一种抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法

摘要

本发明公开了一种抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，包括对氟莱哌素的全血样品依次进行预处理和液相色谱串联质谱法检测分析，其特征在于，所述的预处理为向氟莱哌素的全血样品中加入乙醚、内标溶液和NaF饱和水溶液，再进行冷冻离心，取冷冻离心的上清液于室温下氮气吹干，用AgNO3溶液复溶后进行离心分离，取离心分离的上清液作为液相色谱串联质谱法的样品。本发明方法检测结果准确可靠，检测限低，氟莱哌素的最低测定限为0.4ng/ml，本发明方法对氟莱哌素样品的检测的专一性强，灵敏度高，操作方便，各项方法学指标均能达到中国药典的相关技术要求。

权利要求

1.一种抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，包括对氟莱哌素的全血样品依次进行预处理和液相色谱串联质谱法检测分析，其特征在于，所述的预处理为向氟莱哌素的全血样品中加入乙醚、内标溶液和NaF饱和水溶液，再进行冷冻离心，取冷冻离心的上清液于室温下氮气吹干，用AgNO3溶液复溶后进行离心分离，取离心分离的上清液作为液相色谱串联质谱法的样品。

2.如权利要求1所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的全血样品与内标溶液的体积比为10：1。

3.如权利要求1所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的全血样品与NaF饱和水溶液的体积比为1：1.5。

4.如权利要求1所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的全血样品与乙醚的体积比为1：10。

5.如权利要求1所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的冷冻离心的上清液与AgNO3溶液的体积比为10：1。

6.如权利要求1或2所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的内标溶液为浓度为8.600ng/ml的对苯三硫醚的甲醇溶液。

7.如权利要求1所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的液相色谱串联质谱法检测分析的条件为：（1）液相色谱分离

液相色谱的流动相由体积比为85:15的流动相A与流动相B组成，流动相A为甲醇，流动相B为体积分数为0.05%的甲酸的水溶液，流速为0.6ml/min；色谱柱为ZORBAX SB-C18液相色谱柱；进样量为10μl；

（2）质谱检测

大气压电喷雾离子源，多重反应选择离子监测，阳离子电离模式：碰撞气：41.38kPa，气帘气：103.45kPa，离子喷雾电压：4500V；干燥气温度：400℃；离子源气体1：448.28kPa，离子源气体2：275.86kPa；

+

氟莱哌素母离子[M1+Ag] 及子离子测定为m/z421.1→357.0，离子去簇电压：72V，入口电压：10V，碰撞能：27V，碰撞室出口电压：4V；

+

内标对苯三硫醚母离子[M2+Ag] 及子离子测定为m/z384.9→263.0，离子去簇电压：

72V，入口电压：10V，碰撞能：25V，碰撞室出口电压：10V。

8.如权利要求7所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的色谱柱为不锈钢填充柱，内径为3.0mm，长度为150mm，粒径为3.5μm。

9.如权利要求7所述的抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，其特征在于，所述的AgNO3溶液是由流动相配制的，浓度为0.01mol/L。

说明书

一种抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药检测技术领域，具体涉及一种抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法。

背景技术

[0002] 在药物分析检测中，常用的方法有高效液相色谱法(HPLC)、离子交换色谱一紫外检测法、质谱分析法、液相色谱串联质谱法、气相色谱串联质谱法等，其中液相色谱串联质谱法将高效液相色谱的高分离效能力与质谱的强大结构测定功能组合起来，使其成为医药、化工等领域中最重要的方法之一。

[0003] 氟莱哌素是一种1.1类新型抗癌药物，具有高效、广谱、低毒、低成本的特点，目前处于临床I期研究阶段，而国内外文献中对氟莱哌素检测方法的报道很少见，在液相色谱串联质谱法分析操作中将氟莱哌素稀释液直接打进质谱无响应，无法对氟莱哌素进行定量测定。大鼠体内药动学(L.Gu，L.Li，Z.Chen，H.Pan，H.Jiang，S.Zeng，X.Xu，H.An.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.，2008(868)：77)研究报道过一种方法，为高效液相色谱检测方法，但是最低测定限(LOQ)为50ng/ml，灵敏度太低。

发明内容

[0004] 本发明提供了一种抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，操作简便，准确度高，灵敏、可靠，检测限低，结果重现性好。

[0005] 一种抗癌新药氟莱哌素的定量测定方法，包括对氟莱哌素的全血样品依次进行预处理和液相色谱串联质谱法检测分析，所述的预处理为向氟莱哌素的全血样品中加入乙醚、内标溶液和NaF饱和水溶液(室温)，再进行冷冻离心，取冷冻离心的上清液于室温下氮气吹干，用AgNO3溶液复溶后进行离心分离，取离心分离的上清液作为液相色谱串联质谱法的样品。

[0006] 所述的全血样品与内标溶液的体积比为10∶1。

[0007] 所述的全血样品与NaF饱和水溶液的体积比为1∶1.5。

[0008] 在实际操作中，并不严格限定乙醚的用量，为使全血样品中待测组分得到更好的分散，所述的全血样品与乙醚的体积比优选为1∶10。

[0009] 所述的冷冻离心的上清液与AgNO3溶液的体积比为10∶1。

[0010] 所述的内标溶液为浓度为8.600ng/ml的对苯三硫醚的甲醇溶液，以提高分析结果的准确度。

[0011] 所述的液相色谱串联质谱法检测分析的条件为：

[0012] (1)液相色谱分离

[0013] 液相色谱的流动相由体积比为85∶15的流动相A与流动相B组成，流动相A为甲醇，流动相B为体积分数为0.05％的甲酸的水溶液，流速为0.6ml/min；色谱柱为ZORBAX SB-C18液相色谱柱；进样量为10μl；

[0014] (2)质谱检测

[0015] 大气压电喷雾离子源，多重反应选择离子监测，阳离子电离模式：

[0016] 碰撞气：41.38kPa，气帘气：103.45kPa，离子喷雾电压：4500V；干燥气温度：400℃；离子源气体1：448.28kPa，离子源气体2：275.86kPa；

[0017] 氟莱哌素母离子[M1+Ag]+及子离子测定为m/z 421.1→357.0，离子去簇电压：72V，入口电压：10V，碰撞能：27V，碰撞室出口电压：4V；

[0018] 内标对苯三硫醚母离子[M2+Ag]+及子离子测定为m/z 384.9→263.0，离子去簇电压：72V，入口电压：10V，碰撞能：25V，碰撞室出口电压：10V；

[0019] 所述的色谱柱为不锈钢填充柱，内径为3.0mm，长度为150mm，粒径为3.5μm。

[0020] 所述的AgNO3溶液是由所述的流动相配制的，浓度为0.01mol/L，以避免在后续的液相色谱串联质谱法检测分析中基线不稳造成无法判断杂质峰。

[0021] 本发明对全血样品进行预处理时所采用的乙醚如无特殊说明均为零摄氏度的乙醚。

[0022] 本发明建立了全血中氟莱哌素的液质联用检测方法，本发明方法对氟莱哌素样品的检测的专一性强，灵敏度高，操作方便，各项方法学指标均能达到中国药典的相关技术要求；本发明方法检测结果准确可靠，检测限低，可达到0.4ng/ml。

附图说明

[0023] 图1为本发明氟莱哌素标准样品的一级全扫描质谱图。

[0024] 图2为本发明内标对苯三硫醚的一级全扫描质谱图。

[0025] 图3为本发明氟莱哌素标准样品的二级全扫描质谱图。

[0026] 图4为本发明内标对苯三硫醚的二级全扫描质谱图。

[0027] 图5a为本发明实施例2测试空白全血中氟莱哌素的色谱图。

[0028] 图5b为本发明实施例2测试空白全血中内标的色谱图。

[0029] 图5c为本发明实施例2测试空白全血加氟莱哌素(40ng/ml)和内标(8.600ng/ml)后的样品中氟莱哌素的色谱图。

[0030] 图5d为本发明实施例2测试空白全血加氟莱哌素(40ng/ml)和内标后的样品中内标(8.600ng/ml)的色谱图。

[0031] 图5e为本发明实施例2测试病人给药后的病人全血中氟莱哌素的色谱图。

[0032] 图5f为本发明实施例2测试病人给药后的病人全血中内标的色谱图。

[0033] 图6为本发明实施例2氟莱哌素在全血中的降解率图。

[0034] 图7为本发明实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8氟莱哌素在病人全血中的血药浓度曲线图。

[0035] 图8为本发明实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8中氟莱哌素在病人全血中的血药浓度曲线图的局部放大图。

具体实施方式

[0036] 实施例1

[0037] (1)标准溶液配制

[0038] 精密称取氟莱哌素标准样品8.350mg，置5ml容量瓶中，加甲醇溶解、定容，得标准样品储备液，置-20℃冰箱中备用。

[0039] 精密称取对苯三硫醚对照品8.600mg，置5ml的容量瓶中，加甲醇溶解、定容，得浓度为1.720mg/ml的母液，即内标储备液，置-20℃冰箱中备用；使用前加甲醇稀释，配成浓度为8.600ng/ml的对苯三硫醚溶液。

[0040] (2)样品的预处理

[0041] 从超低温(-80℃左右)冰箱中取出氟莱哌素的全血样品1.7ml，直接加入乙醚(0℃)，震荡融化，转移至50ml离心管中，再次加入乙醚(0℃)，乙醚总量为17ml，再依次加入170μl对苯三硫醚溶液、2550μl NaF饱和溶液(室温状态的饱和溶液)，涡旋震荡2min，4℃下4000rpm冷冻离心5min，取上清液5ml室温下氮气吹干，用0.01mol/L流动相(具体组成可参见步骤(4))配制的AgNO3溶液500μl复融，震荡1.5min，转移到1.5ml微量离心管中10900rpm离心10min，取上清液200μl置进样瓶中进样分析；

[0042] (3)液相色谱分离

[0043] 仪器：Agilent RRLC1200安捷伦超高速高分离液相色谱仪。

[0044] 流动相由体积比为85∶15的流动相A与流动相B组成，流动相A为甲醇，流动相B为甲酸的水溶液(甲酸的体积分数为0.05％)，流速为0.6ml/min；色谱柱为ZORBAX SB-C18液相色谱柱，内径为3.0mm，长度为150mm，粒径为3.5μm；进样量为10μl；

[0045] (4)质谱检测

[0046] 仪器：API 4000三重四极杆质谱仪(美国应用生物系统(AB)公司，美国)；software工作站V1.4.2；

[0047] 离子源：大气压电喷雾离子源(ESI)；

[0048] 扫描方式：阳离子MRM扫描；

[0049] 离 子 源 参 数：离 子 源 气 体1：65psi(448.28kPa)；离 子 源 气 体 2：40psi(275.86kPa)；碰撞气：6psi(41.38kPa)；气帘气：15psi(103.45kPa)；离子喷雾电压：
4500V；干燥气温度：400℃；

[0050] 定性离子对、定量离子对和相关参数：

[0051]Q1m/z Q2m/z DP(V) EP(V) CE(V) CXP(V)
氟莱哌素 421.1 357.0 72 10 27 4
对苯三硫醚 384.9 263.0 72 10 25 10

[0052] (5)浓度计算方法：按内标法以峰面积或峰高法，计算全血样品中氟莱哌素含量；

[0053] (6)结果：

[0054] 氟莱哌素测定的方法学包括专属性、标准曲线与线性范围、回收率、精密度与准确度、样品稳定性等均符合中国药典的规定。

[0055] 实施例2方法学验证

[0056] 采用上述实施例1的检测条件和方法，对本发明方法进行了方法学验证。

[0057] 1.专属性考察

[0058] 在实施例1的检测条件下，空白全血的内源性物质不干扰氟莱哌素和内标的测定，专属性高，本方法具有较高的特异性，能准确测定全血中氟莱哌素的浓度，灵敏度高，见图5a-图5f，其中图5a为空白全血中氟莱哌素的色谱图，图5b为测试空白全血中内标的色谱图，图5c为测试空白全血加氟莱哌素(40ng/ml)和内标溶液(8.600ng/ml)后的样品中氟莱哌素的色谱图，图5d为测试空白全血加氟莱哌素(40ng/ml)和内标溶液后的样品中内标(8.600ng/ml)的色谱图，图5e为测试病人给药后的病人全血中氟莱哌素的色谱图，图5f为本发明实施例2测试病人给药后的病人全血中内标的色谱图。

[0059] 2.标准曲线的制备和线性范围考察

[0060] 用空白全血配制氟莱哌素药物浓度分别为0.4、0.8、1.6、4、8、16、40、80ng/ml的标准曲线全血氟莱哌素样品，按实施例1所述的色谱及质谱条件下进行测定，以氟莱哌素浓度X(ng/ml)为横坐标，以氟莱哌素和内标对苯三硫醚峰面积比值Y为纵坐标，采用加权(1/x)最小二乘法进行线性回归，得标准曲线的回归方程，其标准曲线回归方程为Y＝(90.479±0.008485)X-(0.0098±0.002475)，R值为0.9991～0.9999；后续验证证明在氟莱哌素浓度0.4～1600ng/ml范围内的标准曲线回归方程为Y＝(0.0606±0.0278)X+(0.152±0.171)，R值为0.9991～0.9999，说明氟莱哌素在0.4～1600ng/ml浓度范围内线性关系良好，本发明方法氟莱哌素在全血中的最低定量限为0.4ng/ml。

[0061] 3.基质效应考察

[0062] A(对照品溶液的响应值)：取160μl流动相配置的0.01mol/L的AgNO3溶液，加入170μl对苯三硫醚溶液和170μl低、中、高不同浓度的氟莱哌素标准样品储备液，相当于全血中氟莱哌素的浓度为低(L)0.64ng/ml、中(M)6.4ng/ml、高(H)64ng/ml以及内标对苯三硫醚(0.86ng/ml)，涡旋30秒，3000rpm离心1min，取上清液10μl进样得到峰面积A。

[0063] B(添加已知浓度对照品在经预处理的空白生物样品基质中的响应值)：取6个空白全血，分别按以下方法操作处理：直接加入乙醚(0℃)，震荡融化，转移至50ml离心管中，再次加入乙醚(0℃)，乙醚总量17ml，加入170μl对苯三硫醚溶液，加入2550μl NaF饱和溶液，涡旋震荡2min，4000rpm离心5min，取上清液5ml于室温下氮气吹干，取160μl流动相配制的0.01mol/L的AgNO3溶液，加入170μl对苯三硫醚溶液和170μl低、中、高不同浓度的氟莱哌素标准样品储备液，相当于全血中氟莱哌素的浓度为低(L)0.64ng/ml、中(M)6.4ng/ml、高(H)64ng/ml，以及内标浓度0.86ng/ml，涡旋30秒，3000rpm离心1min，取上清液进样10μl得峰面积B。

[0064] 基质效应为：

[0065]

[0066] 采用低、中、高三个浓度点，各条件下重复测定6个样品，基质效应考察结果如表1所示。

[0067] 表1基质效应考察

[0068]

[0069] 4.提取回收率试验

[0070] 氟莱哌素低、中、高三种浓度样品的提取回收率见表2所示，结果显示低、中、高三种浓度氟莱哌素样品的平均提取回收率分别为97.15％、106.92％、110.91％。

[0071] 表2提取回收率考察

[0072]

[0073] 5.方法效率

[0074] 氟莱哌素低、中、高三种浓度样品的方法效率见表3所示，结果显示低、中、高三种浓度样品的氟莱哌素平均方法效率分别为71.36％、97.15％、103.90％。

[0075] 表3方法效率考察

[0076]

[0077] 6.精密度和准确度试验

[0078] 6.1日内精密度及准确度

[0079] 按实施例1所述方法处理氟莱哌素浓度分别为0.4ng/ml(LLOQ)、0.64ng/ml(低)、6.4ng/ml(中)、64ng/ml(高)的含药全血样品各6份，在同一天内分别测定，根据随行标准曲线，计算实测浓度，分析日内精密度R.S.D和准确度R.E见表4所示，由表4可知，LLOQ、低、中、高四种浓度氟莱哌素的R.S.D分别为2.37％、8.48％、6.21％、5.49％，R.E分别为
97.54％、103.59％、97.66％、103.88％。

[0080] 表4日内精密度考察

[0081]

[0082] 平均回收率(％)＝平均实测值/理论值*100％

[0083] 6.2日间精密度及准确度

[0084] 分别在不同日期制备氟莱哌素浓度为0.64ng/ml(低)、6.4ng/ml(中)、64ng/ml(高)的含药全血样品各6份，共进行3批次测定(共54个样品)，每批次随行一条标准曲线，根据随行标准曲线，计算实测浓度，分析日内精密度R.S.D和准确度R.E见表5所示。由表5可知，低、中、高三种浓度氟莱哌素样品的R.S.D分别为6.76％、5.80％、4.84％，R.E分别为98.01％、100.24％、100.76％。

[0085] 表5日间精密度考察

[0086]

[0087] 7.稳定性考察

[0088] 7.1储备液稳定性试验

[0089] 分别将已储存半个月、一个月、两个月、三个月的氟莱哌素标准样品储备液和内标储备液用甲醇稀释到1μg数量级，银离子络合之后直接质谱进样，得氟莱哌素标准样品和内标溶液在-20℃条件下保存三个月之内稳定。

[0090] 7.2上样液的稳定性试验

[0091] 配制氟莱哌素浓度分别为0.64ng/ml(低)、6.4ng/ml(中)、64ng/ml(高)三种浓度的含药全血样本各6份，置室温中分别于0h、24h、48h内测定。上样液在48h内基本稳定，见表6。

[0092] 表6氟莱哌素上样液稳定性

[0093]

[0094] 7.3全血样本室温放置的稳定性试验

[0095] 氟莱哌素在全血中非常不稳定，2.5分钟即可降解20％以上，8-10分钟左右即降解一半，样品室温放置半个小时几乎降解80-90％，见表7。氟莱哌素在全血中的降解率图如图6所示。说明化冻操作过程必须非常快，否则极易引起测量偏差。

[0096] 表7氟莱哌素全血样本室温放置稳定性

[0097]

[0098] 7.4全血样本反复冻融的稳定性试验

[0099] 氟莱哌素全血样本冻融1次后损失近50％。提示氟莱哌素全血样本不能反复冻融操作。

[0100] 7.5全血样本的冷冻稳定性试验

[0101] 氟莱哌素全血样本冷冻保存21天测定基本稳定，见表8。

[0102] 表8氟莱哌素全血样本冷冻稳定性

[0103]

[0104] 实施例3

[0105] 根据实施例1所述的方法和条件，对病人全血中的氟莱哌素浓度进行分析，病人给药浓度为130mg/ml，在服用抗癌新药氟莱哌素1h后，病人全血中氟莱哌素的浓度为36.482ng/ml。

[0106] 实施例4

[0107] 根据实施例1所述的方法和条件，对病人全血中的氟莱哌素浓度进行分析，病人给药浓度为130mg/ml，在服用抗癌新药氟莱哌素2h后，病人全血中氟莱哌素的浓度为20.118ng/ml。

[0108] 实施例5

[0109] 根据实施例1所述的方法和条件，对病人全血中的氟莱哌素浓度进行分析，病人给药浓度为130mg/ml，在服用抗癌新药氟莱哌素3h后，病人全血中氟莱哌素的浓度为5.437ng/ml。

[0110] 实施例6

[0111] 根据实施例1所述的方法和条件，对病人全血中的氟莱哌素浓度进行分析，病人给药浓度为130mg/ml，在服用抗癌新药氟莱哌素3.25h后，病人全血中氟莱哌素的浓度为0.995ng/ml。

[0112] 实施例7

[0113] 根据实施例1所述的方法和条件，对病人全血中的氟莱哌素浓度进行分析，病人给药浓度为130mg/ml，在服用抗癌新药氟莱哌素3.5h后，病人全血中氟莱哌素的浓度为0.739ng/ml。

[0114] 实施例8

[0115] 根据实施例1所述的方法和条件，对病人全血中的氟莱哌素浓度进行分析，病人给药浓度为130mg/ml，在服用抗癌新药氟莱哌素4h后，病人全血中氟莱哌素的浓度为0.354ng/ml。