本发明涉及一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，其步骤是采用离心法选出健壮的产埃博霉素B菌种接种于灭菌的种子培养基中，在30℃的摇床振荡培养后再发酵；并向发酵培养基中添加前体诱导物苯丙氨酸；在30℃培养10～11天后收获培养液；再经大孔树脂收集吸附饱和，乙酸乙酯洗脱，分离纯化、真空浓缩、萃取、低温结晶、真空干燥。本发明将动态洗脱法用于埃博霉素B的工业化生产，使规模化生产成为可能。通过液相制备柱可有效地提纯埃博霉素B的纯度，其纯度可达99.5％以上，同时采用甲醇进行萃取分离，使埃博霉素B在甲醇中结晶，成品能达到医药级水平。本方法大幅度提高埃博霉素B产率达到30～45％，具有良好的工业化生产前景。
1.一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，其特征在于：包括如下步骤：⑴、生产出发菌种，Soce90—G15：通过3000rpm离心摇甁菌液选取生长健壮的粘细菌作为生产出发菌种；
⑵、固体斜面扩培：培养基的组分按质量％计为，葡萄糖0.5～1％、蛋白胨0.3～
0.5％、淀粉0.5～1％、氯化钠0.1～0.5％、赤霉素0.002％和琼脂粉2％，余量为水；培养基在120℃、30分钟灭菌冷却后布置成斜面，24小时后把生产出发菌种涂布于斜面上,在
30±2℃、相对湿度55％，7～9天可见生长丰满、金黄色的菌苔，冷藏待用；
⑶、摇甁扩培：摇甁培养基为淀粉5～8g/L、酵母提取物2～4g/L、葡萄糖0.5～1.5g/L、MgSO4 1g/L、CaCl2 1g/L、甘油0.5～1g/L、磷酸二氢钠0.05g/L、豆饼粉2～4g/L，饮用水
1升，调PH为7.20、在120℃、30分钟灭菌；把固体斜面的菌苔轻轻刮下接入摇甁培养基，在
29℃±1℃、转速150rpm下，生长5～6天；选取菌体生长健壮的摇甁菌种液转接入一级种子罐；
⑷、一级种子培养：一级种子培养基的组成与摇甁培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；把生长好的摇甁菌种液通过压差法接入一级种子罐中扩培，培养温度29±2℃、转速2
120rpm、空气流量比1比0.4、罐压0.04㎏/㎝ ，培养5～6天，将生长旺盛的菌种液转接入二级种子罐；
⑸、二级种子罐培养：二级种子培养基的组成与摇甁培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；把生长好的一级菌种液通过压差法接入二级种子罐中扩培，培养温度29±2℃、转速2
120rpm、空气流量比1比0.5、罐压0.04㎏/㎝ ，培养2～3天，将生长旺盛的菌种液转接入发酵罐；
⑹、发酵罐培养：发酵培养基的组成与摇甁培养基相同，但外加前体诱导物0.2～
0.5g/L、大孔吸附树脂20g/L，所述在发酵培养基中外加的前体诱导物为苯丙氨酸，或是它的有机盐；PH调整至7.30，120℃、30分钟灭菌；把生长好的二级菌种液通过压差法接入发酵罐中扩培，培养产品的温度29±2℃、转速150rpm、空气流量比1比0.8、罐压0.04㎏/㎝2
⑺、洗涤、洗脱：发酵至残糖低于0.2％，在代谢活性物质产出高点时终止发酵，将发酵液中的的树脂分离出来淘洗干净装入树脂床内；用50％甲醇洗涤1倍柱床量、流速25ml/min，脱色、除杂；再用6倍柱床量乙酸乙酯，流速15ml/min洗脱埃博霉素A、埃博霉素B活性物质，收集洗脱液；
⑻、真空浓缩：把收集的含活性物质的洗脱液真空浓缩，温度40～45℃、真空度﹣
0.085～﹣0.095 MPa，浓缩至原始体积量的1/15以下；
⑼、液相制备柱分离：把浓缩液通过液相制备柱分离收集埃博霉素B部份分离液；
⑽、萃取：把收集的含埃博霉素B分离液真空浓缩至剩余水相，加入有机溶剂进行萃取分离收集有机相；
⑾、结晶：把收集的有机相真空浓缩，温度40～45℃、真空度﹣0.085～﹣0.09MPa、浓缩至原始体积量的1/10以下；把浓缩液放入洁净的结晶器中﹣20℃低温结晶；
⑿、真空干燥；收集结晶体放入洁净的真空干燥箱,温度45～50℃、真空度 ﹣
0.085～﹣0.09MPa；干燥得到含量99.5％以上的活性产物埃博霉素B成品。
2.根据权利要求1所述的一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，其特征在于：所述的步骤⑶、⑷、⑸和⑹中的摇甁扩培采用摇甁振荡培养或搅拌沉没培养方式。
3.根据权利要求1所述的一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，其特征在于：所述在发酵培养基中外加前体诱导物加入培养基的方法为一次投入或是间歇流加。
一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种埃博霉素的生物合成方法，具体地说是一种工业化生产提高埃博霉素B产率的生物合成方法，属于抗生素微生物发酵培养领域。
背景技术
[0002] 埃博霉素B属于大环内脂类抗生素新成员，埃博霉素是一类具有独特结构和独特生物活性的抗生素。其分子结构如下：
[0003]
[0004] 埃博霉素A
[0005] 埃博霉素B
[0006] 其中埃博霉素B是由粘细菌(纤维对囊菌)产生的大环内酯类化合物，埃博霉素B不但具有抗肿瘤作用，对于真菌感染的皮肤病也有良好的拮抗、治疗作用，埃博霉素B毒性低、副作用小，具有良好的应用前景，但目前通过发酵制备埃博霉素B的方法生产成本高，培养所产生的活性物质中埃博霉素B产率低，生产波动性大，最高只占22％以下，有的甚至只有痕迹量。
发明内容
[0007] 本发明的目的是为了解决现有技术中埃博霉素B生产成本高及低产率的问题，而提供一种高产率的、能适应工业化生产并能有效地降低生产成本的埃博霉素的生物合成方法，采用本方法扩培、发酵产生的活性产物中埃博霉素B的产率高达到30～45％，具有良好的工业化生产前景。
[0008] 为了实现上述的目的，本发明所采取的技术方案是：提供一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，包括如下步骤：
[0009] (1)、生产出发菌种，Soce90-G15：通过3000rpm离心摇瓶菌液选取生长健壮的粘细菌作为生产出发菌种；
[0010] (2)、固体斜面扩培：培养基的组分按质量％计为，葡萄糖0.5～1％、蛋白胨0.3～0.5％、淀粉0.5～1％、氯化钠0.1～0.5％、赤霉素0.002％和琼脂粉2％，余量为水；培养基在120℃、30分钟灭菌冷却后布置成斜面，24小时后把生产出发菌种涂布于斜面上，在30±2℃、相对湿度55％，7～9天可见生长丰满、金黄色的菌苔，冷藏待用；
[0011] (3)、摇瓶扩培：摇瓶培养基为淀粉5～8g/L、酵母提取物2～4g/L、葡萄糖0.5～1.5g/L、MgSO4 1g/L、CaCl2 1g/L、甘油0.5～1g/L、磷酸二氢钠0.05g/L、豆饼粉2～4g/L，饮用水1升，调PH为7.20、在120℃、30分钟灭菌；把固体斜面的菌苔轻轻刮下接入摇瓶培养基，在29℃±1℃、转速150rpm下，生长5～6天；选取菌体生长健壮的摇瓶菌种液转接入一级种子罐；
[0012] (4)、一级种子培养：一级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；把生长好的摇瓶菌种液通过压差法接入一级种子罐中扩培，培养温度29±2℃、转2
速120rpm、空气流量比1比0.4、罐压0.04kg/cm，培养5～6天，将生长旺盛的菌种液转接入二级种子罐；
[0013] (5)、二级种子罐培养：二级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；把生长好的一级菌种液通过压差法接入二级种子罐中扩培，培养温度29±2℃、2
转速120rpm、空气流量比1比0.5、罐压0.04kg/cm，培养2～3天，将生长旺盛的菌种液转接入发酵罐；
[0014] (6)、发酵罐培养：发酵培养基的组成与摇瓶培养基相同，但外加前体诱导物0.2～0.5g/L、大孔吸附树脂20g/L；PH调整至7.30，120℃、30分钟灭菌；把生长好的二级菌种液通过压差法接入发酵罐中扩培，培养产品的温度29±2℃、转速150rpm、空气流量比
2
1比0.8、罐压0.04kg/cm、培养10～11天；
[0015] (7)、洗涤、洗脱：发酵至残糖低于0.2％，在代谢活性物质产出高点时终止发酵，将发酵液中的的树脂分离出来淘洗干净装入树脂床内；用50％甲醇洗涤1倍柱床量、流速25ml/min，脱色、除杂；再用6倍柱床量乙酸乙酯，流速15ml/min洗脱埃博霉素A、埃博霉素B活性物质，收集洗脱液；
[0016] (8)、真空浓缩：把收集的含活性物质的洗脱液真空浓缩，温度40～45℃、真空度-0.085～-0.095MPa，浓缩至原始体积量的1/15以下；
[0017] (9)、液相制备柱分离：把浓缩液通过液相制备柱分离收集埃博霉素B部份分离液；
[0018] (10)、萃取：把收集的含埃博霉素B分离液真空浓缩至剩余水相，加入有机溶剂进行萃取分离收集有机相；
[0019] (11)、结 晶：把 收 集 的 有 机 相 真 空 浓 缩，温 度 40～ 45 ℃、真 空度-0.085～-0.09MPa、浓缩至原始体积量的1/10以下；把浓缩液放入洁净的结晶器中-20℃低温结晶；
[0020] (12)、真空干燥；收集结晶体放入洁净的真空干燥箱，温度45～50℃、真空度-0.085～-0.09MPa；干燥得到含量99.5％以上的活性产物埃博霉素B成品。
[0021] 本发明所述的扩培采用摇瓶振荡培养或搅拌沉没培养方式，工业化生产首选搅拌沉没方式。
[0022] 本发明所述在发酵培养基中外加的前体诱导物为苯丙氨酸，或是它的有机盐，其加入培养基的方法为一次投入或是间歇流加。
[0023] 本发明用于培养微生物的培养基中应加入可被利用的碳源如淀粉、葡萄糖、甘油等，氮源如豆饼粉、鱼骨粉、酵母粉等，无机盐和能被利用的各种微量元素及前体物质。这些成分可一次性的加入培养基中或连续性的补入以实现埃博霉素B的高产率。本发明所用的发酵培养基成分与种子培养基的组成基本相同，只是要添加前体物质。在发酵培养基中加入埃博霉素B的前体物质为苯丙氨酸，其加入量为0.2～0.5g/L；具体地说，发酵培养基的组分为淀粉5～8g/L、酵母提取物2～4g/L、葡萄糖0.5～1.5g/L、MgSO41g/L、CaCl21g/L、甘油0.5～1g/L、磷酸二氢钠0.05g/L、豆饼粉2～4g/L、苯丙氨酸0.2～0.5g/L大孔吸附树脂20g/L；PH调整至7.30、120℃、30分钟灭菌。
[0024] 本发明所用培养基都需灭菌处理，一般于120℃灭菌30分钟即可。所述的扩培可采用摇瓶振荡培养或搅拌沉没培养方式，工业化生产首选搅拌沉没方式。培养条件随代谢情况做出相应变化，使培养基成分变化有所不同。当发酵液中的代谢生物活性达到最高、残糖0.2％以下时终止培养。经液相制备分离纯化所得活性产物埃博霉素B，所得埃博霉素B含量比能够达到30～50％。
[0025] 简言之，本发明的一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，是将产生埃博霉素B的粘细菌，接种于配置灭菌好的种子培养基中，在30℃的摇床振荡培养后再用于发酵；发酵培养时向粘细菌的发酵培养基中添加埃博霉素B的前体诱导物苯丙氨酸，使其生长代谢发酵培养；在30℃培养10～11天后收获培养液，并从培养基中回收埃博霉素B；再经收集吸附饱和的大孔树脂；用乙酸乙酯对溶液分离纯化、真空浓缩、萃取、低温结晶、真空干燥，得到含量达到30～50％埃博霉素B。
[0026] 本发明的方法与现有技术相比具有如下优点：
[0027] 1、本发明的方法中采用离心方式选取生长健壮的摇瓶菌液，可有效地分离出营养液，更有利于菌种的保存，防止菌种退化和保存中变异。
[0028] 2、本发明的方法中在细菌培养基中加入赤霉素这类生长激素，提高和均衡粘细菌的生长，有利于缩短生产周期，提高次级代谢的产出率。在培养基加入苯丙氨酸作为前体诱导物，提高了目的代谢产物埃博霉素的产出率。
[0029] 3、本发明的方法中把动态洗脱法用于埃博霉素B的工业化生产，使这一产品规模化生产成为可能。通过液相制备柱可以有效的提纯埃博霉素B的纯度，成品纯度可达99.5％，同时采用甲醇进行萃取分离，使埃博霉素B在甲醇中结晶，结晶体具有良好的晶形和色基，成品能达到医药级水平。
具体实施方式
[0030] 以下结合实施例对本发明方法作进一步详述。
[0031] 实施例1：本发明的一种提高埃博霉素B产率的生物合成方法，合成步骤包括：
[0032] (1)、生产出发菌种，通过3000rpm离心摇瓶菌液选取生长健壮的出发粘细菌菌种为生产菌种；
[0033] (2)、固体斜面扩培：其斜面培养基组分按质量％计为，葡萄糖0.5％、蛋白胨0.5％、淀粉1％、氯化钠0.5％、赤霉素0.002％和琼脂粉2％，余量为水；于120℃灭菌30分钟，24小时后将生长良好的生产出发菌种涂布于固体斜面培养基上，在30℃±2℃、相对湿度55％培养8天；
[0034] (3)、将生长良好的菌种接种于经过120℃灭菌30分钟的摇瓶扩培基中，摇瓶扩培基的组分为淀粉5g/L、酵母提取物2g/L、葡萄糖1g/L、MgSO4 1g/L、CaCl2 1g/L、甘油1g/L、磷酸二氢钠0.05g/L、豆饼粉2g/L，饮用水1升，PH调节为7.20，在29℃±1℃旋转培养120小时后；选取菌体生长健壮的摇瓶菌种液转接入一级种子罐；
[0035] (4)、一级种子培养：一级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；灭菌后接种、培养温度29±2℃、转速120rpm、空气流量比1比0.4、罐压0.04kg/2
cm、培养5天，在菌体生长旺盛时转接入二级种子罐；
[0036] (5)、二级种子罐培养：二级种子培养基的组成与摇瓶培养基相同，也在120℃、30分钟灭菌；把生长好的一级菌种液通过压差法接入二级种子罐中扩培培养温度29±2℃、2
转速120rpm、空气流量比1比0.4、罐压0.04kg/cm、培养3天，在菌体生长旺盛时转接入发酵罐；
[0037] (6)、发酵罐培养：发酵培养基的组成与摇瓶培养基相同，只是另加苯丙氨酸0.2g/L、大孔树脂20g/L，调PH7.30，同样于120℃灭菌，灭菌30分钟；将培养好的二级种子
2
培养液接入发酵培养基中29℃±2℃、转速120rpm、空气流量比1比0.8、罐压0.04kg/cm、培养10天后收获培养液；采用大孔树脂收集吸附复合活性产物；
[0038] (7)、洗涤、洗脱：发酵至残糖低于0.2％，代谢活性物质产出最高点终止发酵，将发酵液中的的树脂分离出来淘洗干净装入树脂床内；用50％甲醇洗涤1倍柱床量、流速25ml/min，脱色、除杂；再用6倍柱床量乙酸乙酯，流速15ml/min洗脱埃博霉素A、埃博霉素B活性物质，收集洗脱液；
[0039] (8)、真空浓缩：把收集的含活性物质的洗脱液真空浓缩，温度45℃、真空度-0.095MPa，浓缩至原始体积量的1/15以下；
[0040] (9)、液相制备柱分离：把浓缩液通过液相制备柱分离收集埃博霉素B部分分离液；
[0041] (10)、萃取：把收集的埃博霉素B分离液加入有机溶剂进行萃取分离收集有机相；
[0042] (11)、结晶：把收集的有机相真空浓缩温度45℃、真空度-0.09MPa、浓缩至原始体积量的1/10以下；把浓缩液放入洁净的结晶器中-20℃低温结晶；
[0043] (12)、真空干燥；收集结晶体放入洁净的真空干燥箱，温度50℃、真空度-0.085MPa；干燥得到高含量的活性产物埃博霉素B成品。
[0044] 采用本发明方法，所得主要组分为埃博霉素B，经液相检测埃博霉素B的产率在活性复合物中所占比率可达45％。
[0045] 经HPLC检验其产物保留时间与埃博霉素B标准品相同，紫外最大吸收度与埃博霉素B标准品相同。液相与埃博霉素B标准品保留时间一致。
[0046] 附检测方法：
[0047] 1.主要仪器与材料
[0048] 1.11色谱仪：Shimadzu 10A-Tvp HPLC。
[0049] 1.12色谱柱：Shim-pack MRC-ODS(250mm×4.6mm，4.60μm)分析柱或Kromasil C18(250mm×4.6mm)大连依利特科学仪器有限公司。
[0050] 1.13EpoB对照品：Sigma E2656，(-)-Epothilone B 10μg。
[0051] 1.2色谱条件
[0052] 以65％甲醇(HPLC级，Merck Co.，)和35％缓冲液(0.2％A.P.acetate acid/18MR Millipore Water)为流动相，流速为1.0ml/min，进样量为10μl。检测波长为249nm，柱温28℃。主要色谱峰的出峰顺序依次为埃博霉素A(相对保留时间为0.8)与埃博霉素B(相对保留时间为1.0)。
[0053] 1.3操作方法
