本发明公开了一种鉴别牛羊肉真假的LAMP检测方法，属于分子遗传学领域。它从GenBank中检索获得牛种属特异性的保守序列设计引物，并利用LAMP实时浊度仪对设计引物进行特异性筛选；然后配置LAMP反应液，构建成检测体系；再取1μL提取的基因组DNA和1μL的荧光检测试剂加入LAMP反应液中进行LAMP扩增；根据反应液颜色进行阴阳性判断，若反应液变成绿色，说明待测样品存在牛羊肉。该方法可方便、准确的检测出被检肉产品是否存在牛羊肉。本方法的模板、引物制备简单，特异性和敏感度高，检测结果可通过肉眼直接观测，可满足具备相应设备的各检测部门进行检测的需要，应用前景广阔。
1.一种鉴别牛羊肉真假的LAMP检测方法，其特征是，（1）从GenBank中检索获得牛452bp 12s RNA序列，并进行软件比对分析，确定序列的准确性；
（2）根据步骤（1）的序列设计多组引物，分别为引物1、引物2、引物3、引物4和引物5；
每组引物包括一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/ BIP；并利用LAMP实时浊度仪对设计引物进行特异性筛选，确定的高度特异性的引物为引物3；
F3：CCTAAAAAGGAAAAAAAGTAAGCGB3：GCTTCATGGCCTAATTCAACFIP：GAATGTAGCCCATTTCTTCCCATGATACATAAAAACGTTAGGTCAAGBIP：TCTACACCAAGAGAATCAAGCACGGCACTCTATTCTTAGTTTACTGC所述引物2为：
F3：GCTTAAAACTCAAAGGACTTGGB3：AGCCCATTTCTTCCCATTFIP：GCAAGAATTGGTGAGGTTTATCGGTATATCCTTCTAGAGGAGCCTBIP：CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACACCTTGACCTAACGT所述引物3为：
F3：AACAGCTTAAAACTCAAAGGAB3：AGCCCATTTCTTCCCATTFIP：TGAGGTTTATCGGGGTTTATCGAGGCGGTGCTTTATATCCTTBIP：CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACACCTTGACCTAACGT所述引物4为：
F3：GCTTAGCCCTAAACACAGATB3：AGGGTTTGCTGAAGATGGFIP：TAAAGCACCGCCAAGTCCTTTACATAAACAAAATTATTCGCCAGBIP：TATCCTTCTAGAGGAGCCTGTTCGGTATATAGACTGTATTAGCAAGAA所述引物5为：
F3：CCCAAACTGGGATTAGATACCB3：CTGTATTAGCAAGAATTGGTGAFIP：TGCTAGTAGTACTCTGGCGAATAATACTATGCTTAGCCCTAAACACBIP：ACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGGGTTTATCGGGGTTTATCGA；
（3）配置23μL LAMP反应液，构建成检测体系；所述23μL LAMP反应液含有12.5μL
2×等温反应缓冲液、1 μL 5μM Primer F3、1μL 5μM Primer B3、2μL 20μM Primer FIP、2μL 20μM Primer BIP、1μL Bst DNA聚合酶、3.5μL 水；其中：2×等温反应缓冲液含有40 mM的pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、20 mM的氯化钾、16mM的硫酸镁、20mM的硫酸铵、20%的Tween20、1.6M甜菜碱、2.8mM dNTP；其中Primer F3、Primer B3、Primer FIP和Primer BIP均来自于引物3；
（4）按常规方法提取基因组DNA，取1μL提取的基因组DNA和1μL的Loopamp荧光检测试剂加入LAMP反应液中，使终反应体积为25μL，10000 rpm瞬时离心30秒混匀反应液；
（6）根据反应液颜色进行阴阳性判断，若反应液变成绿色，说明待测样品存在牛羊肉；
2.如权利要求1所述的一种鉴别牛羊肉真假的LAMP检测方法，其特征是，引物设计通过登陆Eiken Chemical公司的在线软件PrimerExplore进行。
一种鉴别牛羊肉真假的LAMP检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及涉及利用LAMP技术鉴别牛羊肉的真假，属于分子遗传学领域。
背景技术
[0002] 目前，国内牛肉价格的飞速上涨和短缺导致国外的牛肉大量通过走私等途径进入中国，同时，国内也出现了很多不和谐的现象，2011年4月份安徽首次曝光了利用牛肉膏等添加剂使猪肉变牛肉的事件，此后，在全国多个省市均发现了类似的产品。一时间，人们对牛肉等食品安全的关注成为了全社会的焦点。其实，牛肉市场面临的猪肉变牛肉事件仅是冰山的一角。在社会上还大量存在着用鸡肉、鸭肉等低价肉甚至是一些病死肉加工冒充牛肉的现象。面对目前牛羊肉市场存在的乱象，人们只能从色泽、气味、弹性等多个方面进行初步鉴别，但大多数消费者都不可能掌握这种专业知识，很难对生牛肉进行鉴别，对加工后的牛肉则更是难以鉴别。目前社会上缺乏牛羊肉的准确鉴别技术。通过现代化的DNA鉴定技术，可以进行鉴别。早在2008年新华每日电讯就报道过杭州一个市民买10元牛肉花2800元进行DNA鉴定的事件，2010年中新网报道了宁波一个消费者花1800元通过DNA亲子鉴定技术鉴别牛肉真假的事件，表明这种方法虽然能够鉴别，但所需时间长，费用高。因此，迫切需要建立一种简单、廉价的牛羊肉鉴别方法，以维护牛羊肉市场的安全，保护广大消费者的身体健康。
[0003] 线粒体基因组具有种内高度保守的特性，在肉制品和饲料的鉴别中越来越被受到重视。近年来，基于线粒体基因的鉴定方法不断出现，包括PCR-RFLP、多重PCR、荧光定量PCR等，这些方法都需要涉及到PCR、荧光定量PCR等昂贵仪器。
发明内容
[0004] 本发明的目的是针对国内外已有方法在检测技术上存在的缺点，在检测技术上加以改进。环介导等温扩增技术(LAMP)是由日本学者Notomi T等(2000)设计创立的，这种新型核酸扩增技术具有灵敏度高、反应迅速，特异性强等优点。本发明利用LAMP技术和动物线粒体DNA相结合对牛羊肉进行鉴定，整个反应可在恒温状态下在1h之内就可完成，而且可以通过肉眼观察到反应结果。
[0005] 本发明的技术方案是：一种鉴别牛羊肉真假的LAMP检测方法，
[0006] (1)从GenBank中检索获得牛种属特异性的保守序列，并进行软件比对分析，确定序列的准确性；
[0007] (2)根据步骤(1)的序列设计多组引物，每组引物包括一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP，引物设计通过登陆Eiken Chemical公司的在线软件
PrimerExplore(http://www.primerexplorer.jp/e/)进行；利用LAMP实时浊度仪对设计引物进行特异性筛选，确定高度特异性的引物；
[0008] (3)配置23μL LAMP反应液，构建成检测体系；所述23μL LAMP反应液含有12.5μL 2×等温反应缓冲液、1μL 5μM Primer F3、1μL 5μM Primer B3、2μL20μM Primer FIP、2μL 20μM Primer BIP、1μL Bst DNA聚合酶、3.5μL水；其中：2×等温反应缓冲液含有40mM的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl(pH8.8)、20mM的氯化钾、16mM的硫酸镁、20mM的硫酸铵、20％的Tween20、1.6M甜菜碱、2.8mM dNTP。
[0009] (4)按常规方法提取基因组DNA，取1μL提取的基因组DNA和1μL的荧光检测试剂(Fluorescent Detection Reagent，FDR)加入LAMP反应液中，使终反应体积为25μL，10000rpm瞬时离心30秒混匀反应液；
[0010] (5)置60℃恒温水浴中进行LAMP扩增；
[0011] (6)根据反应液颜色进行阴阳性判断，若反应液变成绿色，说明待测样品存在牛羊肉；若为桔黄色，则待测样品不存在牛羊肉。
[0012] 本发明的优点是提供了一种利用LAMP技术，准确、廉价鉴别牛羊肉真假的标准方法。本方法具有众多优点，一是模板和引物制备简单，容易操作；二是具有高度的特异性，准确性高达100％；三是具有高度的灵敏度，比普通PCR更为灵敏，仅需极少量的样品即可(小于1克)；四是结果判定方便，通过肉眼观察即可。但本方法暂时无法区分牛肉和羊肉。
[0013] 本发明可用于任何具备相应仪器设备的部门进行牛羊肉的真假鉴别，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
附图说明
[0014] 图1为5组LAMP引物进行特异性筛选图。图1中引物自左向右顺序依次为：阳性对照、阴性对照、引物1、引物2、引物3、引物4、引物5。
[0015] 图2为各种畜禽DNA进行LAMP检测试验图。图2中自左向右DNA顺序为：阳性对照，阴性对照，猪肉、牛肉、鸭肉、羊肉、兔肉；结果显示：第1、4、6管为绿色，其余的枯黄色。
[0016] 图3为PCR检测方法灵敏度示意图，其中自左向右依次为：以10-1、10-2………10-7稀释度的Positive Control DNA(PC DNA)为模板的样品和标准品的PCR检测图。
具体实施方式
[0017] 实施例1
[0018] 1、仪器设备：LAMP实时浊度仪LA-320C、普通水浴锅。
[0019] 2、所用试剂除由生产厂家直接提供的以外，其它均为分析纯，水为超纯水。
[0020] 3、具体操作步骤
[0021] (1)从GenBank中检索获得牛452bp 12s RNA序列，并进行软件比对分析，确定序列的准确性。12S rRNA序列如下：GACCCAAACTGGGATTAGATACCCCACTATGCTTAGCCCTAAACACAGATAATTACATAAACAAAATTATTCGCCAGAGTACTACTAGCAACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGCGGTGCTTTATATCCTTCTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCGATAAACCTCACCAATTCTTGCTAATACAGTCTATATACCGCCATCTTCAGCAAACCCTAAAAAGGAAAAAAAGTAAGCGTAATTATGATACATAAAAACGTTAGGTCAAGGTGTAACCTATGAAATGGGAAGAAATGGGCTACATTCTCTACACCAAGAGAATCAAGCACGAAAGTTATTATGAAACCAATAACCAAAGGAGGATTTAGCAGTAAACTAAGAATAGAGTGCTTAGTTGAATTAGGCCATGAAGCACGCACACACCGCCCGTCACCCTCCTCAAATA(SEQ NO.5)
[0022] (2)根据上述序列利用PrimerExplore软件设计5组引物，进行特异性筛选。
[0023] 引物1：
[0024] F3：CCTAAAAAGGAAAAAAAGTAAGCG
[0025] B3：GCTTCATGGCCTAATTCAAC
[0026] FIP：GAATGTAGCCCATTTCTTCCCATGATACATAAAAACGTTAGGTCAAG
[0027] BIP：TCTACACCAAGAGAATCAAGCACGGCACTCTATTCTTAGTTTACTGC
[0028] 引物2：
[0029] F3：GCTTAAAACTCAAAGGACTTGG
[0030] B3：AGCCCATTTCTTCCCATT
[0031] FIP：GCAAGAATTGGTGAGGTTTATCGGTATATCCTTCTAGAGGAGCCT
[0032] BIP：CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACACCTTGACCTAACGT
[0033] 引物3：
[0034] F3：AACAGCTTAAAACTCAAAGGA
[0035] B3：AGCCCATTTCTTCCCATT
[0036] FIP：TGAGGTTTATCGGGGTTTATCGAGGCGGTGCTTTATATCCTT
[0037] BIP：CGCCATCTTCAGCAAACCCTGTTACACCTTGACCTAACGT
[0038] 引物4：
[0039] F3：GCTTAGCCCTAAACACAGAT
[0040] B3：AGGGTTTGCTGAAGATGG
[0041] FIP：TAAAGCACCGCCAAGTCCTTTACATAAACAAAATTATTCGCCAG
[0042] BIP：TATCCTTCTAGAGGAGCCTGTTCGGTATATAGACTGTATTAGCAAGAA
[0043] 引物5：
[0044] F3：CCCAAACTGGGATTAGATACC
[0045] B3：CTGTATTAGCAAGAATTGGTGA
[0046] FIP：TGCTAGTAGTACTCTGGCGAATAATACTATGCTTAGCCCTAAACAC
[0047] BIP：ACAGCTTAAAACTCAAAGGACTTGGGGTTTATCGGGGTTTATCGA
[0048] (3)筛选LAMP引物配置反应液
[0049] LAMP反应液构成为：每23μL的LAMP反应液中含有12.5μL 2×等温反应缓冲液、1.0μL 5μM Primer F3、1μL 5μM Primer B3、2μL 20μM Primer FIP、2μL20μM Primer BIP、1μL Bst DNA聚合酶、3.5μL水。其中：2×等温反应缓冲液由日本荣研化学株式会社提供，含有40mM的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐(pH8.8)、20mM的氯化钾、16mM的硫酸镁、20mM硫酸铵、20％的Tween20、1.6M甜菜碱、2.8mM dNTP。
[0050] 对(2)中所述的5对引物按照上面所述的体积加入LAMP反应液中，同时加入1μL荧光检测试剂和1μL牛的基因组DNA，使得终反应体积为25μL，样品放置在LAMP浊度仪中进行引物特异性的筛选。对浊度仪进行一系列的参数设定之后，仪器每6秒检测一次浊度，然后根据浊度来对引物进行筛选(如图1所示)。其中引物3反应时间最短(大概在40min左右)，其次是引物4(大概在43min左右)和引物1(46min左右)，引物2和引物5在60min内未出(即显阴性)。因此，确定引物3为最优引物。
[0051] (4)标本的采集：严格无菌采集各种畜禽DNA的新鲜肌肉组织，采用酚仿提取法提取组织样的基因组DNA。
[0052] (5)取1μL提取的基因组DNA和1μL的荧光检测试剂(优选为Loopamp荧光检测试剂)加入筛选得到的LAMP反应液中，使终反应体积为25μL，10000rpm瞬时离心30秒混匀反应液；同时设阴性、阳性对照。
[0053] (6)置60℃恒温水浴中培养45分钟进行LAMP扩增；
[0054] (7)根据反应液颜色进行阴阳性判断，若反应液变成绿色，说明待测样品存在牛羊肉，若为桔黄色，则待测样品不存在牛羊肉。
[0055] (8)灵敏度和特异性检验
[0056] 采用猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉、兔肉来检测特异性，结果显示，LAMP检测体系的特异性测试良好(如图2所示)。
[0057] 以10-1、10-2………10-7稀释度的Positive Control DNA(PC DNA)为模板分别进行LAMP和PCR比较两种检测方法的灵敏度，结果显示，LAMP法的扩增灵敏度比普通PCR法要高。普通PCR可以检测到7个稀释梯度中的第三个梯度(如图3所示)，而LAMP法可以检测到第四个梯度。
[0058] 实施例2
[0059] 从山东省内屠宰厂生产线采集鲜牛肉样品45个，鲜羊肉样品32个，鲜鸡肉样品70个，鲜鸭肉样品50个，鲜兔肉样品30个，应用实施例1的方法进行检测。检测结果如下：
[0060] 表1山东省内屠宰厂生产线牛羊肉检测结果
[0061]牛肉 羊肉 鸡肉 鸭肉 兔肉
样品数量 45 32 70 50 30
阳性数量 45 32 0 0 0
阴性数量 0 0 70 50 30
阳性比例/％ 100 100 0 0 0
[0062] 将以上来自不同畜禽品种的样品两两或两个以上混合，只要含有牛羊肉结果均为阳性，只要不含有牛羊肉结果均为阴性。
