[0017] （c）假设：否

[0018] （d）反义：否

[0019] （e）最初来源：甘蔗条螟（Chilo sacchariphagus）

[0020] （f）序列描述：SEQ ID NO. 1

[0021]

[0022] （2）SEQ ID NO.2的信息

[0023] （a）序列特征

[0024] *长度： 421氨基酸

[0025] *类型：氨基酸

[0026] *链型：单链

[0027] *拓扑结构：线性

[0028] （b）分子类型：蛋白质

[0029] （c）序列描述：SEQ ID NO. 2。

[0030] 本发明甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA的克隆方法，通过以下步骤进行：

[0031] （1）从甘蔗条螟幼虫预蛹期中提取总RNA，利用反转录酶合成cDNA；

[0032] （2）根据不同鳞翅目昆虫蜕皮调节转录因子的保守序列设计简并引物：

[0033] CsHR3-middle fragment-P1：5'-ACAGWGGTGAACTACCAGTG -3'

[0034] CsHR3-middle fragment-P2：5'-GACCATGRAATTGGTCGCT-3'

[0035] （3）以cDNA为模板，PCR扩增甘蔗条螟CsHR3基因的中间片段；

[0036] （4）纯化步骤（3）所得PCR产物，琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pMD19-T simple 载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top10，37℃平板培养，蓝白斑筛选含CsHR3 中间片段的阳性克隆子；

[0037] （5）根据CsHR3 中间片段的测序结果，设计3’RACE特异性引物，以甘蔗条螟cDNA为模板，PCR扩增CsHR3基因的3’片段序列；

[0038] CsHR3-3' RACE-GSP1：5' - CGGGTCAACAGGAATAGATGTCA -3'

[0039] CsHR3-3' RACE-GSP2：5'- CAGCGCCTGACTCAGTGTATGAC-3'

[0040] （6）纯化步骤（5）所得PCR产物，琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化产物连接到pMD19-T载体上，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top10，37℃平板培养，蓝白斑筛选获得CsHR3 基因3’端的阳性克隆子；

[0041] （7）将步骤（4）和（6）所得的阳性克隆子进行序列测定，然后将测定所得序列通过生物信息学软件DNAman拼接，得到CsHR3 基因1266 bp序列。

[0042] 具体的，所述步骤（1）为：从田间采集的甘蔗条螟预蛹期幼虫中，采用一步法提取总RNA。然后利用总RNA反转录合成cDNA，具体为：取总RNA 5微升（50 纳克）、Random引物1微升（0.5微克每微升）、底物dNTPs 2微升（2.5毫摩尔），用RNase-free H2O加至10微升，混匀，65℃保温5min，迅速放至冰上冷却3min；然后在上述混合物中加入5×Primer Script Buffer 4微升、RNA酶抑制剂0.5微升（40单位每微升）、AMV反转录酶0.5微升（200单位每微升），并用RNase-free H2O加至20微升，42℃反应60min，70℃灭火15min，4℃冷却，-20℃保存备用。

[0043] 步骤（3）和（5）中PCR扩增所用的反应试剂组成及反应条件如下：首先将下述试剂混合在一起，

[0044] 模板cDNA 1µl

[0045] 脱氧核苷酸底物dNTP 4µl

[0046] Ex-Taq DNA聚合酶 0.5µl

[0047] 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液 5µl

[0048] 正向引物（10µM） 2µl

[0049] 反向引物（10µM） 2µl

[0050] ddH2O 35.5µl

[0051] 总体积 50µl

[0052] 反应条件为：首先94℃预变性3分钟；然后进行如下循环：94℃30秒，50℃30秒，72℃2分钟，共进行32循环；最后72℃延伸10分钟，16℃保存备用。

[0053] 本发明所述甘蔗条螟蜕皮调节转录因子cDNA的重组应用，采用细菌介导RNAi技术在RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌HT115中表达dsRNA，获得具有生物活性的dsRNA，通过饲喂甘蔗条螟幼虫，来沉默甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3基因，使甘蔗条螟不能蜕皮或破坏其正常生长发育过程，从而用于甘蔗条螟害虫的生物防治。或者通过基因工程方法将甘蔗条螟蜕皮调节转录因子转入作物，获得具有抗虫能力的作物，具体为：将CsHR3基因构建成ihpRNAi遗传转化载体导入甘蔗基因组，研究蜕皮调节转录因子功能缺陷对甘蔗条螟生物表型的影响，从而用于钻蛀性害虫甘蔗条螟的防治。由于甘蔗条螟属于鳞翅目螟蛾科，因此本发明对其它鳞翅目害虫，尤其是螟蛾科害虫的生物防治具有重要的参考价值。

[0054] 一种细菌介导RNAi防治甘蔗条螟的方法：选择甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3基因作为靶标，选定其CsHR3基因上含有非LBD功能结构域和LBD功能结构域的两个dsRNA干扰片段，构建细菌介导的RNAi重组载体L4440-CsHR3-I1、L4440-CsHR3-I2，同时选用绿色荧光蛋白基因EGFP作为阴性对照，清水作为负对照。通过热激法将上述载体导入Ecoli. HT115（RNaseⅢ缺陷型大肠杆菌）中，加入0.8mM IPTG进行诱导表达。提取细菌表达dsRNA进行甘蔗条螟幼虫的饲喂试验，检测3龄和5龄甘蔗条螟饲喂7天后表型变化及体内CsHR3基因mRNA降低水平。

[0055] 甘蔗条螟蜕皮过程是由激素介导调控的一系列基因组成的级联反应，蜕皮调节转录因子CsHR3 是蜕皮激素直接诱导的早期基因表达产物，该基因当被激活表达后又与其靶DNA上特异序列结合，直接参与蜕皮激素引发的晚期基因调控，是蜕皮级联反应中一重要关键因子。若蜕皮调节转录因子表达被抑制，则昆虫不能完成正常的蜕皮过程。因此，本发明借助细菌介导的RNAi技术，通过细菌表达靶标基因的dsRNA来沉默甘蔗条螟生长发育关键基因CsHR3 mRNA表达，使其正常生长发育受到抑制，干扰昆虫正常蜕皮，使其幼虫不能脱掉旧表皮，打破蜕皮基因的平衡，从而达到甘蔗条螟害虫生物防治的目的。该方法操作简单，针对生长发育关键基因设计特异RNAi靶标片段，研究基础好，前瞻性高，成本低，为探索甘蔗农业生产上害虫生物防治提供新的方法。

附图说明

[0056] 图1为三个靶标基因CsHR3-I1、CsHR3-I2和EGFP-I0的克隆和鉴定；其中M为DL2000；1号泳道为CsHR3基因干扰片段1目的条带；2号泳道为CsHR3 基因干扰片段2目的条带；3号泳道为阴性对照EGFP基因目的条带；

[0057] 图2 为重组表达载体pL4440-CsHR3-I1、pL44440-CsHR3-I2、pL4440-EGFP-I0结构示意图；

[0058] 图3为细菌中表达CsHR3和EGFP基因dsRNA的鉴定图；其中箭头所示为表达靶标基因dsRNA，且由于靶标基因大小不同而呈现不同位置条带与预期大小一致；（a）图为未经DNaseI酶处理，（b）图为经DNaseI酶处理；N表示未加IPTG处理，I表示加IPTG处理；

[0059] 图4为甘蔗条螟3龄幼虫在饲喂靶标基因dsRNA第7天后的生测效果图，图中（a）、（b）表示两个重复组；

[0060] 图5为甘蔗条螟5龄幼虫在饲喂靶标基因dsRNA第7天后的生测效果图，图中（a）、（b）表示两个重复组；

[0061] 图6 为甘蔗条螟3龄幼虫在饲喂靶标基因dsRNA第7天后的体重变化情况，图中（a）、（b）表示两个重复组；

[0062] 图7为 qRT-PCR检测饲喂靶标基因dsRNA后甘蔗条螟CsHR3基因mRNA变化情况，图中（a）、（b）表示两个重复组。

具体实施方式

[0063] 以下通过优选实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

[0064] 实施例1

[0065] 甘蔗条螟（Chilo sacchariphagus）生长发育关键基因CsHR3克隆。

[0066] 1、提取总RNA：采用Invitrogen公司Trizol法一步提取甘蔗条螟预蛹期幼虫的总RNA。

[0067] 2、合成cDNA：参考大连宝生物工程有限公司cDNA 试剂盒说明进行，具体为：取总RNA 5µl、Random引物 1 µl、底物dNTPs 2 µl，用RNase-free H2O加至10 µl，混匀，65℃保温5min，迅速放至冰上冷却3min；然后在上述混合物中加入5×Primer Script Buffer 4 µl、RNA酶抑制剂0.5 µl、AMV反转录酶0.5 µl，并用RNase-free H2O加至20 µl，42℃反应60min，70℃灭火15min，4℃冷却，-20℃保存备用。

[0068] 3、PCR扩增甘蔗条螟CsHR3 基因的中间片段：根据不同鳞翅目昆虫蜕皮调节转录因子的保守序列设计简并引物（引物序列如下）；以cDNA为模板，PCR扩增甘蔗条螟CsHR3基因的中间片段；

[0069] CsHR3-middle fragment-P1：5'-ACAGWGGTGAACTACCAGTG -3'

[0070] CsHR3-middle fragment-P2：5'-GACCATGRAATTGGTCGCT-3'

[0071] 链式聚合酶反应（PCR扩增）所用的反应试剂组成及反应条件如下：首先将下述试剂混合在一起，

[0072] 模板cDNA 1µl

[0073] 脱氧核苷酸底物dNTP 4µl

[0074] Ex-Taq DNA聚合酶 0.5µl

[0075] 10×Taq DNA 聚合酶缓冲液 5µl

[0076] 正向引物（10µM） 2µl

[0077] 反向引物（10µM） 2µl

[0078] ddH2O 35.5µl

[0079] 总体积 50µl

[0080] 反应条件为：首先94℃预变性3分钟，然后进行如下循环：94℃30秒，50℃30秒，72℃2分钟，共进行32循环，最后72℃延伸10分钟，16℃保存备用。

[0081] 4、PCR产物纯化：利用琼脂糖凝胶回收试剂盒（购自北京天根生物科技公司）对PCR产物回收、纯化，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

[0082] 5、PCR产物连接、转化与鉴定：取5µl上述PCR纯化产物，连接于pMD19-T simple 载体（大连宝生物工程有限公司产品），反应体系如pMD19-T simple 载体试剂盒所示，然后转化到大肠杆菌感受态细胞Top10，37℃平板培养，蓝白斑筛选（挑取白色重组菌落进行培养，使用克隆载体pMD19-T simple上通用引物M13-47和RV-M进行菌液PCR鉴定）含CsHR3中间片段的阳性克隆子。

[0083] 6、根据步骤5的PCR鉴定阳性克隆的测序结果，设计3’RACE特异性引物（引物序列如下），以甘蔗条螟cDNA为模板，PCR扩增CsHR3 基因的3’片段序列，PCR扩增所用的反应试剂组成及反应条件同上。

[0084] CsHR3-3' RACE-GSP1：5'- CGGGTCAACAGGAATAGATGTCA -3'

[0085] CsHR3-3' RACE-GSP2：5'- CAGCGCCTGACTCAGTGTATGAC-3'

[0086] 7、纯化步骤6所得PCR产物，琼脂糖凝胶回收目的片段，取纯化产物连接于pMD19-T simple 载体，然后转化大肠杆菌感受态细胞Top10，37℃平板培养，蓝白斑筛选获得CsHR3 基因3’端的阳性克隆子。

[0087] 8、将步骤5和7所得的阳性克隆子送Invitrogen-上海英俊生物技术有限公司进行序列测定，然后将测定所得序列通过生物信息学软件DNAman拼接，得到CsHR3 基因1266 bp序列。将所得序列与GenBank数据库序列比较。

[0088] 所得基因具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。

[0089] 实施例2

[0090] 构建细菌介导的RNAi重组载体L4440-CsHR3-I1、L4440-CsHR3-I2，同时选用绿色荧光蛋白基因EGFP作为阴性对照，清水作为负对照。细菌表达dsRNA饲喂试验，分为4个处理组，分别饲喂生长一致的3龄和5龄甘蔗条螟幼虫，重复3次试验。具体操作如下：

[0091] 1、CsHR3靶标干扰基因片段的选择

[0092] 考虑到蜕皮调节转录因子HR3 是昆虫蜕皮过程中发挥重要作用的基因表达调控因子，因此本实施例选择甘蔗条螟蜕皮调节转录因子CsHR3基因作为靶标，选定其CsHR3基因上含有非LBD功能结构域和LBD功能结构域的两个dsRNA干扰片段（即干扰片段1和2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示），两个dsRNA片段基因长度分别为346 bp和536bp，两者序列均源自SEQ ID NO.1。

[0093] 取一只甘蔗条螟预蛹期幼虫，按Invitrogen公司Trizol法（试剂盒说明）一步提取总RNA。再参考大连宝生物工程有限公司cDNA 试剂盒说明反转录合成cDNA，具体为：取总RNA 5 µl、Random引物 1 µl、底物dNTPs 2 µl，用RNase-free H2O加至10 µl，混匀，65℃保温5min，迅速放至冰上冷却3min；然后在上述混合物中加入5×PrimerScript Buffer 4 µl、RNA酶抑制剂0.5 µl、AMV反转录酶0.5 µl，并用RNase-free H2O加至20 µl，42℃反应60min，70℃灭火15min，4℃冷却，-20℃保存备用。

[0094] 以上述得到的甘蔗条螟cDNA为模板，以针对蜕皮调节转录因子CsHR3基因mRNA设计两对特异引物进行PCR扩增，分别获得CsHR3 基因的两个干扰片段基因（即干扰片段1和2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示）；同时以绿色荧光蛋白基因EGFP作为阴性对照，以便检验dsRNA干扰的效果。以上三对引物序列如下所示：

[0095] 扩增CsHR3 基因干扰片段1的引物（其中CTCGAG为限制性内切酶Xho Ⅰ位点，GGTACC为限制性内切酶Kpn Ⅰ位点）：

[0096] L4440-CsHR3-I1-P1: 5'-ccCTCGAG CAACACTGGACCTACATTGACA -3'[0097] L4440-CsHR3-I1-P2: 5'-ggGGTACCTCGGCACAATCTAACCACAT-3'

[0098] 扩增CsHR3基因干扰片段2的引物：

[0099] L4440-CsHR3-I2-P1: 5'- ccCTCGAGGTCCTGGTGAAGAGTCTGGCTGAA-3'[0100] L4440-CsHR3-I2-P2: 5'- ggGGTACCACAGGCACTGGATCTCGGGGTT-3'

[0101] 扩增阴性对照EGFP基因干扰片段的引物：

[0102] L4440-EGFP-I0-P1: 5'- ccCTCGAGCAGTGCTTCAGCCGCTACCC-3'

[0103] L4440-EGFP-I0-P2: 5'- ggGGTACCCTCCAGCAGGACCATGTGAT-3'

[0104] PCR反应体系：模板cDNA 1µl，正反向引物（浓度10µM）各2µl，dNTP 4µl，Ex-Taq1µl，10×PCR Buffer 5µl，ddH2O 35µl，PCR反应总体积为50 µl，以上反应所用的dNTP、Ex-Taq、10×PCR Buffer均为大连宝生物工程有限公司公司产品。

[0105] PCR反应条件：94℃ 3min，94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，32个循环，72℃延伸10min。分别得到3个预期大小的基因片段346 bp、536bp和462bp，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，其中M为DL2000（2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）（大连宝生物工程有限公司产品）；1号泳道为CsHR3基因干扰片段1目的条带；2号泳道为CsHR3 基因干扰片段2目的条带；3号泳道为阴性对照EGFP基因目的条带。

[0106] 分别将上述3个目的条带切胶回收，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京天根生物科技有限公司产品）纯化得到3个纯化产物CsHR3-I1、CsHR3-I2和EGFP-I0。将3个纯化产物分别连接到pMD19-T simple 载体（大连宝生物工程有限公司产品）上16℃反应12h，反应体系为：目的片段4.4µl，pMD19-T simple 载体 0.6µl，Solution I 5µl。然后转化大肠杆菌感受态细胞Top10，蓝白斑筛选，每个基因挑取3个阳性克隆送Invitrogen-上海英俊生物技术有限公司测序。

[0107] 2、原核表达dsRNA重组载体构建

[0108] 质粒L4440含有T7双向启动子，由于T7启动子是RNA polymerase的强启动子，因此每个T7启动子均可以沿5’-3’合成单链RNA（Single strand RNA, ssRNA），则两个反向的T7启动子就可以形成两个反向互补的ssRNA，这两条互补的ssRNA结合就可以形成双链RNA（double strand RNA，dsRNA）。

[0109] 将上述3个基因片段CsHR3-I1、CsHR3-I2和EGFP-I0及空载体L4440（大连宝生物工程有限公司产品）分别用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ酶切消化，然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化，酶切后的3个片段用T4 DNA连接酶（大连宝生物工程有限公司产品）分别连接到载体L4440上16℃反应12h，连接体系为：目的片段7µl，载体1µl，连接buffer（大连宝生物工程有限公司产品）1µl，T4 DNA连接酶1µl。将连接产物通过热激法转入大肠杆菌感受态细胞Top10，蓝白斑筛选，挑取阳性转化子在氨苄LB培养液中过夜培养，收集菌液，使用质粒提取试剂盒（Anxgen公司产品）纯化重组质粒pL4440-CsHR3-I1、pL44440-CsHR3-I2和pL4440-EGFP-I0。

[0110] 将三个重组质粒分别用Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ进行双酶切，验证其是否准确连接到空载体L4440上。酶切时间2～3h，酶切体系：质粒5µl，XhoI 1.5µl，KpnI 1.5µl，1×M Buffer1µl，ddH2O 1µl。重组质粒pL4440-CsHR3-I1、pL44440-CsHR3-I2和pL4440-EGFP-I0分别酶切为2790bp和346 bp，2790bp和536bp，2790bp和462bp。上述Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ限制性内切酶均购自大连宝生物工程有限公司产品。3个重组表达载体pL4440-CsHR3-I1、pL44440-CsHR3-I2和pL4440-EGFP-I0的结构示意图如附图2所示。

[0111] 3、靶标基因dsRNA诱导表达

[0112] 将构建好的重组质粒pL4440-CsHR3-I1，pL44440-CsHR3-I2和pL4440-EGFP-I0采用CaCl2热激法转入受体菌大肠杆菌HT115（DE3）感受态细胞中，该菌属于RNaseIII缺陷型菌株。由于HT115（DE3）具有Tetracycline抗性基因，而重组表达载体具有Ampicillin抗性基因，所以选用Tetracycline和Ampicillin双抗生素进行筛选，37℃培养16h。每个靶标基因挑取1个阳性克隆在LB培养基（Tetracycline＋Ampicillin）摇菌12h，37℃，200rpm。

[0113] 将活化后的3个菌株按1：100比例加入到1L LB培养基（含100µg/mL Ampicillin，12.5 µg/mL Tetracycline）中37℃ 200rpm 中培养至OD600=0.6（约2－3h）。加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.8mM进行诱导表达dsRNA。37℃
200rpm 诱导4－8h，分别取1mL菌液，采用细菌总RNA提取试剂盒（购自上海生工）提取细菌的总RNA（提取方法按试剂盒说明书进行），结果见附图3所示。实验结果表明，3个重组载体都成功诱导了靶标基因的dsRNA表达，而不加IPTG诱导时，3个重组载体都没有dsRNA表达，当DNaseI处理时，细菌总DNA都被消化掉。

[0114] 4、饲喂细菌表达dsRNA对甘蔗条螟生长发育的影响

[0115] 分别取1L诱导好的dsRNA菌液，在室温条件下，10000rpm 离心5min富集菌体，按照100：1比例（即10mL）添加ddH2O溶解富集的菌液，充分混匀。再采用超声波破碎仪破坏其细菌细胞壁，使其dsRNA充分释放出来。反应条件：振幅25%，启动6s，终止6s，总时间10 min，冰上操作。用此菌液作为甘蔗条螟幼虫饲喂dsRNA的生测材料。

[0116] 甘蔗条螟幼虫饲喂试验分为四个处理组，分别为L4440-CsHR3-I1试验组、L4440-CsHR3-I2试验组、 L4440-EGFP-I0阴性对照组和清水对照组。甘蔗条螟生测试虫选择三龄幼虫和五龄幼虫两个生长时期类型。每个处理选用7个幼虫。以上试验重复3次。

[0117] 挑选生长一致的3龄和5龄甘蔗条螟幼虫，分别用新鲜的甜玉米粒作为生测饲料（每个甜玉米粒中约添加10µl dsRNA菌液），每日定时更换含dsRNA的饲料。单头饲养，饲养条件为（25± 2℃，相对湿度70%，每日光：暗为16h：8h）。饲喂dsRNA后的1－7天，准确记录和观察条螟的生长、蜕皮、体重、化蛹、羽化及死亡表型变化。

[0118] 试验结果证明：饲喂表达dsRNA 大肠杆菌的L4440-CsHR3-I1和L4440-CsHR3-I2试验组甘蔗条螟3龄幼虫主要表现为：不能正常完成蜕皮，头部存在色素沉着，生长发育受到严重影响；而L4440-EGFP-I0阴性对照组和清水对照组的甘蔗条螟幼虫生长情况良好，个体增重明显，正常完成蜕皮及龄期过渡，如图4所示。同时表达CsHR3 dsRNA的L4440-CsHR3-I1和L4440-CsHR3-I2试验组甘蔗条螟幼虫个体，随时间发展体重明显降低，而阴性对照组和清水对照组的甘蔗条螟幼虫个体，随时间发展体重持续增加，如图6所示。

[0119] 饲喂表达dsRNA 大肠杆菌的L4440-CsHR3-I1和L4440-CsHR3-I2试验组甘蔗条螟5龄幼虫主要表现为：预蛹不能正常蜕皮从而形成畸形蛹，或重量和形状都较小的非正常蛹，有的甚至无法形成正常蛹而死亡。而L4440-EGFP-I0阴性对照组和清水对照组的甘蔗条螟幼虫化为蛹的情况良好，形成饱满、个大的正常蛹，如图5所示。

[0120] 5、饲喂dsRNA后甘蔗条螟CsHR3 基因mRNA变化情况

[0121] 选取生长一致的甘蔗条螟3龄幼虫，在饲喂dsRNA后第0天和第7天两个时间节点，分别取L4440-CsHR3-I1试验组、L4440-CsHR3-I2试验组、 L4440-EGFP-I0阴性对照组和清水对照组幼虫各2头（共计8头幼虫），重复实验3次。提取总RNA，通过实时定量qRT-PCR技术，用特异性引物（引物序列如下）

[0122] CsHR3-qRT-PCR-P1： 5'- AACCTCCGCCGCAGCAGCCTTAC -3'

[0123] CsHR3-qRT-PCR-P2： 5'- GATGTCGCCCTCCGCATGACTAA -3'，

[0124] 对四个处理组CsHR3基因mRNA的变化情况进行检测。提取的RNA样品以甘蔗条螟β-actin基因作为内参基因，引物序列如下。选择β-actin 基因目的是检验RNA提取的质量、均一性及相对定量精确性。

[0125] 扩增甘蔗条螟β-actin 基因的引物：

[0126] Cs-β-actin-P1：5'- ACC AAC TGG GAC GAT ATG GAG AA -3'

[0127] Cs-β-actin-P2：5'- CCT CAG TCA AGA GGA CTG GGT GC -3'。

[0128] 通过realtime RT-PCR技术检测CsHR3基因变化情况，如图7所示，甘蔗条螟3龄幼虫在取食表达dsRNA的大肠杆菌后，自身CsHR3 基因表达受到极大的抑制，第7天与第0天比较，CsHR3 基因mRNA相对表达量产生了极大显著差异，而阴性对照组和清水对照组中CsHR3基因的mRNA表达水平基本不变，从而验证了外源基因EGFP基因dsRNA不会对甘蔗条螟生长发育造成影响。本试验结果表明，通过饲喂昆虫生长发育关键基因CsHR3 dsRNA，可以有效抑制昆虫自身靶基因mRNA的转录表达。

[0129] 综上，可以得出饲喂表达CsHR3 dsRNA的大肠杆菌，不仅对甘蔗条螟正常生长发育造成了一定影响，而且在靶标基因mRNA水平上呈现了显著性降低。根据以上实验结果，通过细菌介导的RNAi方法表达dsRNA，可以进入昆虫体内有效抑制靶标基因CsHR3 的转录表达，进一步使甘蔗条螟正常蜕皮过程受到严重影响，幼虫不能脱掉久表皮，发生皮层溶离，打破蜕皮基因的平衡，干扰昆虫蜕皮，引发蜕皮障碍等死亡表型，破坏其正常生长发育过程，由此揭示细菌介导的RNAi技术表达dsRNA很可能作为害虫生物防治的一种新方法、新策略。

[0130] 此外，本发明方法所包含的害虫不仅包括甘蔗条螟（Chilo sacchariphagus），也可以为甘蔗二点螟（Chilo infuscatellus）、甘蔗木蠹蛾（Phragmataecia sp.）、玉米螟（Ostrinia furnacalis）等农业生产中的重要害虫，应用本研究的基因不仅包括甘蔗二点螟生长发育关键基因——蜕皮调节转录因子HR3，还可以是EcR、chitinase、actin 基因等。