检测单链和/或双链DNA的分子探针及其应用转让专利
申请号 : CN201210006970.3
文献号 : CN102590494B
文献日 : 2014-04-09
发明人 : 田丹碧 , 刘会祥 , 唐雪梅 , 马玉洁 , 梅亚军 , 宋荣斌
申请人 : 南京工业大学
摘要 :
本发明属于材料制备技术领域，涉及一种检测单链和/或双链DNA的分子探针及其应用。本发明通过对现有技术中的合成方法进行了优化，并优化合成了[Ru(bpy)2(dppz)]2+，发现其具有单链和双链两种探针的作用。发明人初步认为是通过合成方法的优化造成了其分子的空间构形发生了改变，即通过本发明所述的合成方法得到的异构体与DNA的键合方式都存在差异，使得本发明的分子探针具有单链探针的作用，发明人将对该作用机理进行进一步的探索研究。
权利要求 :
1.一种化学结构式I的分子探针，其特征在于其通过合成路线II所述的方法制备而得：
1）化合物1的合成：将邻菲啰啉与溴化钾干燥后加入到充分冷却的浓硫酸中，充分冷却后再滴加HNO3；将反应体系加热到40～50℃恒温2小时，再升温到80～90℃恒温2小时，再到120℃恒温1小时，然后降温到80℃恒温一夜；冷却到室温后，中和反应体系至pH=6～7，减压抽滤后用CH2Cl2萃取至CH2Cl2接近无色得到化合物1粗产品；
2）化合物2的合成：用乙醇溶解化合物1，然后滴加邻苯二胺的乙醇溶液；回流两小时得到淡黄色絮状沉淀，减压抽滤，重结晶后真空干燥得到海绵状黄色固体即化合物2；
3）化合物3的合成：将N,N’-二甲基甲酰胺加入三氯化钌和2,2’-联吡啶的混合体系，加热回流4个小时后，蒸发掉将所得溶液的大部分溶剂，剩下的溶液冷却至室温后，再加入丙酮并保持温度0℃静置24个小时，析出棕黑色的固体不溶物即化合物3粗产品；
4）化学结构式I的分子探针的合成：将化合物3与化合物2按照摩尔比为1∶1.1的比例加入乙醇中，在氮气保护下加热回流直到反应溶液变为红色透明溶液为止，冷却到室温；蒸出大部分溶剂后加入水煮沸后，再放到冰水浴中冷却，析出不溶物；经过滤，洗涤，旋蒸，重结晶，得到化学结构式I的探针分子；
2.根据权利要求1所述的化学结构式I的分子探针，其特征在于所述的步骤1）的粗产品在甲醇中重结晶，得到黄色固体纯品。
3.根据权利要求1所述的化学结构式I的分子探针，其特征在于所述的步骤1）对产物pH的调节中和时先用浓NaOH溶液，后用Na2CO3溶液直至无气泡产生。
4.根据权利要求1所述的化学结构式I的分子探针，其特征在于所述的步骤3）将化合物3粗产品减压抽滤并用蒸馏水洗涤粗产品两次；再将所得粗产品放在水与乙醇为体积比1:1的混合溶液中加热回流一个小时后过滤，再加入氯化锂充分搅拌；最后蒸发溶液中的乙醇，剩下的水溶液冷却后再继续放在冰浴中冷却；静置24个小时后，溶液中析出黑色晶体；过滤，真空干燥得到化合物3纯品。
5.权利要求1所述的化学结构式I的分子探针的制备方法，其特征在于其通过合成路线II所述的方法制备而得：
1）化合物1的合成：将邻菲啰啉与溴化钾干燥后加入到充分冷却的浓硫酸中，充分冷却后再滴加HNO3；将反应体系加热到40～50℃恒温2小时，再升温到80～90℃恒温2小时，再到120℃恒温1小时，然后降温到80℃恒温一夜；冷却到室温后，中和反应体系至pH=6～7，减压抽滤后用CH2Cl2萃取至CH2Cl2接近无色得到化合物1粗产品；
2）化合物2的合成：用乙醇溶解化合物1，然后滴加邻苯二胺的乙醇溶液；回流两小时得到淡黄色絮状沉淀，减压抽滤，重结晶后真空干燥得到海绵状黄色固体即化合物2；
3）化合物3的合成：将N,N’-二甲基甲酰胺加入三氯化钌和2,2’-联吡啶的混合体系，加热回流4个小时后，蒸发掉将所得溶液的大部分溶剂，剩下的溶液冷却至室温后，再加入丙酮并保持温度0℃静置24个小时，析出棕黑色的固体不溶物即化合物3粗产品；
4）化学结构式I的分子探针的合成：将化合物3与化合物2按照摩尔比为1∶1.1的比例加入乙醇中，在氮气保护下加热回流直到反应溶液变为红色透明溶液为止，冷却到室温；蒸出大部分溶剂后加入水煮沸后，再放到冰水浴中冷却，析出不溶物；经过滤，洗涤，旋蒸，重结晶，得到化学结构式I的探针分子；
6.根据权利要求5所述的化学结构式I的分子探针的制备方法，其特征在于所述的步骤1）的粗产品在甲醇中重结晶，得到黄色固体纯品。
7.根据权利要求5所述的化学结构式I的分子探针的制备方法，其特征在于所述的步骤1）对产物pH的调节中和时先用浓NaOH溶液，后用Na2CO3溶液直至无气泡产生。
8.根据权利要求5所述的化学结构式I的分子探针的制备方法，其特征在于所述的步骤3）将化合物3粗产品减压抽滤并用蒸馏水洗涤粗产品两次；再将所得粗产品放在水与乙醇为体积比1:1的混合溶液中加热回流一个小时后过滤，再加入氯化锂充分搅拌；最后蒸发溶液中的乙醇，剩下的水溶液冷却后再继续放在冰浴中冷却；静置24个小时后，溶液中析出黑色晶体；过滤，真空干燥得到化合物3纯品。
9.权利要求1所述的化学结构式I的分子探针的应用，其特征在于将化学结构式为I的分子探针与单链和/或双链DNA溶解于HCl-Tris缓冲液中配制成水溶液，复合所得到的荧光探针用于单链和/或双链DNA的荧光分析。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的Tris-HCl为弱酸性或弱碱性。
说明书 :
检测单链和/或双链DNA的分子探针及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于材料制备技术领域，涉及一种检测单链和/或双链DNA的分子探针及其应用；具体是一种基于Ru配合物作为荧光分子探针，其应用在于其能够与单链DNA(ssDNA)或者双链DNA(dsDNA)作用从而产生荧光信号。
背景技术
[0002] 核酸作为遗传信息的重要载体，在生物传感体系的研究应用中，核酸的检测分析一直是一项非常重要的研究内容，其中DNA的特异性识别在基因组学、疾病诊断、病毒学、分子生物学等领域越来越得到更多的重视和研究。现有技术对双链DNA(dsDNA)的研究已经较为普遍和成熟，然而，能够检测单链DNA分子的荧光分子探针却相对较少，能够同时对单链DNA(ssDNA)和双链DNA进行简单快速、低成本、高灵敏的识别存在较大的挑战，而这些技术正是在DNA检测分析中极为重要的一环。
[0003] 近年来，吸光度法、荧光法、瑞丽光散射法、化学发光法以及电化学法在核酸分析中得到普遍的应用，其中因荧光法具有操作简便，高灵敏度和可见性等特点得到广泛的研究。自Barton等人在研究一系列Ru(II)多吡啶类配合物与核酸相互作用时发现，其在水溶液中没有荧光，而当溶液里有dsDNA存在时有很强的荧光，因此把它们称为核酸分子“光开关”。近年核酸分子“光开关”型探针得到了广泛深入的研究，合成开发特异性的荧光探2+
针成为DNA荧光传感策略中的关键，[Ru(bpy)2dppz] 是DNA分子开关中最为经典的一种，
2+
目前已知文献中，大都是对[Ru(bpy)2dppz] 作为dsDNA探针的研究，然而，还未见利用
2+
[Ru(bpy)2dppz] 来检测ssDNA分子的报道。
针成为DNA荧光传感策略中的关键，[Ru(bpy)2dppz] 是DNA分子开关中最为经典的一种，
2+
目前已知文献中，大都是对[Ru(bpy)2dppz] 作为dsDNA探针的研究，然而，还未见利用
2+
[Ru(bpy)2dppz] 来检测ssDNA分子的报道。
[0004] 尽管关于[Ru(bpy)2(dppz)]2+的研究已经近20年了，其与DNA的键合机理的一直备受争议，目前较多认可的是此探针的dppz配体通过插层作用插入到双链DNA中。然而，在2009年Barton课题组发现该探针存在的多种异构体与DNA的键合方式都存在差异，如[1]Δ(右手异构)型配合物容易键合B-DNA，而∧(左手异构)型配合物容易键合Z-DNA 。
导致这种结果的主要原因是由于探针的空间结构不同从而使键合方式发生改变。
导致这种结果的主要原因是由于探针的空间结构不同从而使键合方式发生改变。
[0005] 本发明涉及的参考文献：
[0006] [1]Lim，M.H.，et al.，Sensitivity of Ru(bpy)(2)dppz(2+)Luminescence to DNA Defects.Inorganic Chemistry，2009.48(12)：p.5392-5397.
[0007] [2]Friedman，A.E.，et al.，A molecular light switch for DNA：Ru(bpy)2(dppz)2+.Journal of the American Chemical Society，1990.112(12)：
p.4960-4962.
p.4960-4962.
[0008] [3]HolmLin，R.E.，E.D.A.Stemp，and J.K.Barton，Ru(phen)2dppz2+Luminescence：Dependence on DNA Sequences and Groove-Binding Agents.Inorganic Chemistry，1998.37(1)：p.29-34.
[0009] [4]Wang，J.，et al.，Aptamer-BasedATP Assay Using a Luminescent Light Switching Complex.Analytical Chemistry，2005.77(11)：p.3542-3546.
[0010] [5]Barton，J.K.，E.D.Olmon，and P.A.Sontz，Metal complexes for DNA-mediated charge transport.Coordination Chemistry Reviews，2011.255(7-8)：p.619-634.
发明内容
[0011] 本发明所要解决的技术问题是通过优化合成方法而提供一种能够检测ssDNA和/或dsDNA的分子探针，使得本发明的分子探针合成过程简单可控，得到的分子探针可以简单快速反映出溶液中是否存在DNA分子，且本发明最大的优点在于可直接有效检测溶液中的ssDNA和/或dsDNA，免除因使用昂贵的带有荧光标记的DNA探针而导致操作步骤繁琐，检测成本高的问题。
[0012] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
[0013] 一、一种化学结构式I的分子探针(名称：2，2’-联吡啶二吡啶并[3，2-a：2’，2+
3’-c]吩嗪钌，简称[Ru(bpy)2dppz] )；其特征在于其通过合成路线II所述的方法制备而得：
3’-c]吩嗪钌，简称[Ru(bpy)2dppz] )；其特征在于其通过合成路线II所述的方法制备而得：
[0014] 1)化合物1的合成：将邻菲哕啉与溴化钾干燥后加入到充分冷却的浓硫酸中，充分冷却后再滴加HNO3；将反应体系加热到40～50℃恒温2小时，再升温到80～90℃恒温2小时，再到120℃恒温1小时，然后降温到80℃恒温一夜；冷却到室温后，中和反应体系至pH＝6～7，减压抽滤后用CH2Cl2萃取至CH2Cl2接近无色得到化合物1粗产品。
[0015] 进一步地，粗产品在甲醇中重结晶，得到黄色固体纯品；
[0016] 进一步地，对产物pH的调节中和时先用浓NaOH溶液，后用Na2CO3溶液直至无气泡产生。
[0017] 2)化合物2的合成：用乙醇溶解化合物1，然后滴加邻苯二胺的乙醇溶液；回流两小时得到淡黄色絮状沉淀，减压抽滤，重结晶后真空干燥得到海绵状黄色固体即化合物2。
[0018] 3)化合物3的合成：将N，N’-二甲基甲酰胺加入三氯化钌和2，2’-联吡啶的混合体系，加热回流4个小时后，蒸发掉将所得溶液的大部分溶剂，剩下的溶液冷却至室温后，再加入丙酮并保持温度0℃静置24个小时，析出棕黑色的固体不溶物即化合物3粗产品。
[0019] 进一步地，将化合物3粗产品减压抽滤并用蒸馏水洗涤粗产品两次；再将所得粗产品放在水与乙醇为体积比1∶1的混合溶液中加热回流一个小时后过滤，再加入氯化锂充分搅拌；最后蒸发溶液中的乙醇，剩下的水溶液冷却后再继续放在冰浴中冷却；静置24个小时后，溶液中析出黑色晶体；过滤，真空干燥得到化合物3纯品。
[0020] 4)化学结构式I的分子探针的合成：将化合物3与化合物2按照摩尔比为1∶1.1的比例加入乙醇中，在氮气保护下加热回流直到反应溶液变为红色透明溶液为止，冷却到室温；蒸出大部分溶剂后加入水煮沸后，再放到冰水浴中冷却，析出不溶物；经过滤，洗涤，旋蒸，重结晶，得到化学结构式I的探针分子；
[0021]
[0022] 二、本发明所述化学结构式I的分子探针的制备方法：
[0023] 1)化合物1的合成：将邻菲哕啉与溴化钾干燥后加入到充分冷却的浓硫酸中，充分冷却后再滴加HNO3；将反应体系加热到40～50℃恒温2小时，再升温到80～90℃恒温2小时，再到120℃恒温1小时，然后降温到80℃恒温一夜；冷却到室温后，中和反应体系至pH＝6～7，减压抽滤后用CH2Cl2萃取至CH2Cl2接近无色得到化合物1粗产品。
[0024] 进一步地，粗产品在甲醇中重结晶，得到黄色固体纯品。
[0025] 进一步地，对产物pH的调节中和时先用浓NaOH溶液，后用Na2CO3溶液直至无气泡产生。
[0026] 2)化合物2的合成：用乙醇溶解化合物1，然后滴加邻苯二胺的乙醇溶液；回流两小时得到淡黄色絮状沉淀，减压抽滤，重结晶后真空干燥得到海绵状黄色固体即化合物2。
[0027] 3)化合物3的合成：将N，N’-二甲基甲酰胺加入三氯化钌和2，2’-联吡啶的混合体系，加热回流4个小时后，蒸发掉将所得溶液的大部分溶剂，剩下的溶液冷却至室温后，再加入丙酮并保持温度0℃静置24个小时，析出棕黑色的固体不溶物即化合物3粗产品。
[0028] 进一步地，将化合物3粗产品减压抽滤并用蒸馏水洗涤粗产品两次；再将所得粗产品放在水与乙醇为体积比1∶1的混合溶液中加热回流一个小时后过滤，再加入氯化锂充分搅拌；最后蒸发溶液中的乙醇，剩下的水溶液冷却后再继续放在冰浴中冷却；静置24个小时后，溶液中析出黑色晶体；过滤，真空干燥得到化合物3纯品。
[0029] 4)化学结构式I的分子探针的合成：将化合物3与化合物2按照摩尔比为1∶1.1的比例加入乙醇中，在氮气保护下加热回流直到反应溶液变为红色透明溶液为止，冷却到室温；蒸出大部分溶剂后加入水煮沸后，再放到冰水浴中冷却，析出不溶物；经过滤，洗涤，旋蒸，重结晶，得到化学结构式I的探针分子；
[0030]
[0031] 三、本发明的化学结构式I的分子探针的应用。
[0032] 具体地，将化学结构式为I的分子探针与单链和/或双链DNA溶解于HCl-Tris缓冲液中配制成水溶液，复合所得到的荧光探针用于单链和/或双链DNA的荧光分析。
[0033] 进一步地，所述的Tris-HCl为弱酸性或弱碱性。
[0034] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0035] 1、本发明合成了一种可与单链DNA作用的水溶性荧光探针分子；通过对检测体系的荧光现象测定，该探针分子可直接有效检测出水介质中的ssDNA和dsDNA；本发明无需标记型荧光探针，检测成本低，操作简便，制备工艺可行性高，免除了因使用昂贵的带有荧光标记的DNA探针而导致操作繁琐、检测成本高等问题；
[0036] 2、本发明通过对现有技术中的合成方法进行了优化，具体的区别在于：本发明步骤1)中，对产物pH的调节中和时先用浓NaOH溶液，后用Na2CO3溶液直至无气泡产生；且中和后加入减压抽滤操作后再进行萃取。而现有技术的方法直接用NaOH溶液中和，且无抽滤操作。另外，本发明步骤4)中，通过蒸发浓缩和混合溶剂法重结晶沉淀产物进行提纯；而传统方法加入了BF4-类阴离子沉淀产物进行提纯。
[0037] 现有技术对本发明所述的同样化学结构式的该探针键合双链DNA产生荧光已经[2-5]得到普遍应用，但其与单链DNA作用发生荧光现象的还未有报道 。本发明通过上述方法+
优化合成了[Ru(bpy)2(dppz)]2，发现其具有单链和双链两种探针的作用。发明人初步认为是通过合成方法的优化造成了其分子的空间构形发生了改变，即通过本发明所述的合成方法得到的异构体与DNA的键合方式都存在差异，使得本发明的分子探针具有单链探针的作用，发明人将对该作用机理进行进一步的探索研究。
优化合成了[Ru(bpy)2(dppz)]2，发现其具有单链和双链两种探针的作用。发明人初步认为是通过合成方法的优化造成了其分子的空间构形发生了改变，即通过本发明所述的合成方法得到的异构体与DNA的键合方式都存在差异，使得本发明的分子探针具有单链探针的作用，发明人将对该作用机理进行进一步的探索研究。
附图说明
2+
[0038] 图1为本发明的[Ru(bpy)2(dppz)] 在CD3CN(氘代乙腈)中的核磁共振谱图；
[0039] δH(CD3CN)9.66(2H，d，J＝8.4Hz)，8.57(4H，t，J＝9.3Hz)，8.48(2H，dd，J＝3.3，6.6Hz)，8.20-8.10(6H，overlapping multiplets)，8.03(2H，td，J ＝ 1.0，7.9Hz)，
7.90(2H，dd，J ＝5.4，8.1Hz)，7.87(2H，dd，J＝ 0.9，5.1Hz)，7.74(2H，d，J＝ 5.5Hz)，
7.48(2H，ddd，J＝0.6，6.4Hz)，and 7.27(2H，ddd，J＝1.2，6.3Hz)。
7.90(2H，dd，J ＝5.4，8.1Hz)，7.87(2H，dd，J＝ 0.9，5.1Hz)，7.74(2H，d，J＝ 5.5Hz)，
7.48(2H，ddd，J＝0.6，6.4Hz)，and 7.27(2H，ddd，J＝1.2，6.3Hz)。
[0040] 图2为本发明的[Ru(bpy)2(dppz)]2+在水溶液中紫外可见吸收光谱图。
[0041] 图3为不同浓度本发明的[Ru(bpy)2dppz]2+溶液与一定浓度dsDNA溶液荧光发射光谱图；
[0042] 其中，主图：不同浓度的[Ru(bpy)2(dppz)]2+(0，2，20，40，100，200，400μmol·L-1)-1 2+与10μmol·L dsDNA荧光曲线图，荧光信号强度随[Ru(bpy)2(dppz)] 浓度的增高而增大；
2+
插图：荧光强度随[Ru(bpy)2(dppz)] 浓度变化曲线图。
2+
插图：荧光强度随[Ru(bpy)2(dppz)] 浓度变化曲线图。
[0043] 图4为不同浓度ssDNA溶液与本发明的一定浓度[Ru(bpy)2dppz]2+溶液荧光发射光谱图；
[0044] 其 中，主 图：为 用 不 同 浓 度 的 ssDNA(0，0.01，0.10，1.0，5.0，10，25，50，-1 -1 2+100μmol·L DNA3)10μL与40μmol·L [Ru(bpy)2(dppz)] 荧光曲线图；插图为荧光强度随DNA3浓度变化曲线图。
[0045] 图5为用6种ssDNA各10μmol·L-1与40μmol·L-1[Ru(bpy)2(dppz)]2+荧光曲线图。
[0046] 其中，DNA1-6序列放在最下。
[0047] 图6为利用DNA4上的巯基固定于金电极上，将电极置于[Ru(bpy)2(dppz)]2+探针溶液和缓冲空白溶液中的循环伏安(CV)图。
[0048] 图7为利用DNA4固定于金电极上，将电极置于[Ru(bpy)2(dppz)]2+探针溶液和缓冲空白溶液中的计时电量(CC)图。
具体实施方式
[0049] 实施例1
[0050] 本实施例说明本发明所述的化学结构式为I的分子探针[Ru(bpy)2dppz]2+的合成方法，如路线II所示。
[0051] 1)化合物1的合成：称取邻菲哕啉2.0g与溴化钾3.5g一起放到真空干燥箱中干燥一夜，加入到被冰水浴充分冷却的20mL的浓硫酸中，充分冷却后再滴加10mL HNO3，移去冰水浴，用油浴加热到40-50℃，恒温2小时，升温到80-90℃恒温2小时，再到120℃恒温1小时，然后降温到80℃恒温一夜。冷却到室温后，中和至pH＝6-7(不大于7)，减压抽滤，然后滤液用CH2Cl2萃取至CH2Cl2接近无色。旋蒸，在甲醇中重结晶，得到黄色固体3.8g。
[0052] 2)化合物2的合成：40mL乙醇溶解1.2g邻菲罗啉二酮，然后滴加0.64g邻苯二胺的乙醇溶液。回流两小时得到淡黄色絮状沉淀，减压抽滤，重结晶后真空干燥得到海绵状黄色固体。
[0053] 3)化合物3的合成：称取三氯化钌1.04g，2，2’-联吡啶1.29g，把两种药品放入100mL干燥、洁净的烧瓶中，然后加入N，N’-二甲基甲酰胺50mL，加热回流4个小时后，将所得溶液的溶剂大部分蒸发掉，剩下的溶液冷却至室温后，再加入50mL丙酮，放在冰箱内并保持温度在0℃，静置24个小时，这时候析出棕黑色的固体不溶物，然后采用减压抽滤的方法将产物过滤出来，用适量蒸馏水洗涤粗产品两次；再将所得粗产品放在水与乙醇为1∶1的200mL混合溶液中，继续加热回流一个小时，过滤，然后加入15g氯化锂，充分搅拌；蒸发溶液中的乙醇，剩下的水溶液冷却后再继续放在冰浴中冷却；静置24个小时后，溶液中析出黑色晶体。过滤，真空干燥。
[0054] 4)化合物4的合成：将0.30gRu(bpy)2Cl2·2H2O与0.18g dppz(摩尔比为1∶1.1)加入到50mL的圆底烧瓶中，以25mL乙醇为溶剂，在氮气保护下加热回流直到反应溶液变为红色透明溶液为止，冷却到室温。蒸出大部分溶剂，然后加入一定量的水同时煮沸，再放到冰水浴中冷却，此时有大量的不溶物析出(dppz不溶于水)。经过滤，洗涤，旋蒸，然后用混合溶剂法重结晶，就可得到目标产物。
[0055] 5)将[Ru(bpy)2dppz]2+配合物与单链(双链)DNA溶解于HCl-Tris缓冲液中配制成一定浓度的水溶液，然后混合，复合所得到的荧光探针即可用于单链(双链)DNA的荧光分析。
[0056] 所述步骤3)中，对产物pH的调节中和时先用浓NaOH溶液，后用Na2CO3溶液直至无气泡产生。
[0057] 所述步骤5)中，使用的Tris-HCl可为弱酸性或弱碱性。
[0058]
[0059]
[0060] 最后得到的化学结构式为I的[Ru(bpy)2(dppz)]2+在CD3CN(氘代乙腈)中的核磁共振谱图如图1所示；其在水溶液中紫外可见吸收光谱图如图2所示。
[0061] 实施例2
[0062] 本实施例说明将化学结构式为I的分子探针的应用，即将其与单链和/或双链DNA溶解于HCl-Tris缓冲液中配制成水溶液，复合所得到的荧光探针用于单链和/或双链DNA的荧光分析。
[0063] 其中，所述的六组ssDNA样品溶液涉及的ssDNA为：
[0064] DNA1：CTCACTATAGGAAGAGATGGATGTCTGT；
[0065] DNA2：ACAGACATCATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGTGAG；
[0066] DNA3：ACTCACTATAGGAAGAGATTCTGT；
[0067] DNA4：HS-(CH2)6-AAAGCGGTTGTGTTCAGTTGC；
[0068] DNA5：GCACGCCTCACTATAGGAAGAGATGATTGCGTGC；
[0069] DNA6：AATCATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGTGAG。
[0070] 以上引物由上海生工(Sangon Inc)合成及纯化。
[0071] 所述的dsDNA溶液涉及的dsDNA为：由DNA5和DNA6互补而成，以上引物由上海生工(Sangon Inc)合成及纯化。
[0072] (1)dsDNA与不同浓度的[本发明所述的Ru(bpy)2(dppz)]2+探针分子作用[0073] 称取适量实施例1所合成的Ru配合物探针，溶解于5mmol·L-1 Tris，50mmol·L-1 NaCl，pH7.4缓冲溶液中，配制成一系列不同浓度的探针溶液。分别移取100μL不同浓度的-17份探针溶液滴加于100μL 10μmol·L 的dsDNA溶液中，使探针溶液最终浓度为0，1，10，-1
20，50，100，200μmol·L 。在室温下，用Molecular Devicws Model Spectramax M5e型酶标仪在440nm波长处激发，检测波长范围500nm～800nm。实验结果如图3所示：在dsDNA能够使探针分子产生荧光，且随着探针分子浓度的增加，荧光强度先增加后进入平缓，说明探针与dsDNA结合趋近于饱和，表明本发明可以无需大量探针即可有效检测水介质中的dsDNA。
20，50，100，200μmol·L 。在室温下，用Molecular Devicws Model Spectramax M5e型酶标仪在440nm波长处激发，检测波长范围500nm～800nm。实验结果如图3所示：在dsDNA能够使探针分子产生荧光，且随着探针分子浓度的增加，荧光强度先增加后进入平缓，说明探针与dsDNA结合趋近于饱和，表明本发明可以无需大量探针即可有效检测水介质中的dsDNA。
[0074] (2)基于[Ru(bpy)2(dppz)]2+探针检测ssDNA分子
[0075] 称取适量所合成的Ru配合物探针，溶解于5mmol·L-1Tris，50mmol·L-1NaCl，pH -17.4缓冲溶液中，配制成40μmol·L 浓度的探针溶液。a、移取100μL探针溶液分别滴加-3 -2 -1
于浓度分别为0，1×10 ，1×10 ，0.1，1，5，10，25，50，100μmol·L 待测的DNA3溶液中。
在室温下，用Molecular Devicws Model Spectramax M5e型酶标仪在440nm波长处激发，检测波长范围500nm～800nm。实验结果如图4所示：在无ssDNA目标物存在时，无荧光产生；随着ssDNA浓度的增加，荧光强度不断增强，表明此探针可有效检测水介质中的ssDNA。
-1
b、移取100μL探针溶液分别滴加于100μL 10μmol·L 的DNA1-DNA6样品溶液中，同样条件下进行荧光测试，实验结果如图5所示：6种单链DNA与探针分子作用后均产生荧光，表明此探针可以普遍应用于各类单链DNA的检测，其中DNA4是含有巯基修饰的DNA。
于浓度分别为0，1×10 ，1×10 ，0.1，1，5，10，25，50，100μmol·L 待测的DNA3溶液中。
在室温下，用Molecular Devicws Model Spectramax M5e型酶标仪在440nm波长处激发，检测波长范围500nm～800nm。实验结果如图4所示：在无ssDNA目标物存在时，无荧光产生；随着ssDNA浓度的增加，荧光强度不断增强，表明此探针可有效检测水介质中的ssDNA。
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b、移取100μL探针溶液分别滴加于100μL 10μmol·L 的DNA1-DNA6样品溶液中，同样条件下进行荧光测试，实验结果如图5所示：6种单链DNA与探针分子作用后均产生荧光，表明此探针可以普遍应用于各类单链DNA的检测，其中DNA4是含有巯基修饰的DNA。
[0076] (3)[Ru(bpy)2(dppz)]2+探针与ssDNA作用的电化学表征
[0077] 在电化学修饰电极中，采用5端用巯基标记的DNA4修饰在金电极(2mm直径，上海辰华)上，并用巯基乙醇保护电极裸露部分并使DNA4保持直立结构，这样可以很好2+
的避免电极与[Ru(bpy)2dppz] 探针存在的物理吸附。将处理干净的金电极浸没于分-1 -1 -1
别含有1μmol L DNA4，100mmol·L 草酸盐/100mmol·L 磷酸盐缓冲溶液(pH 5.5)-1 -1
和1mmol·L TCEP的混合溶液中10h，接着再浸没在1mmol·L 巯基乙醇溶液中2h，清洗后得到组装好DNA4的金电极。将制备好的DNA4组装电极分别放置于空白溶液中和-1 2+
50μmol·L 的[Ru(bpy)2dppz] 溶液中进行电化学(循环伏安法CV、计时电量法CC)扫-1
描(扫速均为50mV·s )，得到对应的CV/CC电信号(CV见图6，CC见图7)。从图6中可以
2+
看到[Ru(bpy)2dppz] 与ssDNA结合后电位峰在-0.17V，电流值明显加大。从图7可以看
2+
出在加入[Ru(bpy)2dppz] 探针溶液后，电荷密度明显增大，电荷传递加快，表面该探针已与ssDNA结合。
的避免电极与[Ru(bpy)2dppz] 探针存在的物理吸附。将处理干净的金电极浸没于分-1 -1 -1
别含有1μmol L DNA4，100mmol·L 草酸盐/100mmol·L 磷酸盐缓冲溶液(pH 5.5)-1 -1
和1mmol·L TCEP的混合溶液中10h，接着再浸没在1mmol·L 巯基乙醇溶液中2h，清洗后得到组装好DNA4的金电极。将制备好的DNA4组装电极分别放置于空白溶液中和-1 2+
50μmol·L 的[Ru(bpy)2dppz] 溶液中进行电化学(循环伏安法CV、计时电量法CC)扫-1
描(扫速均为50mV·s )，得到对应的CV/CC电信号(CV见图6，CC见图7)。从图6中可以
2+
看到[Ru(bpy)2dppz] 与ssDNA结合后电位峰在-0.17V，电流值明显加大。从图7可以看
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出在加入[Ru(bpy)2dppz] 探针溶液后，电荷密度明显增大，电荷传递加快，表面该探针已与ssDNA结合。
[0078] 本发明提出了一种基于Ru配合物荧光分子探针检测单链和双链DNA的方法。通过2+
合成具有良好水溶性的[Ru(bpy)2(dppz)] 探针，利用其在水溶液中荧光猝灭，而在ssDNA或dsDNA存在下，产生明显荧光现象来检测水介质中的ssDNA和dsDNA，本发明所涉及的检测体系中不含昂贵的荧光标记探针，操作简单，这为同时检测ssDNA和dsDNA的应用上奠定了一定的基础因而，在制备和检测ssDNA和dsDNA的探针上具有重要的实际应用价值和潜在的应用前景。
合成具有良好水溶性的[Ru(bpy)2(dppz)] 探针，利用其在水溶液中荧光猝灭，而在ssDNA或dsDNA存在下，产生明显荧光现象来检测水介质中的ssDNA和dsDNA，本发明所涉及的检测体系中不含昂贵的荧光标记探针，操作简单，这为同时检测ssDNA和dsDNA的应用上奠定了一定的基础因而，在制备和检测ssDNA和dsDNA的探针上具有重要的实际应用价值和潜在的应用前景。