源于里氏木霉的转录因子及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了源于里氏木霉的转录因子及其编码基因和应用。本发明从里氏木霉(Trichoderma reesei)中分离得到了转录因子cDNA，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明还提供了含有该转录因子cDNA的表达载体及重组宿主细胞，本发明进一步提供了该转录因子cDNA在调控里氏木霉生长发育及抗逆性中的用途。

权利要求

1.一种从里氏木霉(Trichoderma reesei)中所分离的转录因子cDNA，其多核苷酸为(a)、(b)或(c)所示：(a)、SEQ ID No.1所示的多核苷酸；

(b)、编码SEQ ID No.2所示氨基酸的多核苷酸；

(c)、与SEQ ID NO：1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质的氨基酸为SEQ ID NO：2所示。

2.一种从里氏木霉(Trichoderma reesei)中所分离的转录因子基因，其多核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。

3.权利要求1所述转录因子cDNA所编码的蛋白。

4.含有权利要求1所述转录因子cDNA的表达载体。

5.含有权利要求2所述转录因子基因的表达载体。

6.含有权利要求4或5所述表达载体的重组宿主细胞。

7.权利要求1所述转录因子cDNA或权利要求2所述转录因子基因在调控里氏木霉生长发育中的用途。

8.权利要求1所述转录因子cDNA或权利要求2所述转录因子基因在调控或提高里氏木霉抗逆性中的用途。

说明书

源于里氏木霉的转录因子及其编码基因和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种与真菌的生长发育相关的转录因子cDNA及其编码蛋白，尤其涉及从真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)中所分离、克隆的转录因子TrTF1 cDNA序列及其编码的蛋白，本发明还涉及含有该cDNA序列的表达载体以及它们在调控里氏木霉生长发育及其抗逆性中的用途，本发明属于源于里氏木霉的转录因子的分离及其应用领域。

背景技术

[0002] 里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种广泛存在自然界的嗜温腐生真菌，第二次世界大战期间首先从棉帆布中分离出来(Mandels etal.，1957)。里氏木霉可以分泌产生很多酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶以及蛋白酶和淀粉酶，尤其是纤维素酶含量很高，分泌的纤维素酶多年来已广泛应用于造纸，酿酒和食品等行业中(Miettinen-Oinonen etal.，2002；Boer etal.，2002；Cherry etal.，2003)。近年来，随着能源危机的加剧，可持续再生能源的研究成为当今研究热点。利用可再生的纤维素资源生产生物乙醇(bioethanol)已成为克服能源危机的有效途径之一。在生产生物乙醇的流程中，纤维素酶水解纤维素产生葡萄糖是整个过程的至关重要的一步。因此，里氏木霉作为一种广泛应用于生产纤维素酶的工业用菌，国内外科研人员在如何提高纤维素酶活性方面做了大量的研究工作。研究中发现，仅仅通过对菌株的改造和发酵过程的优化不能完全解决纤维素酶活性的问题。要想彻底解决这个问题，必须从根本上了解里氏木霉的整个生长发育以及纤维素酶的诱导、表达和分泌的整个调控的过程。

[0003] 近年来，里氏木霉分子生物学方面的研究进展十分迅速，尤其是在2008年里氏木霉基因组序列的公布，通过对基因组分析、预测，为更深入的了解里氏木霉整个生长发育过程奠定了更好的基础。

[0004] 作为一种广泛应用的工业菌株，里氏木霉分子水平上的相关研究大多集中在纤维素酶的诱导表达等方面，单独从生长发育角度研究里氏木霉的相关报道很少。目前已经克隆和分析的参与到纤维素酶代谢途径的基因有如下：ACE1，ACE2，XYR1，CRE1，HAP2/3/5复 合 体，XYL1，GAL1，GNA1，GNA3，PGL1 等 (Ilmén etal.，1996；Aro etal.，2001；Aro etal.，2002；Mach-Aigner etal.，2008；Stricker etal.，2006；Stricker etal.，2008；Seibeletal.，2009；Schmoll etal.，2009；Limón etal.，2011等)。由此可见，研究的重点都偏向于直接或者间接的参与纤维素酶代谢途径的基因，但是纤维素酶的代谢调控远不止受到这些基因的调节，它受到里氏木霉整个生长发育过程中其他许多未知的途径来辅助完成。

[0005] 已知里氏木霉纤维素酶的表达主要是在转录水平上调控的。已发现有5个转录调控因子参与到这个过程中，其中XYR1，ACE2，HAP2/3/5复合体起到正调控作用，而ACE1和CRE1起到负调控作用。与此同时，这些基因都还影响着里氏木霉发育过程的其它方面。因此，发现和找到新的转录因子有着重要的意义。

[0006] 鉴定和克隆新的转录因子，尤其是那些直接或间接与纤维素酶调控的基因，可以为利用分子手段改造里氏木霉提高纤维素酶产率提供一定的参考。目前，并没有通过分子生物学手段改造的里氏木霉菌株直接用于大规模工业生产，因此，利用分子生物学技术克隆和鉴定新的转录因子对全面了解里氏木霉的代谢网络有着非常重要的意义，也为最终分子生物学技术应用于工业生产奠定基础。

发明内容

[0007] 本发明目的之一是提供一种从里氏木霉(Trichoderma reesei)中所分离、克隆的与其生长发育相关的转录因子cDNA及其编码蛋白。

[0008] 本发明目的之二是提供含有上述转录因子cDNA的表达载体以及含有该表达载体的重组宿主细胞。

[0009] 本发明目的之三是将所述转录因子cDNA及其编码蛋白应用于调控里氏木霉(Trichoderma reesei)的生长发育或其抗逆性。

[0010] 为实现上述目的，本发明提供了一种从里氏木霉(Trichodermareesei)中所分离的TrTF1转录因子cDNA，其多核苷酸为(a)、(b)或(c)所示：

[0011] (a)、SEQ ID No.1所示的多核苷酸；

[0012] (b)、编码SEQ IDNo.2所示氨基酸的多核苷酸；

[0013] (c)、与SEQ ID NO：1的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该核苷酸所编码蛋白质的氨基酸为SEQ ID NO：2所示。

[0014] 优选的，本发明所述的从里氏木霉所分离的转录因子cDNA为SEQ IDNo.1所示的多核苷酸序列。

[0015] 此外，本发明还提供了里氏木霉(Trichoderma reesei)中所分离的TrTF1转录因子的全基因，其多核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。

[0016] 本发明所述的转录因子及其编码基因包括天然存在的序列和变体两种形式。“变体”意指基本相似的序列，对于多核苷酸，变体包含天然多核苷酸中一个或多个位点处一个或多个核苷酸的缺失、插入或/和替换。对于多核苷酸，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而不改变编码的氨基酸序列的那些变体。诸如此类天然存在的变体可通过现有的分子生物学技术来鉴定。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，例如采用定点诱变或者是通过重组的方法得到的仍编码SEQ ID No.2所示的氨基酸的多核苷酸变体。

[0017] 本发明中所分离的TrTF1转录因子基因插入失活后导致里氏木霉产孢量下降、分生孢子梗形态变化、抵抗外界环境压力的能力下降。可见，本发明所分离的TrTF1转录因子基因与里氏木霉的生长发育及抗逆敏感性相关，由此，本发明的再一方面是提供了一种调控里氏木霉生长发育或提高里氏木霉抗逆性的方法，包括：将本发明所分离的转录因子cDNA引入到里氏木霉中，诱导转录因子cDNA表达。

[0018] 本发明进一步提供了含有所述转录因子基因的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞。

[0019] 将本发明所述转录因子cDNA可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在里氏木霉中表达该基因的表达载体。“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。该表达载体可以由5′端非编码区，SEQ ID No.1所示的核苷酸和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。另外，本领域技术人员可以将SEQ ID No.1所示的核苷酸进行优化以增强在里氏木霉中的表达。例如。可采用里氏木霉的偏爱密码子进行优化来合成多核苷酸以增强在里氏木霉中的表达。

[0020] 更进一步的，可以将本发明所分离的TrTF1转录因子cDNA多核苷酸序列作为探针应用于寻找里氏木霉中其它受TrTF1的调控基因；

[0021] 此外，还可以本发明TrTF1转录因子cDNA所编码的蛋白为目的蛋白在NCBI数据库中搜索其它真菌中具有相似功能的蛋白，如：镰刀菌(Fusarium oxysporum)，小麦赤霉菌(Gibberella zeae)，米曲霉(Aspergillusoryzae)，黑曲霉(Aspergillus niger)等。

[0022] 本发明所涉及到的术语定义

[0023] 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

[0024] 术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen，Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes.″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

[0025] 术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

[0026] 术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Cassol等人，(1992)；Rossolini等人，Mol Cell.Probes8：91-98(1994))。

[0027] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

附图说明

[0028] 图1用于T-DNA插入载体构建示意图。

[0029] 图2T-DNA插入位置示意图。

[0030] 图3里氏木霉野生型QM9414(A和C)和插入突变体ATMT-39(B和D)菌落形态图；其中，A和B为PDA培养基上图片，C和D为MM培养基上图片。

[0031] 图4普通光学显微镜下的里氏木霉野生型QM9414(A)和插入突变体ATMT-39(B)菌丝形态图；

[0032] 图5里氏木霉野生型QM9414(A)和插入突变体ATMT-39(B)菌丝形态扫描电镜图。

[0033] 图6里氏木霉野生型QM9414和插入突变体ATMT-39在不同温度下生长速率比较图。

[0034] 图7里氏木霉野生型QM9414和插入突变体ATMT-39在不同浓度NaCl条件下生长速率比较图。

具体实施方式

[0035] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0036] 实施例1适用于真菌ATMT转化的载体pCAMBIA1300-1的构建

[0037] 根据pCB1003载体(Carroll et al.Fungal Genet.Newslett.(1994)41：22.)中潮霉素的序列，设计引物，PCR扩增潮霉素片段，然后将该片段插入到pCAMBIA1300载 体 (Chen et al.Appl.Environ.Microbiol.(2000)66(10)：4510-4513)上 构 建 成pCAMBIA1300-1。具体方法如下：首先，采用高保真PCR法，利用pCB1003质粒作为模板，扩增潮霉素片段，引物设计中上下游同时引入XhoI位点(斜体表示酶切位点)，以便下一步实验操作。

[0038] hphp1：5’-CTCGAGTATTGAAGGAGGATTTTTGGGC-3’

[0039] hphp2：5’-CTCGAGGCTCTTGTTCGGTCGGCAFCTA-3’

[0040] PCR体系为：模板pCB1003质粒1μl，Taq p lus聚合酶1μl，引物(100mM)各0.4μl，Taq pl us缓冲液5μl，dNTP(25mM)1μl，其余用水补足至50μl。

[0041] PCR反应条件为：94℃5分钟，(94℃30秒，55℃30秒，68℃1分30秒)共计35个循环，72℃10分钟。

[0042] PCR产物纯化后连接到pUCM-T载体上，然后用XhoI酶切，切后连接到以同样XhoI酶切的pCAMBIA1300载体上，即构建好pCAMBIA1300-1载体。构建过程见图1；图1中的简写酶切位点分别为：Xh：XhoI，E：EcoRI，Sa：SacI，K：KpnI，S：SmaI，B：BamHI，X：XbaI，P：PstI，H：HindIII。LB(leftborder)为左臂，RB(right border)为右臂。

[0043] 实施例2ATMT转化pCAMBIA1300-1载体到里氏木霉

[0044] 主要采用冻融法转化，将pCAMBIA1300-1载体转入到农杆菌AGL1中。从新鲜培养的LB平板(含50μg/ml卡那霉素)上挑选一农杆菌单菌落接种于5ml含卡那霉素的LB中，28℃200rpm过夜培养；第二天将200-400μl培养液转移到5ml含200μmol/L AS和50μg/ml Kna的诱导液体培养基AIM中，OD值约0.15，28℃培养5-6h使OD600达到0.5-0.6。

[0045] 里氏木霉孢子的收集：用5ml灭菌蒸馏水从培养10d的PDA平板上洗下孢子，在装有无菌玻璃珠的试管中，涡旋振荡后，三层擦镜纸过滤后，5000rpm离心，用无菌水清洗两次后，用血球计数板计数；将100μl培养好的农杆菌AGL-1菌液和100μl稀释好的里氏木霉孢子悬浮液混合，然后均匀涂布混合液于铺有硝酸纤维素膜(NC)的AIM平板上，20℃共培养48h；将膜剪成小片，在选择性培养基PDA上25℃培养，直到转化子出现。选择性培养基中含200μg/ml潮霉素、400μg/ml头孢霉素(cefotaxime)、60μg/ml链霉素。转化子长出后，再在含有200μg/ml潮霉素的PDA平板上再次筛选。将长出的转化子均挑至PDA平板上，观察菌落形态。

[0046] 实施例3引起ATMT-39表型差异的基因的克隆及预测

[0047] 1.ATMT-39突变体插入位点的确定：从突变体ATMT-39中提取基因组DNA，作为模板，进行NEST PCR扩增，获得插入片段测序后确定插入位置。NEST PCR所使用引物序列根据pCAMBIA1300载体上T-DNA序列设计，序列如下：

[0048] LB4：5’-GCGTTACCCAACTTAATCGC-3’

[0049] RB4：5’-AGCGCAACGCAATTAATGTG-3’

[0050] LB5：5’-GCCAGGGTTTTCCCAGTCAC-3’

[0051] RB5：5’-AGTTAGCTCACTCATTAGGC-3’

[0052] LB6：5’-CGTTGTAAAACGACGGCCAG-3’

[0053] RB6：5’-ACCCCAGGCTTTACACTTTA-3’

[0054] 将提取后的QM9414基因组用EcoRI酶切后，用T4连接酶连接，4℃连接，然后以连接产物作为模板进行后续PCR反应。连接体系为：基因组酶切产物4μl，T4连接酶1μl，T4连接酶缓冲液1μl，其余用ddH2O补足10μl。

[0055] NEST PCR扩增步骤及PCR反应条件、体系：第一次PCR以纯化的自连DNA为模板进行PCR扩增，引物采用LB4/RB4；第二次PCR使用第一次PCR产物稀释1000倍为模板，引物采用LB5/RB5，第三次PCR使用第二次PCR产物稀释1000倍为模板，引物采用LB6/RB6，经过上述一系列PCR扩增获得T-DNA侧翼序列。PCR反应条件为：94℃预变性45s，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸4min，35个循环；最后一个循环结束后，于72℃下延伸10min。PCR反应体系为：0.5μlLA Taq(5U/μl)，10×PCR反应缓冲液5μl，引物(100mM)各0.4μl，dNTP(25mM)1μl，模板10-100ng，其余用水补足至50μl。

[0056] 将第三次PCR扩增所得到的PCR产物，胶回收后测序，所得到的测序结果在里氏木霉基因组数据(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)和NCBI数据库中比对，确定T-DNA的插入位置(图2)。

[0057] 2.TrTF1基因组DNA的克隆：根据所测得序列，在里氏木霉基因组数据库寻找对应基因，根据基因组数据库中信息，设计引物，扩增TrTF1基因组DNA。引物序列如下：

[0058] 39p1：5’-AAGGATCCACCCCCGTACTCCCTATCTCCTGT-3’

[0059] 39p2：5’-AAGGATCCGTGCGGCCCTGTACCATTTTC-3’

[0060] PCR体系为：模板QM9414基因组DNA1μl，Taq plus聚合酶1μl，引物(100mM)各0.4μl，Taq plus缓冲液5μl，dNTP(25mM)1μl，其余用水补足至50μl。

[0061] PCR反应条件为：94℃5分钟，(94℃30秒，55℃30秒，68℃1分30秒)共计35个循环，72℃10分钟。

[0062] 所得PCR产物胶回收后连接到pUCM-T载体上并测序，序列为SEQ ID NO：3。

[0063] 连接反应条件：PCR胶回收产物3μl，T4连接酶1μl，T4连接酶缓冲液1μl，pUCM-T载体1μl，其余用ddH2O补足10μl。

[0064] 3.TrTF1cDNA的克隆：采用TRIZOL法提取QM9414中RNA，反转录获得cDNA，PCR扩增获得cDNA序列。

[0065] TRIZOL法提取总RNA：

[0066] 收集约1g左右里氏木霉菌丝用液氮研磨至粉末状，加入2ml Tri zol，室温放置5min，使其充分裂解。8500rpm离心5min，弃沉淀；按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀15秒，室温放置3min。4℃8500rpm离心15min。吸取上层水相至另一离心管中；按
0.5ml异丙醇/ml Trizol加入异丙醇混匀，室温放置10min，4℃8500rpm离心10min，弃上清，RNA沉于管底。按1ml75％乙醇/ml Trizol加入75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
4℃6500rpm离心5min，尽量弃上清。冰上晾干10min。用适量H2O(约100ul)溶解RNA样品，测O.D值定量RNA浓度。

[0067] cDNA合成：

[0068] 采用First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA。将1μg总RNA，1μl oligo(dT)18引物加入一支无菌无核酸污染的管中，加入无核酸ddH2O定容至100μl，混匀后冰上冷却，如果RNA模板GC含量高或者包含二级结构，需要65℃温浴5min后再置于冰上。然后加入5×反应缓冲液4μl，dNTP Mix(10mM)2μl，M-MuLV Reverse TM
Transcriptase(20u/μl)2μl，RiboLock RNase Inhibitor(20u/μl)1μl，使得总反应体系为20μl；轻柔混合后37℃温浴60min，如果RNA模板GC含量高，可以将反应温度提高到45℃；最后在70℃温浴5min终止反应。

[0069] TrTF1的cDNA序列扩增：

[0070] 引物序列如下：

[0071] 39cDNAp1：5’-ATGCCTACGAAAAGGTGAAGGA-3’

[0072] 39cDNAp2：5’-CGGCTCTGCATCAACCCGACC-3’

[0073] PCR体系为：模板cDNA1μl，Taq plus聚合酶1μl，引物(100mM)各0.4μl，Taq plus缓冲液5μl，dNTP(25mM)1μl，其余用水补足至50μl。

[0074] PCR反应条件为：94℃5分钟，(94℃30秒，55℃30秒，68℃1分30秒)共计35个循环，72℃10分钟。

[0075] 所得PCR产物胶回收后连接到pUCM-T载体上并测序。序列为SEQ ID NO：1。

[0076] 连接反应条件：PCR胶回收产物3μl，T4连接酶1μl，T4连接酶缓冲液1μl，pUCM-T载体1μl，其余用ddH2O补足10μl。

[0077] 4.TrTF1蛋白功能预测

[0078] 将TrTF1蛋白序列在http://www.ebi.ac.uk/上预测。

[0079] 实施例4ATMT-39菌落形态、孢子形态、产孢量及生长速率的测定

[0080] 1.菌落形态：

[0081] 将ATMT-39突变体和QM9414分别接于PDA和MM平板上，30℃培养3天后拍摄菌落形态(图3)。其中，PDA培养基配方为：每升培养基中土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g；MM培养基配方为：每升培养基中葡萄糖20g，(NH4)2SO45g，KH2PO415g，MgSO40.6g，CaCl20.6g，FeSO40.005g，MnSO40.016g，ZnSO40.0014g，CoCl20.002g，pH5.5。

[0082] 2.分生孢子梗和分生孢子形态：

[0083] 光学显微镜下的观察是将培养3天的平板用无菌水清洗，用涂布棒将平板表面的菌丝和孢子洗掉，然后将带有基生菌丝的琼脂切成大小约为1×0.5cm的小块，放置于载玻片上；后将载玻片放置于9cm平板中(保持平板内一定湿度)，16h后取出，至于光学显微镜下观察菌丝，分生孢子梗及分生孢子形态(图4)。

[0084] 将培养48h的平板边缘用刀片切成大小约为1×0.5cm的小块，至于扫描电镜载物台上，后用液氮冻干30min以上后喷金，扫描电镜观察(图5)。

[0085] 3.产孢量和生长速率的测定：

[0086] 将ATMT-39突变体和QM9414接于PDA平板上，30℃培养3天后测量菌落直径，计算生长速率。将培养3天的PDA平板用打孔器打3个孔，位置分别在靠近菌落中心，菌落中间位置和菌落边缘；将打好的菌块置于10ml离心管中，同时离心管里加入5个玻璃珠；漩涡振荡器上震荡5分钟后，用血球计数板计数，测定结果见表1。

[0087] 表1

[0088]

[0089] 实施例5ATMT-39抗逆敏感性测定

[0090] 主要针对不同浓度NaCl，不同浓度H2O2以及不同温度下生长速率测定抗逆敏感性的变化。

[0091] 不同温度对抗逆敏感性的影响：将ATMT-39和QM9414分别于30℃和37℃培养条件下培养，每天测量菌落直径，直到第3天(图6)。

[0092] 不同浓度NaCl对抗逆敏感性的影响：将ATMT-39和QM9414分别接于含有0.2M，0.4M，0.8M，1.0M不同浓度NaCl的PDA平板上，30℃培养，每天测量菌落直径，直到第五天(图7)。

[0093] 不同浓度H2O2对抗逆敏感性的影响：将ATMT-39和QM9414分别接于含有1mM，3mM，5mM的不同浓度H2O2的PDA平板上，30℃培养，每天测量菌落直径，直到第五天，测定结果见表2。

[0094] 表2

[0095]